水稻抗白叶枯病基因Xa21转基因水稻及其杂交稻研究

用基因枪转基因技术将高抗白叶枯病的Xa21基因导入中国三系杂交稻恢复系(明恢63)和保持系(皖B)中，获得转基因水稻系，其中4个株系只含有Xa21基因，不含选择标记潮霉素抗性基因hph。筛选抗白叶枯病转基因纯合系，在田间种植6代，用PCR检测证明，Xa21基因能稳定遗传表达。用转基因水稻配制两系杂交稻，杂交组合F1含有Xa21基因     

三个中籼稻骨干恢复系对白叶枯病和褐飞虱抗性改良效果的评价

利用分子标记辅助选择和田间鉴定选择相结合的方法,将抗白叶枯病基因Xa23和抗褐飞虱基因Bph18(t)导入明恢86、蜀恢527和浙恢7954等3个骨干中籼恢复系,获得带有Xa23抗性基因纯合的改良恢复系明恢86-Xa23、蜀恢527-Xa23、浙恢7954-Xa23和携有抗褐飞虱Bph18(t)基因的蜀恢527-Bph18(t)、浙恢7954-Bph18(t),并从蜀恢527/IRBB23 F₁和浙恢7954/IR65482 F₁复交后代中选育出的带有Xa23和Bph18(t)的双基因聚合系浙蜀-Xa23-Bph18(t)。明恢86-Xa23、蜀恢527-Xa23、浙恢7954-Xa23和浙蜀-Xa23-Bph18(t)对中国和菲律宾的17个白叶枯病菌均表现高抗,蜀恢527-Bph18(t)、浙恢7954-Bph18(t)和浙蜀-Xa23-Bph18(t)对褐飞虱的抗性也达到中抗以上水平。抗性改良恢复系及其与不育系II-32A、沪旱11A的测交种在不接种白叶枯病菌条件下的产量和结实率与原来的恢复系及相应杂交种相仿,但在接种条件下带有Xa23基因的恢复系及测交种的结实率和产量明显优于原来的恢复系及相应杂交种。研究表明,抗性基因Xa23在不同恢复系背景下的抗性表达完全,对恢复系白叶枯病改良的效果明显,而抗性基因Bph18(t)对褐飞虱的改良效果与遗传背景有关。对分子标记回交和复交改良恢复系的抗病虫性进行了讨论。     

转Xa21基因杂交水稻选育和评价

通过基因枪转基因方法和双质粒共转化体系将Xa21基因转入优良恢复系明恢63,得到转基因系M12和M22,并进一步做田间试验、新品种选育和食用安全性评价。结果显示:M12和M22对中国的所有白叶枯病小种都表现出高度抗性,但与原受体品种明恢63相比,农艺性状上有许多变异,主要表现在:结实率、千粒重等农艺性状变差,与珍汕97A的配合力显著降低;但与温敏不育系(X07S、056S)配组的F1有较好的田间表现。通过多代回交和分子标记辅助选择,成功地将Xa21基因从M12株系转到保持系80-4B和不育系80-4A中,得到抗白叶枯病的皖21B和皖21A。并利用皖21A不育系选育出优良杂交组合抗优97(皖21A×R-18),该组合在两年区域试验和一年生产试验中产量表现突出,米质优良。对不同世代和不同遗传背景的转基因品系进行白叶枯病鉴定和Southern分析表明:Xa21基因都能稳定遗传和正常表达,连续16代的种植并没使其白叶枯病的抗性减弱或丧失,而且不论Xa21基因是纯合的还是杂合的都有相同的抗性表现。对大鼠和小鼠的饲喂试验表明:转基因大米实质上等同于非转基因大米,是安全无害的。     

分子标记辅助选育水稻抗白叶枯病和稻瘟病多基因聚合恢复系

利用分子标记辅助选择和田间鉴定选择相结合的方法, 将三黄占2号的抗稻瘟病主基因Pi-GD-1(t)、Pi-GD-2(t)和主效QTL GLP8-6(t) (分别简称G1、G2和G8)及抗白叶枯病基因Xa23导入到明恢86、蜀恢527和浙恢7954等3个骨干中籼恢复系, 通过复交进行基因聚合, 获得5个带有抗稻瘟病兼抗白叶枯病的双基因或多基因聚合系明恢86-G1-G2-Xa23、蜀恢527-G2-Xa23、明浙-G2-G8-Xa23-1、明浙-G2-G8-Xa23-2和明浙-G1-G2-G8-Xa23。以上5个抗病基因聚合改良系对稻瘟病的抗谱与抗源品种相仿或更宽, 改良系和与不育系II-32A配制的测交种对白叶枯病菌的抗谱与供体亲本IRBB23一致, 测交种在不接种白叶枯病菌条件下的产量和结实率与原来的恢复系及相应杂交种相仿, 但在接种条件下带有Xa23基因的恢复系及测交种的结实率、千粒重和产量明显优于原来的恢复系及相应杂交种。研究表明, 抗稻瘟病基因和抗白叶枯基因Xa23在不同恢复系背景下的抗性表达完全, 对恢复系稻瘟病以及白叶枯病改良的效果明显。对分子标记复交改良恢复系的抗病性进行了讨论。     

利用分子标记辅助选择改良93-11对白叶枯病和螟虫抗性

93-11是我国生产上应用面积较大的两系恢复系,同时又是红莲型三系杂交水稻恢复系之一,其组配的超级杂交稻两优培九和三系杂交稻红莲优6号,具有优质高产等特性。为了进一步提高其对白叶枯病的抗性、同时增加其对水稻鳞翅目害虫(如稻纵卷叶螟、二化螟和三化螟等)抗性,利用常规回交育种方法和结合分子标记辅助选择将Xa21基因和Bt基因同时导入93-11中,在BC3F,家系中筛选到8个家系含纯合的Xa21基因和Bt基因,其中有两个家系与93-11比较其遗传背景的回复率很高,达到90．59％。在正常的田间条件下,改良的93-11(Bt)、93-11(Xa21)和93-11(Bt／Xa21)与原始的93-11表现出相似的农艺性状,且带有Xa21基因的株系及其杂交种均对白叶枯病显示出很高的抗性。在自然诱发螟虫条件下,带有Bt基因的株系及其杂交种没有受到螟虫危害。这一结果表明,通过分子标记辅助选择将多个基因同时导入某一改良亲本,结合常规育种方法选择,具有快速、良好遗传改良效果。这一遗传改良材料在农艺性状和配合力等方面基本保持了93-11及其杂交组合的主要特征特性,拓宽和增强了其对白叶枯病的抗谱和抗病能力,增加了93-11作为恢复系所配杂交水稻的抗螟虫特性,具有较好的应用前景。     

水稻白叶枯病抗性基因Xa4、Xa23聚合及分子标记检测

本研究以含Xa23的水稻品种WBB1为亲本,分别与含Xa4的恢复系杂交,对后代进行白叶枯病菌系接种及SSR分子标记检测,进行Xa23和Xa4的聚合及Xa23显性程度观察,研究结果如下:1.含Xa23亲本与不同遗传背景品种杂交,F1代经鉴别菌系C1～C7及毒力强的P6接种,表现抗谱广.2.利用SSR标记RM206进行Xa23和Xa4杂交聚合的检测,RM206与Xa23紧密连锁且共分离,在亲本间存在多态性,在后代选择中准确性好.桂99×WBB1、R402×WBB1和IR30×WBB1的F2群体中的准确率分别达到了97%、96%和98%.这说明利用SSR标记RM206对白叶枯病抗性基因Xa23进行分子辅助选择育种是切实可行的.3.Xa23与Xa4聚合体比含Xa4的恢复系对白叶枯病的抗性有很大的提高,经C1～C7菌系接种,病斑普遍在1 cm以下,抗性水平达到高抗水平.     

分子标记辅助选择Xa23基因培育杂交稻抗白叶枯病恢复系

水稻抗白叶枯病新基因Xa23抗谱广、抗性强,被定位在第11染色体上。以携带抗白叶枯病基因Xa23的抗病品系CBB23为抗源,以优良杂交稻亲本9311和1826为受体材料,采用杂交和复交,在分离群体中利用与Xa23紧密连锁的EST标记C189进行分子标记辅助选择,通过苗期分子标记检测和成株期农艺性状选择,获得160份目标基因纯合且农艺性状稳定的株系。使用鉴别菌系P6,采用人工剪叶接种法,在苗期和孕穗期对21份重点株系进行了抗性鉴定,所有株系在苗期和孕穗期都表现抗病。同时对3个不育系与其中5个株系配制的15个杂交组合进行了抗性鉴定,所有组合在苗期表现抗或中抗,在孕穗期表现抗。对其中6个杂交组合进行了品比试验,2个组合产量略低于对照两优培九,其余4个组合的产量均高于两优培九,用于测配的3个株系C6201、C6271和C6351有望作为杂交稻恢复系在生产中应用。研究表明在育种进程中利用与Xa23基因紧密连锁的分子标记C189开展抗白叶枯病分子标记辅助育种是一种有效的途径。     

Error-prone PCR获得EPSP酶突变基因提高水稻的草甘膦抗性

将通过Error-prone PCR方法获得的表达水稻EPSP酶突变基因epsp102和未经修饰的水稻epsp基因分别导入籼稻恢复系明恢86,获得转化克隆84个和109个。对T1、T2代转基因水稻三叶期和分蘖期喷施草甘膦,各选出4个对草甘膦高抗性的T3代材料,进行分子鉴定。对其中的3个株系进行农艺性状考察,并各选1个株系作为父本与其他优良恢复系进行杂交,进一步考察epsp和epsp102基因在不同遗传背景下的抗性和农艺性状表现。Southern结果显示：epsp的整合拷贝数为2～3拷贝,epsp102拷贝数为1-2拷贝。萌发种子、三叶期及分蘖期对草甘膦抗性检测显示：转基因萌发种子对草甘膦的抗性提高15倍;三叶期对草甘膦的抗性提高3-4倍。分蘖期剂量效应检测结果显示：非转基因对照在施0．1倍以上的致死剂量农达时,植株显著失水,而转基因株系水分生理正常。两地两季的农艺性状考察显示：与对照相比转基因株系的穗数明显增多,转基因株系ep-3和ep102-20结实率和单株重与对照没有显著差异;以ep-3和ep102-20作父本,与4个恢复系杂交的F：代对草甘膦的抗性没有降低,两个组合的结实率显著增加,SK／ep-3组合结实率显著下降,其余组合的结实率与对照持平。     

分子标记辅助培育双抗稻瘟病和白叶枯病杂交稻恢复系

本研究利用常规回交育种结合分子标记辅助选择技术,将来自C750的抗白叶枯病基因Xa23和抗稻瘟病基因pi9聚合到感病杂交稻恢复系闽恢3139中.最后在回交后代中获得了4个双抗稻瘟病和白叶枯病改良系ZR21-sk1、ZR21-sk2、ZR21-sk3和ZR21-sk4,且其遗传背景恢复率达96%以上.用来自福建省具有代表性的24个稻瘟病菌株和白叶枯病广致病型菌系P6对改良株系进行人工接菌鉴定,结果表明,聚合了Xa23和pi9基因的改良系同时抗稻瘟病和白叶枯病,且抗性与抗谱与供体亲本C750相似.农艺性状分析显示,改良株系所配组合基本保持闽恢3139的农艺性状和配合力,可直接应用于生产或作抗性育种亲本.     

分子标记辅助选择Xa23基因改良杂交稻亲本的白叶枯病抗性

白叶枯病是世界上影响水稻产量最严重的病害之一,本研究利用携有目前已知的、抗谱最广和抗性最强的显性基因Xa23的水稻材料CBB23作为基因供体,以感白叶枯病的杂交水稻的3个骨干亲本培矮64S、明恢86和C418作为受体,采用杂交和复交,在分离群体中利用与Xa23紧密连锁的SSR标记RM206进行分子标记辅助选择。通过分子标记检测、田间抗性鉴定和农艺性状选择,BC3F3株系中获得Xa23基因纯合且农艺性状稳定的培矮64S、明恢86和C418。获得的恢复系或不育系及配制的杂交组合在田间对我国7个以及菲律宾P1和P6白叶枯病生理小种都具有抗性。     

Breeding of transgenic rice restorer line for multiple resistance against bacterial blight, striped stem borer and herbicide

In this paper, we described the breeding of transgenic rice restorer line for multiple resistance against bacterial blight, striped stem borer (SSB) and herbicide by conventional crossing of two transgenic parental lines transformed independently with different genes. Two stable transgenic rice lines used as donor parents were developed, one was Zhongguo91 which contained cry1Ab gene (for insect resistance) and bar gene (for tolerance of herbicide), and the other was Yujing6 which contained Xa21 gene (resistance to bacterial blight). The elite restorer line Hui773 was used as recipient and crossed with the two stable transgenic rice lines. Then five successive backcrosses were made using Hui773 as recurrent parent. Two rice elite restorers, T773-1 expressing cry1Ab and bar genes and T773-2 expressing Xa21 gene, were obtained, which were confirmed by PCR analysis and testing selectable marker genes in the hybrid progenies. The cross was made between T773-1 and T773-2 to select stable restorer line carrying Xa21, cry1Ab and bar genes. Finally, we obtained transgenic restorer line T773 with good agronomic traits and obvious multiple resistance to Xanthomonas oryzae pv. oryzae, striped stem borer (Chilo suppressalis) and herbicide. The hybrid F₁ generation produced from the cross between transgenic restorer line T773 and a corresponding male sterile line Zaohua2A maintained obvious resistance to rice bacterial blight, rice leaffolder and striped stem borer, and showed significant heterosis. Our results indicate that it is feasible to develop transgenic hybrid rice cultivar through breeding transgenic restorer lines.     

运用分子标记辅助选择技术改良9311白叶枯病抗性的研究

以9311为轮回亲本，以IRBB21为抗白叶枯病供体亲本，通过杂交和三次回交以及两次自交，结合农艺性状的选择，建立起具44个株系的BC3F3群体。分别用连锁标记pTA248和基因内STS标记MXA21对抗性基因Xa21进行前景选择。用均匀分布在水稻全基因组的248个SSR标记，进行两亲本之间的多态性分析，获得76个具多态性的SSR标记，用于背景选择。结果选到基因型背景回复到轮回亲本的73．68％——88．16％，且Xa21基因纯合的株系4个，分别为M071、M082、M086和M087。以Xa21的鉴别菌系菲律宾6号小种PX099接种鉴定表明，9311为感(S)，IRBB21为抗(R)，中选株系M071和M082的抗性与IRBB21相同，为抗(R)级，M086和：M087抗性略低于IRBB21，为抗到中抗(R／MR)，这两个株系内单株之间抗性有差异。农艺性状考察结果显示，中选株系与轮回亲本9311相似。以中选株系M086与培矮64S配制的Fl和原组合两优培九(培矮64S／9311)进行比较，对白叶枯病的抗性有了明显提高，综合农艺性状相似。论文就白叶枯病抗性基因的综合利用以及育种方法进行了讨论。     

水稻转录因子WRKY68在Xa21介导的抗白叶枯病反应中发挥正调控作用

白叶枯病是一种严重影响水稻产量的细菌性病害。Xa21是第一个克隆的抗白叶枯病基因,具有广谱抗性,在水稻抗病育种中被广泛应用。转录因子的鉴定对解析Xa21介导的水稻抗白叶枯病分子机制具有重要意义。本研究构建了Xa21背景下的WRKY68-RNAi转基因水稻。与受体材料4021相比,转基因水稻中WRKY68蛋白质丰度下调,接种白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)后抗病性下降,证明WRKY68基因在Xa21介导的抗白叶枯病反应中发挥正调控作用。此外,转基因受体材料4021和感病对照TP309接种后不同时期和部位叶片中WRKY68的蛋白质丰度没有显著差异,表明WRKY68蛋白质的表达不受抗病基因Xa21和病原物Xoo诱导,推测其功能主要是调控下游基因的表达。WRKY68-RNAi转基因水稻接种后, PR1A、PR5、PR10A、PR-pha和PAL1等病程相关蛋白质表达丰度发生变化,表明相关基因可能在WRKY68基因的调控下参与下游抗病反应。     

籼型杂交水稻农艺性状的配合力研究

如何有效利用杂种优势已成为水稻增产的关键。本研究按照NCII遗传交配设计,将三系野败型杂交水稻的恢复系和微核心种质构成的115份优异籼稻品种,分别与4个两系不育系及1个三系不育系测交,分析各农艺性状配合力、遗传力及相互关系。结果表明,除单株有效穗数、主穗实粒数外,其他农艺性状一般配合力差异均达到极显著水平;除单株有效穗数外,其他各农艺性状特殊配合力差异也均达到极显著水平。同一组合的不同性状、同一亲本的不同组合所表现出的特殊配合力效应都有所不同,表明亲本的一般配合力水平与特殊配合力间没有固定的联系。在育种实践中,选取一般配合力高的亲本,同时兼具较高特殊配合力是获取高产杂交稻组合的关键。     

利用Bt基因和Xa21基因转化获得抗螟虫、白叶枯病的转基因水稻

利用水稻的愈伤组织作受体, 采用PIG基因枪法, 首先成功地将Bt基因[cryIA(b)]连同抗除草剂bar基因导入栽培水稻品种中国91, 选育出纯合稳定的株系T91系. 然后将T91系与黄淮区主栽品种豫粳6号杂交, 并辅以标记基因选择, 选育出纯合稳定、综合性状优良的转Bt基因株系C48. 利用农杆菌介导的转化系统将Xa21基因转入C48, 根据标记     

水稻抗白叶枯病基因的聚合育种

白叶枯病是严重危害水稻生产的重要病害之一,利用聚合多个抗性基因的水稻品种是控制该病害的有效途径。本研究以携带Xa4、xa5、xa13、Xa214个抗白叶枯病基因的IRBB60与8个水稻新品系,组配8个杂交组合.应用分子标记辅助选择技术从F2和F3群体中共获得216个携带4个抗白叶枯病基因的纯合体。用华南地区的5个白叶枯病病原菌小种进行田间接种的试验表明,4个抗性基因聚合系的抗性水平高于只带1个抗性基因的近等基因系。这些聚合系可用作华南地区高抗白叶枯病水稻品种育种的亲本材料。     

连续回交对消除农杆菌介导转化引起水稻体细胞变异的影响

农杆菌介导的转化引起许多体细胞变异, 影响了转基因植物的农艺性状。因此, 转基因作物的培育需要大量的T₀代再生植株。在本研究中, 我们将转基因水稻株系与原始品种连续回交, 然后评价其回交后代的表现, 消除体细胞变异, 恢复转基因亲本的农艺性状。回交的供体亲本是3个转基因水稻株系, 分别带有来自于苏云金芽胞杆菌(Bt)的抗虫基因。与原始品种连续回交至BC₃F₁代, 每代BC_nF₁单株再自交两代, 同时对各个世代进行抗虫性选择。通过发芽试验获得转基因纯合的BC_nF₃株系, 在室内抗性试验中, 所有的BC_nF₃纯合株系都能杀死100%的幼虫。在田间试验中, 这些株系的单株产量明显高于供体亲本, 大部分农艺性状与原品种没有显著的差异。这些结果说明连续回交能够在很大程度上恢复转基因水稻株系的农艺性状, 从而减少转基因育种过程中所需的工作量。