不同检测方法对甜菜ISSR引物多态性的影响

为了探讨不同检测方法对甜菜ISSR引物扩增效果的影响以及各方法的优缺点,笔者应用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳两种检测方法对甜菜ISSR 引物扩增效果进行了检测。利用12个不同的甜菜品种,对10 个ISSR引物进行扩增,分别采用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、1%的琼脂糖凝胶电泳以及2%的琼脂糖凝胶电泳对ISSR-PCR的扩增产物进行分离。结果表明：6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳无论是检测的总条带数还是多态性条带数均远高于琼脂糖凝胶电泳,且条带清晰,易于识别,而2%的琼脂糖凝胶电泳检测的条带数高于或等于1%的琼脂糖凝胶电泳,且条带更易于识别,因此,对于利用ISSR 引物进行QTL定位、指纹图谱构建以及遗传多样性分析时,推荐使用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,而对于种子纯度鉴定以及需要对ISSR扩增产物进行测序,则推荐使用2%的琼脂糖凝胶电泳。     

甜菜DAMD引物的筛选及不同凝胶系统对扩增产物多态性的影响

为了筛选适宜于甜菜品种纯度鉴定的DAMD引物,笔者利用12 个不同的甜菜品种分别对26 条DAMD引物进行扩增,并分别采用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳和2%的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测。结果表明,从26 条DAMD引物中筛选出16 条扩增清晰的引物,这16 条引物共扩增出139 条带,其中多态性条带为122 条,多态性百分比为87.7%,这16 条引物可以作为甜菜品种纯度和真实性鉴定的核心引物,同时发现聚丙烯酰胺凝胶电泳与琼脂糖凝胶电泳的检测结果差异不大,而琼脂糖凝胶具有制作方便、检测简单以及不使用任何有毒药剂等优点,推荐甜菜DAMD扩增产物的检测使用琼脂糖凝胶电泳。     

两种凝胶电泳系统对SSR标记多态性的影响

利用 35个SSR引物和 14个玉米自交系直接比较了 3%Metaphor琼脂糖凝胶和 12 %聚丙烯酰胺凝胶电泳对SSR位点多态性水平的影响。结果表明 ,两种凝胶系统检测出的等位基因数目和基因多态性水平存在显著差异 ,12 %聚丙烯酰胺凝胶在区分微小差异片段能力上明显高于 3%Metaphor琼脂糖凝胶。另一方面在两种电泳检测系统下 ,14个自交系之间的遗传相似系数相关性 (r =0 516)达到了极显著水平 (P <0 0 1)。在 10个具有最大多态性信息量的SSR引物中 ,8个在两种凝胶系统中保持相同。利用 8个引物可以对供试自交系进行初步鉴定。笔者认为 ,3%Metaphor琼脂糖凝胶电泳比较适合在遗传作图或基因定位研究中应用 ;而在品种指纹图谱分析或遗传多样性研究中 ,应采用 12 %聚丙烯酰胺凝胶电泳作为检测工具     

适合甜菜品种鉴定的SRAP核心引物的筛选

为筛选适合甜菜品种纯度鉴定的SRAP核心引物,以12个进口国外甜菜品种为材料,对546对SRAP引物组合进行扩增,利用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,选择适合甜菜品种纯度鉴定的SRAP核心引物组合。结果从546对SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富、重复性好的引物组合23对,这23对引物组合共扩增出177条多态性条带,引物的PIC值均大于0.6。平均每对引物扩增7.7条多态性条带,从理论上讲,这些核心引物完全可以实现对现有甜菜品种的鉴定。     

甜菜EST-SSR引物的快速筛选

为了快速从甜菜EST-SSR引物中筛选出适合甜菜分子生物学的引物,利用12个不同的甜菜品种对80对甜菜EST-SSR引物进行扩增,同时设置12个不同的退火温度,利用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行分离。结果表明：80对EST-SSR引物虽然均能够扩增出产物,但绝大部分引物扩增的条带由于没有多态性或者条带难以辨别而不能够使用,只有13对引物扩增出了清晰、易于识别的条带,有4对引物多态性较高,其余9对引物多态性均较低,而梯度退火温度则表明,退火温度对EST-SSR引物影响不大,只有个别引物会在较低退火温度条件下产生非特异性的条带,因此将所有引物的退火温度均设定为60℃。利用不同品种以及梯度退火温度可以实现EST-SSR引物的快速筛选,但要想筛选出多态性高的引物还需要对更多的EST-SSR引物进行筛选。     

毛细管与聚丙烯酰胺凝胶电泳检测甜菜SSR位点的比较研究

为了探究毛细管与聚丙烯酰胺电泳方法的适用情况，比较其优缺点。本研究以8个甜菜栽培种资源为材料，选择8个SSR位点，分别使用聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测和毛细管电泳荧光检测每个位点的多态性，并对这两种方法的检测结果进行了比较。毛细管电泳荧光标记法可以准确的知道DNA片段的分子大小；PAGE电泳只能用肉眼与Marker比较估测得出大致分子量，不能得出准确分子量。8对引物两种检测方法的匹配比率分别是75%、87.5%、50%、75%、25%、100%、37.5%、50%。研究结果证明，两种检测平台数据整合存在较大差异。检测结果与引物是否是单拷贝、引物多态性，稳定性等因素有直接关系。测序检验结果表明，样品较少时利用PAGE电泳的方法来检测SSR位点的多态性，既能节省成本又能节省时间，还能保证检测结果的准确性。     

一种适用于PCR扩增的甜菜干种子DNA快速提取方法的研究

为了寻求一种快速提取甜菜DNA的方法,利用改良CTAB法对甜菜干种子DNA进行了提取,经琼脂糖电泳及SRAP和SSR两种随机引物扩增检测,结果表明该法提取的DNA完整性好,SSR及SRAP扩增条带清晰,符合甜菜SSR-PCR及SRAP-PCR对DNA质量的要求。本研究建立了快速提取甜菜DNA的体系,为分子标记在将来甜菜品种指纹图谱构建及辅助育种等方面的应用奠定了坚实的基础。     

大白菜SSR检测体系的优化

以不同地区栽培的5份大白菜品种为试材,从PCR反应组成、扩增程序、电泳检测等环节对SSR技术进行了优化,建立了一套适用于大白菜品种鉴定的SSR-PCR体系.即10 μL反应组成为:1×buffer;2.50 mmol/L MgCl2;0.10 mmol/L dNTPs;0.35 μmol/L SSR引物;1.00 ng/μL模板DNA和0.40 U Taq酶.适宜的扩增程序为72℃热启动3 min,94℃预变性2 min后进行20个迫降循环:94℃变性60 s,68℃退火60 s,72℃延伸45 s(-1℃ /2 cycles);再进行20个循环:94℃变性60 s,58℃退火60 s,72℃延伸45 s,72℃延伸10 min.应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶(银染)电泳检测并取得很好的效果.选用108对芸薹属SSR引物,对这5份品种的基因组进行扩增,筛选出具有2条以上特异扩增条带的SSR引物22对.用这些引物对5份品种进行扩增,初步分析了SSR标记的多态性及用于大白菜指纹分析的潜力.     

芦笋SRAP反应体系优化及引物筛选

本研究以芦笋基因组总DNA为模板,通过对芦笋SRAP反应体系的重要参数进行优化,建立了一套适用于芦笋的SRAP反应体系:25μL的反应体系中,模板DNA量80ng、Mg2+浓度3.0mmol/L、上下游引物各0.2μmol/L、dNTPs0.3mmol/L、Taq DNA聚合酶1U以及1×Buffer。扩增程序为:94℃预变性3min;94℃30s、35℃30s、72℃1.5min,5个循环;然后退火温度提高到50℃,35个循环;最后72℃延伸10min。比较琼脂糖凝胶和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SRAP扩增产物的多态性,结果发现:6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物比琼脂糖的效果好。利用该优化体系筛选引物,从256个SRAP引物组合中筛选出239个,它们具有扩增条带清晰、丰富、重复性好的优点,证明了此优化体系稳定可靠。     

核酸染料Gelred在两种凝胶检测系统中的应用研究

由于无毒的核酸染料Gelred价格比较昂贵,在不影响实验效果的情况下,探讨Gelred在聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳中的最小用量。笔者将10000×的核酸染料Gelred稀释成1×、10×、20×、30×、40×、50×,将稀释后的核酸染料直接加入到甜菜PCR产物中。将核酸染料和甜菜PCR产物的混合物直接点样聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶,电泳后直接利用凝胶成像系统进行检测。以及另外一种方法是利用1×的Gelred分别对聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶进行泡胶,用凝胶成像系统进行检测。结果表明,Gelred 30×及以上的稀释浓度均适合于聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶,而1×的Gelred稀释液更适合于对聚丙烯酰胺凝胶进行泡胶。将稀释后的Gelred直接和PCR产物混合后,配合聚丙烯酰胺凝胶电泳,不仅减少了Gelred的使用量,而且减少了显影的时间。     

利用分子标记快速鉴定甜菜育性的研究

试验旨在优化分子标记鉴定甜菜育性的整个鉴定过程,为分子标记鉴定甜菜育性真正应用于实际育种工作打下基础。以随机抽取的10份糖甜菜和5份甜菜多胚种质资源嫩叶为试材,采用两种甜菜DNA提取方法、双重PCR以及两种电泳方式对甜菜育性进行鉴定。结果表明,裂解液法在提取甜菜DNA上更加高效便捷,1 h就可以提取100份甜菜DNA,效率远远高于CTAB法;采用双重PCR的方式进行甜菜育性鉴定完全可行,使甜菜育性鉴定时间减半。对两种电泳方式进行对比发现,6%聚丙烯酰胺凝胶电泳跑出的结果不能满足实验要求,而1%琼脂糖凝胶电泳跑出的结果完全满足实验要求。通过对用分子标记鉴定甜菜育性的整个鉴定体系进行优化,得出用裂解液法进行甜菜DNA的提取、双重PCR进行甜菜育性的鉴定、电泳方式选用1%琼脂糖凝胶电泳可以达到快速鉴定甜菜育性的目的。     

萝卜-甘蓝型油菜中萝卜基因组的RAPD与dpRAPD分析效率研究

应用RAPD与dpRAPD方法鉴定萝卜-甘蓝型油莱中萝卜基因组,筛选了140条随机引物。结果表明,平均每条引物(组合)能产生的萝b基因组特异标记数dpRAPD高于RAPD,分别为1．69和1．33;在dpRAPD扩增产物中有77．6％谱带清晰易辨,略高于RAPD(75．4％)。两者所检测到的萝卜基因组标记大部分为各自特异的扩增产物。由于结合了荧光标记引物,dpRAPD反应产物可在Genetic Analyzer上分离检测,因此能检测到100bp以下的小片段DNA。     

检测方法对甘蓝和大白菜品种RAPD标记鉴别多态性的影响

分析了琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳2种检测方法对甘蓝和大白菜品种RAPD标记鉴定多态性水平的影响.用12个随机引物扩增了14个甘蓝品种,琼脂糖凝胶电泳检测的结果为平均每个引物产生4.5条扩增带,其中1.5条具有多态性,多态性频率为33.3％.同时对产生条带最多的引物(S149)所扩增的产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,结果检测到了30条清晰可见的扩增带,其中19条具有多态性,为前者的6倍,可以完全鉴别14个甘蓝品种.用5个随机引物扩增了23个大白菜品种,用两种检测方法同时检测了扩增结果.结果表明,琼脂糖凝胶电泳检测的平均多态频率为30％,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测平均多态频率为61％,后者为前者的两倍.因此,在使用RAPD标记进行甘蓝和大白菜品种鉴别时,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法能大大提高检测效率.     

甜菜全基因组SSR引物的筛选与评价

旨在筛选出适合于甜菜分子生物学实验的SSR核心引物,为后续构建甜菜指纹图谱及遗传多样性分析奠定重要基础。本文利用4种不同的甜菜种质资源和4个不同的甜菜品种,对基于甜菜全基因组编码区序列设计的247对SSR引物进行了初步筛选。结果表明,247对引物中绝大多数引物没有多态性或者多态性不好,只有27对引物具有较高的多态性,这27对引物总共扩增出103条带,其中多态性条带95条,多态性比率为90.43%。这些引物多态性信息量(PIC)范围为0.549~0.983,平均每一对引物的PIC值为0.841。试验结果表明虽然经过了电子PCR的筛选,想要找到合适的甜菜SSR引物依然比较困难,说明甜菜的遗传基础比较狭窄。这27对SSR引物适用于甜菜分子标记,为甜菜品种标准化鉴定体系的大规模构建和应用奠定了重要基础。