玉米大斑病菌StCHS6的基因结构及表达规律分析

为了阐明玉米大斑病菌几丁质合成酶基因StCHS6在病菌生长发育及致病过程中的作用,克隆并解析了该基因及其编码蛋白的结构特征,明确了该基因在病菌生长发育过程中的表达模式。在玉米大斑病菌1号小种菌株01-23中克隆StCHS6,利用生物信息学手段分析该基因的结构特征,并利用已有的病菌重要发育阶段的RNA-Seq数据库信息,明确该基因的表达模式。结果发现,StCHS6位于病菌基因组scaffold_1:2066293-2069876(-)的位置,基因全长为3 584 bp,含有4个内含子和5个外显子;CDS序列大小为2 703 bp,编码900个氨基酸,脂肪指数为81.86,亲水性平均值为-0.178,等电点(PI)为8.36,不稳定指数为36.94,属于碱性稳定型蛋白;保守结构域分析表明,StCHS6蛋白含有几丁质合成酶催化结构域Chitin_synth_1和多个跨膜结构域;亚细胞定位分析推测该蛋白定位于细胞膜上;RNA-Seq数据分析表明,StCHS6在菌丝、分生孢子、芽管、附着胞和侵入钉5个发育时期均有表达,但其表达量有所差异。以芽管时期的表达量为1,菌丝、分生孢子、附着胞和侵入钉时期的表达量分别为芽管时期的3.80,4.97,3.40,2.60倍。为阐明玉米大斑病菌StCHS6的基因结构特征、表达模式及功能奠定了基础。     

玉米大斑病菌StRTG2基因结构、原核表达及表达模式分析

为明确玉米大斑病菌StRTG2基因功能以及其在病菌不同发育时期的表达模式。利用酵母ScRTG2基因编码的氨基酸序列进行BlastP,在玉米大斑病菌中得到了其同源基因序列,将其命名为StRTG2;分别以玉米大斑病菌野生型01-23的全基因组DNA及cDNA为模板,对该基因进行克隆;利用生物信息学技术对该基因编码的蛋白StRtg2进行理化性质分析、结构域预测、亚细胞定位预测;利用MEGA 7.0对Rtg2进行进化关系分析;扩增目的片段的ORF序列,构建该基因原核表达载体,通过转化大肠杆菌BL21后,使用IPTG进行诱导表达;最后利用RNA-Seq数据库分析StRTG2基因在玉米大斑病菌关键生长发育时期(菌丝、分生孢子、芽管、附着胞和侵入钉)的表达模式。主要研究结果如下:克隆了该基因发现其长度为1 695 bp,不含有内含子;该基因编码的蛋白由564个氨基酸组成,理论等电点值(pI)是6.96,具有典型的Ppx-Gppa保守结构域,亚细胞定位预测结果显示,该蛋白在细胞各部位均有分布,分布于细胞质中的可能性最大;对该蛋白进行进化关系分析表明,玉米大斑病菌StRtg2蛋白与番茄匍柄霉菌中同源蛋白的同源性最高,其次是酿酒酵母;原核表达该基因,SDS-PAGE胶显示该蛋白的大小约为62 ku,与预期大小相符;表达模式分析发现,该基因在病菌发育的5个时期均有表达,其中芽管和侵入钉时期表达量显著降低。为进一步解析StRTG2基因的功能研究奠定基础。     

玉米ZmCIPK20基因克隆及表达分析

CIPK蛋白激酶是植物非生物胁迫信号传导途径中的重要元件。为克隆玉米CIPK蛋白激酶基因ZmCIPK20全长c DNA序列,并分析其在盐胁迫下的表达模式,采用RT-PCR技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的序列进行分析,采用荧光定量PCR方法研究ZmCIPK20在盐胁迫下的表达。本研究从玉米中克隆了一个编码CIPK蛋白激酶基因ZmCIPK20,该基因c DNA全长1 800 bp,5'-非编码区长203 bp,3'-非编码区长202 bp,编码区长1 395 bp,编码464个氨基酸,预测分子量为50.993 kD,等电点为8.55。推测的氨基酸序列中含有1个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域S_TKc和1个NAF结构域。进化树分析发现,ZmCIPK20和SbCIPK分为一个分支。荧光定量PCR检测表明,ZmCIPK20基因受盐胁迫诱导表达,在根中下调表达,在叶中上调表达,说明玉米ZmCIPK20基因可能参与玉米对盐胁迫的应答,为揭示该基因的生物学功能提供依据。     

杨梅叶枯病菌（Phomopsis myricina）生物学特性研究

杨梅叶枯病菌（Phomopsis myricina）生物学特性研究结果表明：该菌菌丝生长与分生孢子器形成最佳培养基为PSA+1‰酵母膏和PDA+1‰酵母膏。病菌能有效地利用多种碳源和氮源，但谷氨酸和精氨酸对病菌生长发育有抑制作用。菌丝生长和分生孢子器形成最适温度为20~25℃；最适pH值分别为6~8和7~9。紫外光处理有利于产孢。分生孢子萌发最适温度为20~30℃；最适pH值7~9；在相对湿度98%以上和水滴中孢子萌发率最高；不同营养对孢子萌发无显著影响。     

龙胆草斑枯病组织病理学研究初报

取培养至开花期龙胆草植株,接种龙胆草斑枯病菌,然后置于温室内保温保湿培养,每隔一定时间取样、固定、制片,镜检观察病组织及病原菌形态结构变化。结果表明：病菌分生孢子萌发后产生芽管从气孔侵入,完成侵入需要12h～48h,大约到10d显示症状,16d分生孢子器成熟;病菌侵染寄主引起症状后,菌丝多从叶背面跨过叶肉细胞,在叶正面薄壁细间集结,最后形成分生孢子器,分生孢子器产生于表皮下薄壁细胞之间,具有一定随机性。     

玉米分子伴侣基因ZmBiP2在逆境下的功能分析

BiP(binding protein)基因编码的蛋白是一类重要的分子伴侣,在动植物的逆境胁迫响应过程中具有重要的作用。从玉米抗旱自交系旱21中分离到分子伴侣基因ZmBiP2,序列分析结果显示,该基因开放阅读框长1989 bp,编码含663个氨基酸的蛋白,包含热激蛋白家族特有的TVIGIDLGTTYSC保守结构域和ATP结合位点。实时荧光定量PCR结果显示,Zm Bi P2基因在玉米的雄穗和子房中表达量最高;在盐、甘露醇胁迫条件下,该基因在植株的地上部分上调表达。过量表达Zm Bi P2基因的拟南芥转基因株系在种子萌发时期对盐和甘露醇胁迫的耐受能力减弱,在苗期对盐胁迫敏感。推测在植物响应非生物胁迫的过程中,过量表达的ZmBiP2蛋白可能发挥负调节蛋白的功能。     

河北省又取得一批农药植保类科研成果

<正>(接上期)5.苹果树腐烂病侵染规律及防控关键技术单位名称:河北农业大学评价单位名称:河北省科技成果转化服务中心该项目明确了苹果腐烂病菌在冬季田间病斑上可以产生和释放分生孢子,分生孢子可在0℃~10℃萌发并在冬季侵染。发现新鲜剪锯口是腐烂病菌侵染的最主要部位;当修剪工具带菌时,冬季修剪比春季修剪更容易传播腐     

玉米灰斑病菌致病过程的寄主反应研究

通过对玉米灰斑病菌侵染后的显症过程的系统观察,可在组织水平上说明该病菌与寄主互作反应存在分化或多样性：玉米灰斑病菌不同菌株侵染后显症过程表现出明显的差异;玉米灰斑病菌在侵袭力上存在多样性,菌株间对同一种品种的致病性表现多样化,或者同一菌株对不同品种侵染引起的寄主反应表现为多样性;病斑反应型的分化,玉米灰斑病菌侵染玉米品种或自交系后,主要有7种病斑反应类型,即RH型(长矩形具褪绿晕圈病斑)、RN型(长矩形无褪绿晕圈病斑)、IRH型(不规则形具褪绿晕圈病斑)、IRN型(不规则形无褪绿晕圈病斑)、SH型(斑点形具褪绿晕圈病斑)、RI型(长矩形与不规则形混合病斑)和RS型(长矩形与斑点形混合病斑),若发病严重,病斑连成片,而且这些反应类型出现的频率也不同。     

环境条件对棉花轮纹斑病菌分生孢子萌发的影响

 为了明确影响棉花轮纹斑病发生和流行的因素,对棉花轮纹斑病菌分生孢子萌发的营养条件、光照、温度、湿度等条件进行了研究。结果表明：病菌分生孢子在不同营养条件下萌发率存在显著差异,在SDAY培养液中萌发速度快,萌发率最高;光照对病原分生孢子萌发有显著影响,黑暗处理更有利于分生孢子萌发;分生孢子萌发对温湿度的要求较高,孢子萌发的适宜温度为30℃;空气相对湿度越高分生孢子萌发率越高,在水滴中萌发最好;不同棉花品种叶片研磨液对分生孢子的萌发有显著影响,宁4-14、垦62的叶片研磨液更利于分生孢子萌发。     

磷脂酶C特异性抑制剂U-73122对玉米大斑病菌分生孢子萌发及毒素活性的影响

磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)通过降解细胞膜上的磷脂分子产生IP3和DAG两个第二信使分子,分别激活下游的Ca2+途径和蛋白激酶C。研究表明,PLC与植物病原真菌的致病及发育过程有关。利用PLC特异性抑制剂U-73122初步研究了玉米大斑病菌PLC的功能。结果显示,U-73122对玉米大斑病菌菌丝生长及分生孢子的萌发均具有明显的抑制作用,且抑制率随抑制剂浓度升高而增强;并且可引起芽管的缩短和不规则膨大。此外,U-73122也可以导致病菌粗毒素的生物学活性明显降低。由此说明PLC可以通过影响菌丝及芽管的极性生长,而调控玉米大斑病菌的菌丝及分生孢子发育;同时参与病菌的毒素合成。     

谷子丙酮酸磷酸双激酶基因(SiPPDK1)对非生物逆境的响应

通过序列比对在谷子基因组中鉴定出一个PPDK基因,命名为Si PPDK1。为揭示该基因对逆境胁迫的响应,本研究通过对Si PPDK1的基因结构、蛋白特征、功能、启动子区域顺势元件、亚细胞定位、进化特征等进行了系统的分析和预测。荧光实时定量PCR检测了该基因在苗期不同逆境、关键生育期干旱以及不同光照条件下的表达。结果表明该基因位于谷子9号染色体,含有17个内含子,有2个可变剪切。功能域分析和多序列比对发现Si PPDK1蛋白具有非常保守的序列结构,并且与其它植物PPDK蛋白非常相似。q RT-PCR表达谱分析表明Si PPDK1基因在苗期被PEG、ABA、Na Cl和低温胁迫强烈诱导。进一步研究表明Si PPDK1基因在拔节、抽穗和灌浆期干旱和不同光照强度条件下均参与了对干旱和光照的胁迫响应,推测该基因参与了谷子对非生物逆境的应答,尤其在抽穗期干旱和光照胁迫应答中起重要作用。     

分离和鉴定油菜D型MAP激酶基因BnMPK9

为了应对不良的外界环境,植物形成了一整套复杂的信号网络体系以适应变化的外界环境。其中MAPK级联是其中一个重要而保守的信号传导系统。采用RT-PCR策略,从干旱处理的油菜cDNA中克隆出全长的细胞分裂原激活的蛋白激酶基因。该基因命名为BnMPK9(GenBank登录号为AY737714),包含一个蛋白激酶区和一个保守的CD区。该基因与拟南芥AtMPK9高度同源,其激酶的磷酸化位点为TDY,同为D型MAPK亚家族基因。Southern杂交结果表明该基因在油菜基因组中拷贝数不少于2个。Northern杂交结果显示该基因能在不同的植物组织中表达。其表达受到甘露醇、紫外线和双氧水诱导上调表达,但低温和水杨酸处理后下调表达。实时RT-PCR分析表明甘露醇和双氧水能长时间诱导该基因高表达。在根中,甘露醇也能促进其上调表达。BnMPK9连接到pYES2.1酵母表达载体中转化酵母,发现增强了酵母对600 mmol L^–1甘露醇和0.2 mmol L^-1 tBuOOH的抗性。以上结果说明BnMPK9是MAPK基因家族中的一员,涉及真核生物细胞渗透和活性氧胁迫,并增强其抗性。     

棉属野生种旱地棉蛋白激酶基因GarCIPK8的克隆与功能分析

CIPK (calcineurin B-like calcium sensor interacting protein kinase)是植物钙感受器钙调磷酸酶B类似蛋白特定靶向的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。在前期的研究中, 我们将棉属野生种D亚组旱地棉(Gossypium aridum)盐胁迫前后RNA混合样品进行转录组测序, 发现一CIPK相关基因存在较高的转录丰度。盐胁迫下荧光定量PCR分析表明该基因在根部表现诱导上调表达, 推测该基因可能参与植物在高盐胁迫下的生理调控。利用电子克隆及RT-PCR方法从旱地棉中克隆了一个ORF全长为1350 bp的蛋白激酶基因GarCIPK8。序列分析表明该基因编码的蛋白含有449个氨基酸, 分子量为51.12 kD, 理论等电点为8.13, 其N端催化结构域包含一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶域, C端具有植物CIPK蛋白家族特有的24个氨基酸组成的NAF保守结构域; 与水稻OsCIPK8蛋白的相似度为73.95%。为进一步验证其功能, 利用组成型高效强启动子CaMV35S和拟南芥逆境胁迫启动子rd29A构建植物表达载体并转化烟草, 经PCR和RT-PCR分子检测, 证明GarCIPK8基因已经整合到烟草基因组中, 并正常表达。T₁代转基因植株耐盐性鉴定结果表明GarCIPK8基因对提高转基因植株的耐盐性有较明显的作用, PEG干旱模拟试验也证明GarCIPK8基因可增强植株的抗旱性。     

玉米光周期敏感类Hd6基因的克隆和实时定量表达分析

水稻Hd6基因在调节水稻光周期敏感中起重要作用。本研究以热带玉米自交系CML288为材料, 利用同源基因克隆法结合3¢RACE技术克隆了与水稻Hd6基因同源的玉米类Hd6基因。该基因序列中999 bp的开放阅读框可编码332个氨基酸。BLAST分析发现, 该基因与玉米中编码蛋白激酶CK2的一个基因高度同源, 所推测的氨基酸序列包含2个CK2活性区域, 1个N末端区域, 1个ATP结合位点和1个丝氨酸/ 苏氨酸蛋白质激酶活性位点,与玉米、小麦、水稻和拟南芥的CK2氨基酸序列也有较高的同源性。建立了SYBR GREEN法实时荧光定量RT-PCR表达分析系统, 研究了不同光周期处理下类Hd6基因在光周期敏感自交系CML288茎尖和叶片中的表达。结果发现, 该基因在茎尖和叶片中均有表达。在短日条件下, 该基因在6~8叶期茎尖中的表达量存在明显差异, 在光周期敏感的7叶期出现表达高峰, 在叶片中的表达量均低于茎尖。在长日条件下, 该基因在茎尖中6叶期表达量较低, 在光周期敏感的9叶期在叶片中高量表达。由此可推测, 该基因与玉米光周期敏感密切相关, 可能在光周期敏感调节过程中发挥一定的作用。     

含CBS结构域的小麦TaCDCP1基因的克隆及其表达分析

利用电子克隆和RT-PCR技术,在本实验室前期构建的非亲和互作的SSH文库基础上,从条锈菌侵染的小麦水原11叶片中首次分离出一个含CBS结构域蛋白的基因,暂命名为TaCDCP1(Triticum aestivum CBS domain containing protein 1)。TaCDCP1包含一个完整的654 bp的开放阅读框,编码217个氨基酸。推测该基因拟编码的蛋白具有2个CBS保守结构域,不含跨膜区且无信号肽,定位在叶绿体基质内;经过同源比对,小麦TaCDCP1氨基酸序列与大麦、水稻和玉米等的同源序列的相似性较高;该基因表达量在小麦叶中显著高于在根和茎中;在小麦与条锈菌的非亲和、亲和组合中,TaCDCP1基因均受到条锈菌诱导,分别在接种后18 h和96 h达到表达高峰,非亲和组合表达量在侵染前期(接种后18~48 h)高于亲和组合,而在侵染后期(接种后96~120 h)低于亲和组合;外源植物激素脱落酸诱导该基因上调表达,苄基腺嘌呤,乙烯,赤霉素,茉莉酸甲酯和水杨酸处理后其表达量在不同程度上受到抑制;TaCDCP1在低温和干旱条件下表达量上升,在机械伤害和高盐处理下表达量无明显差异。表明TaCDCP1可能通过脱落酸等信号途径参与小麦对条锈菌的防御反应,同时参与低温和干旱环境下的信号转导途径。这些结果对于明确CBS结构域的功能以及CBS结构域蛋白尤其是TaCDCP1在小麦与条锈菌互作中的作用奠定了基础。     

Forage quality of genetically diverse alfalfa germplasms at four phenological growth stages

Summary Forage quality of various alfalfa (Medicago sativa L.) cultivars has been determined under different environmental conditions, and numerous trials with alfalfa have documented an inverse relationship between forage quality and maturity. Little information is available, however, regarding the comparative forage quality of the germplasm sources from which most USA cultivars were developed. We compared forage quality of these germplasm sources at four phenological stages under disease- and insect-free conditions in a greenhouse. Germplasm sources (cultivars) tested were: Indian (Sirsa #9), African (African), Peruvian (Hairy Peruvian), Flemish (DuPuits), Turkistan (Lahontan), Chilean (Kansas Common), M. varia (Grimm), and Ladak (Ladak). Four harvests were taken and forage was separated into four phenological stages: vegetative, early bud (1–3 buds-per-stem), late bud (>3 buds-per-stem), and bloom. The germplasm source X phenological stage interaction was significant for crude protein (CP) and in vitro digestible dry matter (IVDDM) concentrations. M. varia showed the least decline in IVDDM and CP with increasing maturity. M. varia had higher IVDDM than did African and Indian at late bud and bloom stages. Indian and Flemish had higher CP than did Turkistan and Peruvian at late bud and bloom stages. Alfalfa germplasm sources differ in forage quality when comparisions are made within similar stages of phenological development.Joint contribution of the Dept. of Agronomy and USDA-ARS, Kansas Agricultural Experiment Station, Manhattan, KS 66506, USA. Contribution no. 90-475-J.     

两个谷子CIPK基因在非生物逆境胁迫下的表达分析

CIPK是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在植物响应逆境胁迫过程中发挥重要作用。本文利用生物信息学方法从谷子基因组中鉴定出2个CIPK基因, 命名为SiCIPK6和SiCIPK16。序列分析表明SiCIPK6基因组序列长1994 bp,编码451个氨基酸;SiCIPK16基因组序列长1885 bp,编码473个氨基酸,2个基因均无内含子和可变剪切。生物信息学分析显示这2个基因在蛋白质序列和结构上与其他物种CIPK基因一样非常保守。实时定量PCR分析表明SiCIPK6和SiCIPK16在ABA、低温、高温、干旱、高盐诱导下表达量均有所上调, SiCIPK6基因在ABA、干旱和盐处理时表达量上调幅度较大,而SiCIPK16基因在低温、干旱和高温处理时表达量上调幅度较大。半定量PCR检测结果表明SiCIPK6和SiCIPK16两个基因在拔节、孕穗、灌浆期时均有表达,在相应生育时期受到干旱胁迫时它们表达量均有所提高。推测SiCIPK6和SiCIPK16基因在谷子的干旱或其他逆境胁迫中起一定作用。     

基于生物絮团技术的养殖系统细菌群落结构研究进展

笔者介绍了有关生物絮团细菌群落结构的研究进展，重点阐述了生物絮团形成不同阶段的细菌群落结构组成和多样性研究；分析了环境条件，即不同碳源和碳氮比(C/N)对生物絮团养殖系统水体和养殖对象肠道细菌群落结构组成和多样性的影响；并总结了生物絮团微生物群落的部分作用，包括具备脱氮功能，以及抑制病原菌的生长及繁殖。最后对生物絮团技术的发展方向进行了展望。可考虑在养殖中后期通过逐渐降低碳源添加量，将异养型生物絮团系统逐步驯化为硝化型生物絮团系统，或将该技术与生物膜技术结合运用。     

藜麦GRF转录因子家族的鉴定及表达分析

生长调控因子(growth-regulatingfactor,GRF)是植物特有的一类转录因子,对植物的生长发育起重要的调控作用。藜麦是一种单体植物即可满足人体基本营养需求的食物,也是未来最具潜力的农作物之一。但是关于藜麦GRF基因家族的研究至今尚缺乏报道。因此,本研究利用生物信息学方法,对藜麦GRF基因进行全基因组鉴定,并对其理化性质、基因结构、保守结构域、系统发育关系及组织表达进行分析。结果表明,藜麦中共有18个GRF转录因子,蛋白长度77～621 aa,分子量8.81～67.38 kD,等电点5.23～9.37;每个成员含有1～4个内含子及2～5个外显子,这些GRF蛋白都具有由31～35个氨基酸组成的QLQ保守结构域或由25～43个氨基酸组成的WRC保守结构域。系统进化分析表明,藜麦与拟南芥的GRF转录因子亲缘关系比水稻更近。表达图谱显示,藜麦GRF基因具有明显的组织表达特异性,总体在种子中的表达量较高,其次是在花序和根中,在其他组织中的表达量相对较低。     

甜杨抗冻转录因子ICE1基因的in silico克隆及其分析

ICEl基因编码类似MYC的bHLH转录因子,可特异地结合到CBF3启动子的MYC作用元件并诱导CBF/DREB1下游基因的转录表达.本文采用电子克隆的方法,以拟南芥ICE1蛋白序列为信息探针,利用杨树EST数据库和毛果杨基因组序列拼接的结果,设计引物并通过RT-PCR从甜杨克隆了杨树的第一个ICE1基因.其cDNA长1 706 bp,含有完整的开放阅读框,可编码543个氨基酸的MYC类蛋白.编码蛋白序列含有bHLH区,核定位信号(NLS)区,富S区和转膜区各1个.Blast分析表明,cDNA序列及其推导的氨基酸序列均与拟南芥和芥菜的ICE1存在着较高的同源性,说明所获得的cDNA可能是甜杨ICE1基因(PsICE1,DQ481236).通过网络服务器平台进行PsICE1的功能预测,结果显示PsICE1含有bHLH保守功能域,具有多个磷酸化位点和跨膜区域.另外,ICE1的电子表达谱分析结果发现,ICE1几乎可在植物中整株表达,在多种组织和不同发育过程均表达,这也在一定程度上说明了ICE1是组成型表达,以及ICE1可能在植物的生长发育中也起着重要作用.