树莓试管苗茎尖包埋玻璃化法超低温保存

摘要：本试验对树莓茎尖包埋玻璃化法种质资源保存进行了研究,以期建立简单、高效的树莓种质资源超低温保存体系。试验以树莓试管苗茎尖为材料,探讨了不同因素对包埋玻璃化法超低温保存后成活率的影响。结果表明：长约1mm的树莓试管苗茎尖用海藻酸钙包埋后,采用分步预培养的方法,最后终止蔗糖浓度为0.9mol/L的MS培养基中进行预培养3d,再用含2M甘油和0.9M蔗糖的装载液处理90min, 在0℃下用PVS2处理180min后投入液氮中保存1h,在40℃下化冻3min,用含1M蔗糖的MS液体培养基洗涤20min,最后转到恢复培养基上,30d后在没有形成愈伤组织的情况下形成新的植株。以上的保存程序应用于6个树莓品种,成活率达87%。该结果为树莓种质资源的长期保存提供了理论依据。     

卷丹不同继代试管苗茎尖超低温保存效果及组织细胞学研究

为了研究组培茎尖的继代次数对其超低温保存后存活的影响,以卷丹试管苗不同继代次数的茎尖为材料,采用玻璃化法进行了超低温保存效果比较研究。结果表明,1~4代试管苗茎尖冻后存活率分别为55.8%、93.3%、67.0%和64.1%。同时,即初代培养后继代培养2个月的第2代试管苗茎尖超低温保存后存活率显著高于其他继代培养子组培苗。对各代试管苗茎尖进行石蜡连续纵切片显微观察,结果表明2代试管苗顶端分生组织细胞形态不同于其他继代代数,其显著特征是细胞体积小、细胞核大且细胞质浓密,这可能是其茎尖超低温保存显著高于其他3代的原因。     

怀山药种质资源的玻璃化法超低温保存

本文对怀山药种质资源的玻璃化法超低温保存技术进行了研究。结果表明,怀山药带芽茎段玻璃化法超低温保存较佳的技术体系是继代生长60 d的怀山药无菌苗置4℃冰箱低温锻炼7 d;在无菌条件下切取1~1.5 cm的带芽茎段,转至含5%蔗糖+3%甘露糖的培养基内,置4℃冰箱预培养2 d;用60%的PVS₁（22%甘油+13%乙二醇+13%聚乙二醇+10%二甲基亚砜）在室温下处理60 min,再用100%的PVS1在0℃条件下处理60 min,随即迅速投入液氮;保存24 h后,在37℃水浴中快速化冻,用含5%蔗糖的MS培养液洗涤4次,每次停留10 min;转至再生培养基（MS+KT 2 mg/L+NAA 0.02 mg/L）再培养,成活率可达77.14%,再生苗与常温苗形态指标差异不大。     

泽林考兰薄层细胞的再生体系

为建立泽林考兰薄层细胞的再生体系,以其试管苗茎尖薄层细胞为外植体,研究了不同激素浓度配比对其类原球茎诱导、增殖、分化及生根的影响。结果表明,茎尖薄层细胞在1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+TDZ2.0 mg/L+NAA 0.1mg/L培养基上的类原球茎的诱导率最高,达53.3%;类原球茎在1/2MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基上培养40 d后,增殖系数为9.6,类原球茎在1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L培养基上培养40 d后分化出小苗,分化率为89.7%;小苗在1/2MS+NAA 0.2 mg/L+AC 0.5 g/L培养基上生根培养40 d后,生根率达94.2%;小苗驯化移栽成活率达90%以上,长势良好。本研究通过以泽林考兰试管苗茎尖薄层细胞为外植体诱导出类原球茎,建立了泽林考兰薄层细胞再生体系,为泽林考兰试管苗产业化生产提供了新的途径。     

掌叶半夏微茎尖培养脱毒和快繁体系的建立

研究了茎尖大小、激素浓度、培养基成分对药用植物掌叶半夏脱毒效果的影响以及影响无病毒苗快速繁殖的因素等,结果表明：茎尖大小是影响茎尖成活和脱毒效果的主要因素,0.2~0.5mm的茎尖培养在MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L培养基上,成活率为53.3%,病毒脱除率为76.7%,培养基中附加247mg/L NH₄ ⁺可有效提高茎尖成活率至86.7%,同种培养基上继续培养,可一次性成功诱导形成试管苗,移栽成活率高达100%。MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+GA₃ 0.5mg/L组合最有利于试管茎的形成和发育,从而建立了以掌叶半夏微茎尖为外植体的脱毒和快速繁殖体系。     

苹果休眠茎尖的超低温保存研究

苹果金冠品种的休眠芭尖经３种不同方法超低温保存后,均获得成功,存活率达到８３％。休眠茎尖经受了冬季的深冷驯化和具有较低的含水量,因而成为超低温保存的良好试材。经过玻璃化液（ＶＳ３：５０％甘油＋５０％蔗糖）预处理８０ｍｉｎ后或经蔗糖溶液预培养产于无菌空气中干燥脱水至含水量３０％左右后,休眠茎尖可直接投入液氮进行超低温保存。保存一的休眠茎尖经离体２后可直接再生植株。试验进一步验证了试材生理状态的选择是     

小麦茎尖超低温保存处理条件的优化研究

以普通小麦为材料,探讨保护液中不同DMSO浓度、蔗糖浓度及不同冷冻处理时间对超低温保存后小麦茎尖成活率的影响,以获得最优超低温保存方法。重点针对小麦在超低温保存时的各处理条件对小麦茎尖成活率的影响展开了试验。结果表明,当保护液中含16%浓度的DMSO和6%浓度的蔗糖,并将预处理后的小麦茎尖采用梯度降温法:0℃停留存放30 min、-7℃停留存放1 h、-20℃停留存放1 h、迅速转移放入-80℃冰箱停留存放1 h、迅速投入液氮中过夜的超低温保存条件达到最高成活率,从而确定了小麦茎尖超低温处理时保护液中的最佳浓度组合及低温处理的最佳时间。     

防风(Saposhnikovia divaricata)组织培养中的玻璃化现象研究

以防风茎段为外植体,建立了组织培养再生体系,对防风试管苗玻璃化现象进行了研究。结果表明,与正常苗相比,玻璃化苗形态异常,组织含水量升高,叶绿素含量显著降低,酸性过氧化物同工酶活性减弱。6-BA浓度超过2.0mg/L、光照低于2000lx、培养瓶内湿度大都极易导致防风试管苗的玻璃化,减少愈伤继代次数,增加培养基内琼脂和蔗糖浓度,可以降低玻璃化率。轻中度的玻璃化苗通过改变培养环境可以恢复正常。优化的防风再生体系为:以嫩茎段为外植体,继代3次左右的愈伤组织诱导出芽,芽继代增殖时,6-BA浓度采用1.0mg/L和0.5mg/L交替使用,培养光照3000~4000lx。     

超低温保存法去除马铃薯X病毒和马铃薯纺锤块茎类病毒

病毒病严重危害马铃薯生产,是造成马铃薯减产和品质下降的主要因素。PVX和PSTVd属于危害马铃薯最主要的病毒。本文尝试用超低温保存法和常规方法(茎尖分生组织培养、温热疗法以及温热疗法结合茎尖分生组织培养)来去除马铃薯试管苗中的PSTVd和PVX。结果显示马铃薯茎尖经过超低温保存后,存活率和成苗率分别为83.64%和72.04%,高于茎尖分生组织培养(46.67%和31.49%)、温热疗法(72.22%和44.44%)以及温热疗法结合茎尖分生组织培养(50.54%和30.38%)。4种方法都可以去除PVX,其中超低温保存法的脱毒率最高,为59.13%,温热疗法结合茎尖分生组织培养为56.02%,温热疗法和茎尖分生组织培养较低,为42.61%和35.83%。但是4种方法都未能有效地去除PSTVd类病毒,只能通过严格检疫来控制。     

山药种质包埋玻璃化超低温保存再生植株的稳定性分析

为了验证前期建立的包埋玻璃化超低温保存技术是山药(Dioscorea opposita)种质资源离体保存的一种有效的方法,对包埋玻璃化超低温保存后的山药再生植株的形态、生理和同工酶酶谱进行了研究。结果表明:与常温保存的植株相比,供试的铁棍山药再生植株的平均株高、叶片数、芽数和茎节长,叶片中叶绿素、可溶性蛋白和可溶性糖含量以及超氧化物歧化酶(SOD)活力在绝对值上虽有差异,但均未达到显著水平,且能移栽成活,保持了形态和生理的稳定性;供试的铁棍、太谷、怀庆和嘉祥细长毛4种山药再生植株的SOD和蛋白水解酶的同工酶条带数目及强度均未发生变化,保持了酶蛋白的稳定性。说明前期建立的包埋玻璃化法超低温保存技术是山药种质离体保存的一种有效方法。     

濒危植物太行菊组织培养及快繁技术研究

研究旨在建立一种珍惜濒危植物太行菊的高效再生方法,为工厂化生产提供理论基础。以MS为基本培养基,用不同激素组合对太行菊无菌苗的叶片和茎段离体培养及植株再生、炼苗移栽等过程进行研究。结果表明,太行菊的叶片分化不定芽比茎段难,茎段最适合作为外植体进行愈伤组织的诱导及不定芽分化;筛选出了最佳培养基MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L,在此培养基中,茎段外植体可一步成苗,不需转换培养基即可完成愈伤组织的诱导分化及不定芽增殖过程;最佳生根培养基为1/2MS+NAA 0.2 mg/L;再生苗在花园土中移栽成活率可达80%。研究简化了培养流程,建立了太行菊一步式高效再生体系。     

超低温疗法在草莓病毒脱除中的应用

超低温疗法是近年发展起来的一种新型高效的脱毒技术,其脱毒率显著高于传统的脱毒方法。本研究以感染草莓斑驳病毒、草莓皱缩病毒、草莓镶脉病毒和草莓轻型黄边病毒的红颜草莓茎尖为试材,对超低温疗法中茎尖长度以及关键程序(预培养和预处理)进行筛选和优化,以期建立起完善的草莓超低温疗法脱毒技术体系。研究结果表明,在病毒脱除过程中,茎尖长度对脱毒率没有影响,然而却显著影响成活率。优化的超低温保存体系为:预培养蔗糖浓度为0.3 mol/L,暗培养7 d;室温60%PVS2装载60 min;0℃100%PVS2玻璃化处理60 min;液氮处理1d后,于38℃~40℃水浴2 min。在此体系下,草莓的茎尖存活率为68.89%,但草莓皱缩病毒、草莓斑驳病毒、草莓镶脉病毒和草莓轻型黄边病毒被同时去除,脱除率为100%,上述研究结果将为草莓脱毒苗的培育提供重要参考。     

苹果培养茎尖超低温保存试验研究

对富士等苹果品种进行超低温保存试验研究,结果表明:苹果试管苗低温锻炼的适宜时间为35d。试管苗低温锻炼后,移入含2.5%二甲亚砜MS培养基培养4d,可以省略前处理。低温锻炼培养基中BA、蔗糖的适宜浓度分别为5×10~(-7)、3%。在低温锻炼培养基中添加ABA10×10~(-8)或20×10~(-6),试管苗锻炼的适宜温度相应提高到15、20℃。茎尖浸入前处理液处理18h效果最好,筛选出较理想的前处理液和冻结媒液。     

5个酿酒葡萄品种组织培养及再生体系的建立

为了建立酿酒葡萄离体培养及植株高效再生体系,以5个酿酒葡萄品种花药和茎尖为外植体,利用组织培养法,研究了外源激素、基因型对外植体培养及再生的影响。结果表明,茎尖愈伤组织诱导及分化均优于花药。茎尖愈伤组织诱导培养基为：B5+NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0~2.0 mg/L;在此培养基上添加AgNO3 10 mg/L或PVP 1000 mg/L对花药愈伤组织诱导较好。茎尖愈伤组织分化培养基为：B5+NAA 0.01 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+GA3 0.2 mg/L,最高分化率达100%。本试验成功地建立了酿酒葡萄茎尖愈伤组织诱导、再分化芽苗再生体系,该结果可为酿酒葡萄良种快繁以及遗传转化体系建立奠定良好的基础。     

人参果‘长丽’叶片再生体系的建立

为了建立人参果遗传转化再生体系,以‘长丽’品种试管苗叶片为材料,研究了培养基种类、pH对人参果试管苗生长和激素组合对人参果叶片不定芽再生的影响。结果表明：培养基pH 5.7~6.0时,MS培养基有利于人参果试管苗的生长,培养24天时平均株高达8.5 cm;GS培养基有利于试管苗生根,培养24天试管苗的生根量达到13.8个/株。6-BA与TDZ配合使用,可显著提高叶片不定芽的再分化能力,在MS+6-BA 2.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/L培养基上叶片的再分化率达到83.3%,再分化系数达8.5。本试验研究发现人参果叶片不定芽再生的适宜培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/L。     

马铃薯茎尖玻璃化法超低温保存后DNA甲基化的遗传变异

对青薯9号、大西洋、小白花和E1074种基因型的马铃薯茎尖进行玻璃化法超低温保存,并运用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术分析4种材料超低温保存前后DNA甲基化的的变异情况。结果表明:经玻璃化法超低温保存,四个品种的成活率分别为86.93%、78.03%、71.57%和65.82%。成活率和再生率因基因型而异,且不同基因型之间的差异显著。用MSAP技术分析超低温保存前后植株甲基化的结果显示:用16对引物组合对4个品种进行扩增,平均扩增出493条带;与对照相比,4个品种基因组的CCGG序列中有8.4%~14.3%DNA发生甲基化变化。经超低温保存后,去甲基化和甲基化都有发生,并以去甲基化变化为主要趋势。本文运用MSAP技术对马铃薯超低温保存前后植株进行胞嘧啶甲基化分析表明,使用MSAP检测超低温保存后再生植株DNA甲基化遗传变异非常有效。     

人参果的脱毒与快速繁殖

以3份人参果栽培品种为供试材料，比较了启动培养基中激素浓度和不同的剥茎尖时期对茎尖成活率的影响，不同脱毒方法对脱毒率的影响，细胞分裂素对脱毒苗繁殖系数的影响以及生长素对脱毒苗茎杆粗细的影响，结果表明适宜人参果茎尖培养的启动培养基为含1．0mg/L 6-BA和0．05mg/L NAA的MS培养基；人参果脱毒剥取茎尖的最佳时期来自培苗经35度高温热处理1月后剥取的茎尖；采用连续多代35度高温热处理加剥茎尖培养的方法，获得了人参要脱毒试管苗，快繁培养基中1．5mg/L与0．5mg/L两种浓度的6－BA交替使用既提高了繁殖系数又有效地控制了玻璃苗现象的发生，培养基中添加0．05mg/L的NAA，可使脱毒苗生长健壮。     

矮生香石竹的组织培养和快速繁殖

矮生香石竹(代号为SJ-3)是本所采用切花香石竹和日本石竹杂交而成的优良新品种,该品种矮生、重瓣,没有种子,不能进行有性繁殖,因此利用组织培养技术、以矮生香石竹茎尖段为外植体,进行了组织培养快速繁殖研究。试验结果表明:(1)矮生香石竹增殖分化阶段的合适培养基为MS 6-BA0.2mg/L KT0.1mg/L NAA 0.05mg/L CCC 5ml/L;(2)合适的生根培养基为1/2MS NAA 0.5mg/L IBA0.5mg/L,生根率在86.6%;(3)在同等条件下采用透气的封口膜对克服矮生香石竹试管苗玻璃化有明显的效果;(4)生根试管苗移入珍珠岩∶河沙∶泥炭=1∶1∶1的基质中,成活率达93%,同时采用瓶外生根技术移栽成活率高,并缩短了试管苗的繁殖周期。     

东方百合快繁培养基优化与脱毒技术研究

摘 要：【研究目的】为实现百合种球的国产化,繁育大量的优质种球,笔者以东方百合的西伯利亚和索邦品种为材料,研究东方百合茎尖诱导、继代增殖和生根的最佳培养基,并比较不同的组织培养方法的脱毒效果。【方法】设置不同的激素浓度梯度筛选东方百合茎尖诱导、继代增殖和生根的最佳培养基,并比较新鲜百合球茎尖培养、冷藏处理百合球的茎尖培养、鳞片培养、鳞片扦插苗茎尖培养和试管苗茎尖培养等5种组织培养方法的脱毒效果。【结果】试验结果表明,百合茎尖诱导的适宜培养基为MS + 2.0mg/L 6-BA + 0.1mg/L NAA,芽形成的适宜培养基为MS + 1.0mg/L 6-BA + 0.5 mg/L NAA,苗形成的适宜培养基为MS + 1.0mg/L 6-BA + 0.08mg/L NAA,生根的适宜培养基为1/2MS + 0.4mg/L NAA + 4%AC (Active Charcoal)。病毒检测表明试管苗茎尖培养的脱毒效果最好,但成活率较低;冷藏处理百合球的茎尖培养的脱毒效果也较好且成活率较高。【结论】筛选的东方百合各阶段的培养基配方能满足东方百合快速扩繁的技术要求,茎尖培养在东方百合依然是较好的脱毒方法。     

膜荚黄芪愈伤组织诱导及植株再生体系的建立

为了建立膜荚黄芪组培快繁技术体系,本研究以膜荚黄芪无菌试管苗的下胚轴为外植体,探讨不同激素种类及其浓度配比对愈伤组织诱导率、丛生芽诱导率、再生苗生根率的影响,筛选适宜的培养基配方。结果表明:膜荚黄芪愈伤组织最佳诱导培养基是MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L,愈伤组织诱导率达86.4%,丛生芽分化的最佳培养基是MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L,丛生芽分化率最高达91.6%,再生苗最佳生根培养基1/2MS+IBA 0.5 mg/L+IAA 1.0 mg/L,生根率最高达62.6%。本研究建立了膜荚黄芪组培快繁技术体系,为其种质资源保存及开发利用提供了有力的技术支撑。