TGF-βRⅠ及Smad2表达情况对绵羊腔前卵泡发育的影响

为探索适于哺乳动物腔前卵泡的培养方式以及观察颗粒细胞与卵母细胞的信号表达,为阐明早期卵泡生长的复杂机理和揭示卵泡发生发育的内在规律提供参考,通过使用免疫组织化学染色、荧光免疫组织化学染色以及RT-PCR的方法,观察TGF-βRⅠ与Smad2的蛋白和mRNA在绵羊卵巢卵泡的表达情况。结果表明:TGF-βRⅠ在绵羊腔前卵泡及小腔卵泡的颗粒细胞及卵母细胞有表达,随着卵泡的生长发育,到成熟卵泡时期时,信号消失;Smad2蛋白在绵羊卵泡各个发育时期的颗粒细胞中均有表达,在绵羊腔前卵泡的卵母细胞中无表达,随着卵泡的生长发育,信号逐渐出现,到成熟卵泡时期时,Smad2蛋白在卵母细胞表达较强;TGF-βRⅠmRNA只在成熟卵泡和培养前腔前卵泡颗粒细胞中检测到表达,在成熟卵泡和培养前腔前卵泡颗粒细胞中均有Smad2 mRNA表达,但在培养后腔前卵泡颗粒细胞中Smad2 mRNA表达量较低。TGF-βRⅠ与Smad2的蛋白和mRNA表达与绵羊卵泡发育情况密切相关。     

绵羊卵母细胞体外培养Ghrelin mRNA的表达

为揭示Ghrelin在绵羊卵母细胞的表达情况,运用实时定量RT-PCR技术检测不同培养系统中绵羊卵母细胞Ghrelin mRNA的相对表达量。结果表明,以M199和血清为基础培养基添加不同激素后培养的卵母细胞GhrelinmRNA相对表达量均显著上升,仅以M199为基础培养基添加不同激素后培养的卵母细胞Ghrelin mRNA相对表达量均显著下降。在不同基础培养基中添加不同激素后,E2较FSH和LH有促进Ghrelin mRNA相对表达量升高的趋势。绵羊卵母细胞Ghrelin mRNA的表达以及在不同培养系统动力学变化,提示了这一新型分子在卵母细胞成熟过程中受激素潜在的调控作用。     

不同培养方法及培养密度对绵羊腔前卵泡发育的影响

通过对绵羊腔前卵泡培养方法的研究,能够探索出适宜绵羊腔前卵泡生长发育的培养条件,以及为进一步揭示绵羊卵泡生长发育的规律奠定一些基础。试验一通过使用微滴法和琼脂培养基法培养腔前卵泡,观察其对绵羊腔前卵泡生长的影响;试验二通过绵羊腔前卵泡单独培养与群体培养,探讨不同培养密度对绵羊腔前卵泡生长的影响。试验结果显示,使用微滴法与琼脂培养基法培养的绵羊腔前卵泡,在培养3天时,卵泡直径增加值和存活率差异均不显著(P0.05);但培养6天时,琼脂培养基法培养的腔前卵泡的直径增加值和存活率均极显著高于微滴法培养的腔前卵泡(P0.01);在使用琼脂培养基培养的条件下,对绵羊腔前卵泡进行单独培养和群体培养,在培养的6天时间内二者卵泡直径增加值和存活率差异均不显著(P0.05)。试验结果表明,琼脂培养基法是较为适宜的绵羊腔前卵泡体外培养方法;培养密度对绵羊腔前卵泡体外培养并无显著影响。     

GDF9与BMP15在绵羊腔前卵泡及卵母细胞体外成熟过程中的差异表达

为了探讨GDF9与BMP15在绵羊腔前卵泡发育及卵母细胞体外成熟过程中的作用,运用腔前卵泡的显微分离方法和RT-PCR技术,检测了GDF9、BMP15 mRNA在绵羊腔前卵泡及卵母细胞体外成熟过程中(0、8、16、24 h)的相对表达丰度。结果表明：绵羊COCs在体外培养的不同时期,卵丘细胞扩展呈现不同的形态学变化;腔前卵泡中GDF9、BMP15 mRNA表达量均低于体外成熟不同时期卵母细胞,且腔前卵泡中GDF9 mRNA表达量显著低于体外成熟不同时期卵母细胞。揭示GDF9和BMP15对卵巢卵泡发育和卵母细胞体外成熟发挥重要作用,在绵羊卵母细胞体外成熟过程中,这2个因子可能是独立或协同地影响卵丘细胞增殖扩散。     

绵羊卵巢腔前卵泡的分离与体外培养

分离方法和绵羊年龄对绵羊卵巢腔前卵泡的分离效果有显著影响。从每只羊获得腔前卵泡的总数看,机械分离法(89．5)和酶消化法(103．3)差异不显著,而正常卵泡数和正常卵泡率机械分离法(27．9,31．2％)明显高于酶消化法(19．1,18．5％);采用机械分离法,每只初情期前绵羊获得的腔前卵泡总数和正常卵泡数(125．6,35．1)均高于成年绵羊(60．4,16．1),而正常卵泡率(28．1％比26．8％)差异不显著。腔前卵泡在体外培养6d,培养液中添加20ng／mL的IGF-I,培养结束时卵母细胞直径增幅为34．8μm,与对照组的29．9μm差异不显著。     

Ghrelin对小鼠不同来源胚胎体外发育的影响及其受体的表达模式

为探明Ghrelin及其受体Ghsr-1a在早期胚胎发育中的作用,以小鼠体内受精、体外受精和孤雌激活胚胎为研究对象,在其体外发育过程中添加不同浓度Ghrelin,观察胚胎发育效率;通过免疫荧光染色和荧光定量PCR,观察不同时期胚胎中Ghsr-1a的变化。结果表明,体内受精胚体外发育中添加0.1 ng/m L Ghrelin显著降低了囊胚率(P0.05),添加1 ng/m L的Ghrelin显著降低了小鼠体外受精胚的囊胚率(P0.05)。在体内受精胎中,Ghsr-1a的mRNA表达水平在4细胞显著高于其他时期(P0.05);体外受精胚中,Ghsr-1a的mRNA水平在8细胞前无明显差异,桑椹胚和囊胚显著下降(P0.05)。在孤雌激活胚胎中,Ghsr-1a的mRNA表达水平从2细胞到8细胞显著降低,之后到囊胚期开始显著升高,其蛋白表达模式与mRNA表达模式相反。Ghsr-1a在体内受精和体外受精胚胎中的表达相似,囊胚期表达量最低。结果提示,Ghrelin能够抑制体内和体外受精胚的体外发育,不同来源胚胎Ghsr-1a mRNA和蛋白表达模式均不相同。研究结果为进一步探索Ghrelin在胚胎发育中的作用机制提供了试验基础。     

绵羊Toll样受体家庭在肺泡巨噬细胞的分布及脂多糖(LPS)刺激对TLR2、TLR4表达的影响

为确定toll样受体家族在绵羊肺泡巨噬细胞的分布及脂多糖(LPS)刺激过程中TLR2、4的动态表达规律.通过RT-PCR方法检测绵羊TLR1-TLR10表达分布;以α-tubulin和GAPDH为内标基因,对绵羊TLR2、4进行克隆和测序,将重组质粒作为标准品建立实时定量PCR标准曲线,通过实时定量PCR方法检测LPS诱导0～48 h TLR2、4的动态表达.结果表明,在绵羊肺泡巨噬细胞中检测到TLR1、2、4、6、7、8、9、10的表达,而TLR3、5未见表达;α-tubulin和GAPDH在LPS诱导前后表达量存在显著差异,均不适合作为内标基因,以使用的细胞数和总RNA量进行均一化校正,发现TLR2、4在诱导后20 min就达到高峰,且在整个诱导过程中维持较高水平.绵羊肺泡巨噬细胞TLR2、4对LPS刺激的应答反应很灵敏,参与机体的早期应答反应.     

牦牛PIK3CB基因克隆及其在卵泡发育过程中的表达研究

旨在探讨磷脂酰肌醇-3激酶催化亚基β(Phosphoinositide-3 kinase, PI3K,catalytic subunit beta, PIK3CB/P110β)基因序列特征,比较分析其在牦牛不同发育阶段卵泡中的表达规律。通过RT-PCR技术从牦牛卵巢组织中克隆获得PIK3CB基因序列并对其进行生物信息学分析;采用RT-qPCR方法检测PIK3CB基因在牦牛不同组织中的表达水平;将采集的牦牛卵泡根据直径大小分为大(≥7 mm)、中(3.0～6.9 mm)、小(≤2.9 mm)3组,分别收集各组卵泡中的壁颗粒细胞及卵母细胞提取总RNA,采用RT-qPCR方法检测PIK3CB mRNA在各级别卵泡壁颗粒细胞及卵母细胞中的相对表达量。结果显示:克隆获得牦牛PIK3CB基因CDS区长3 213 bp,共编码1 070个氨基酸。蛋白质分析显示,PIK3CB蛋白为亲水酸性蛋白,无跨膜结构无信号肽,二级结构主要由α-螺旋和无规卷曲组成。PIK3CB核苷酸同源性及遗传进化树分析显示,牦牛与野牦牛和黄牛亲缘关系最近。PIK3CB基因在牦牛心脏、脾脏、肾脏、肌肉、肝脏、肺脏、子宫、胃、小肠、卵巢组织中均有表达,尤其在脾脏、子宫和卵巢组织中表达量显著高于其他组织(P0.05)。RT-qPCR结果显示,PIK3CB基因在卵泡发育过程中均有表达,其中在各级别卵泡壁颗粒细胞中,mRNA表达量随着卵泡发育进程呈现上升趋势,且大、中级别卵泡中的表达量极显著高于小卵泡组(P0.01);但是卵母细胞中mRNA表达量差异不显著(P0.05)。结果提示,mRNA基因参与了牦牛卵泡发育调控,是PI3K信号通路在调节颗粒细胞的功能中不可或缺的催化亚基之一,具体调控机制有待进一步研究。本研究为深入探讨PI3K-AKT信号通路在卵巢发育中的调控机理提供基础资料。     

绵羊Toll样受体家族在肺泡巨噬细胞的分布及脂多糖(LPS)刺激对TLR2、TLR4表达的影响

为确定toll样受体家族在绵羊肺泡巨噬细胞的分布及脂多糖(LPS)刺激过程中TLR2、4的动态表达规律。通过RT-PCR方法检测绵羊TLR1-TLR10表达分布;以α-tubulin和GAPDH为内标基因,对绵羊TLR2、4进行克隆和测序,将重组质粒作为标准品建立实时定量PCR标准曲线,通过实时定量PCR方法检测LPS诱导0~48 hTLR2、4的动态表达。结果表明,在绵羊肺泡巨噬细胞中检测到TLR1、2、4、6、7、8、9、10的表达,而TLR3、5未见表达;α-tubulin和GAPDH在LPS诱导前后表达量存在显著差异,均不适合作为内标基因,以使用的细胞数和总RNA量进行均一化校正,发现TLR2、4在诱导后20 min就达到高峰,且在整个诱导过程中维持较高水平。绵羊肺泡巨噬细胞TLR2、4对LPS刺激的应答反应很灵敏,参与机体的早期应答反应。     

小尾寒羊BMF基因在发情不同阶段卵巢及卵泡发育过程中的表达分析

旨在初探BMF基因在小尾寒羊卵泡发育过程中的生物学功能，为将来深入探索其调控机理提供理论依据。对小尾寒羊实施同期发情，采用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,RT-qPCR)、蛋白免疫印迹(Western Blot, WB)及免疫荧光染色(IF)方法检测BMF基因及其编码蛋白在不同生理阶段卵巢中的表达量；随后分离不同直径的卵泡，分析目的基因在大、中、小卵泡中的表达差异。结果显示，BMF mRNA在撤栓后42 h卵巢中的表达量显著高于撤栓后18 h(P<0.05),其编码蛋白表达结果与mRNA基本一致；BMF蛋白主要表达于卵泡颗粒细胞和卵泡膜细胞中；进一步分离卵泡，发现BMF基因及其编码蛋白表达量均在中卵泡中显著高于大卵泡和小卵泡(P<0.05)。以上结果表明，BMF基因可能参与卵巢周期性活动，在卵泡发育过程中发挥重要作用。     

辽宁绒山羊皮肤毛囊mir-1298-5p靶基因预测及表达载体构建

探讨辽宁绒山羊皮肤毛囊不同发育时期mir-1298-5p的调控作用及其与靶基因的潜在关系,为mir-1298-5p与其靶基因对皮肤毛囊发育作用提供理论依据。以辽宁绒山羊皮肤毛囊组织为材料,通过miRNA的分离、表达、靶基因预测筛选及靶位点3'UTR表达载体构建,采用RT-PCR进行表达检测,在线靶基因预测软件预测mir-1298-5p的靶基因,并对其靶基因TGF-βR1的靶位点进行克隆测序、缺失突变。结果表明：靶基因预测发现TGF-β R1的3'UTR存在mir-1298-5p种子区结合位点,且mir-1298-5p及其靶基因TGF-β R1均在皮肤毛囊不同发育时期呈现差异性表达。mir-1298-5p对皮肤毛囊周期性发育可能起到一定的调控作用,并成功构建了TGF-βR1 3'UTR表达载体,为后期过表达转染体系的建立和功能基因的验证奠定了基础。     

不同发育时期玉米叶片保绿度遗传主效应及其与环境互作效应分析

采用包括基因型×环境互作效应的加性-显性遗传模型及非条件和条件的分析方法,研究多环境下玉米吐丝后不同发育时期叶片保绿度性状的遗传主效应及其与环境互作效应。结果表明:非条件遗传分析表明控制玉米叶片保绿度在发育不同时期的各遗传效应均受到环境条件的影响并存在着表达水平上的差异;条件遗传方差分量分析表明,控制玉米吐丝后不同时期叶片保绿度表现的净遗传效应在各个发育时期均有新的不同程度的表达,对玉米由抽丝期到成熟期发育进程基因表达净效应的选择越来越受到环境条件的影响。     

玉米叶片蛋白质含量不同发育时期的遗传效应及环境互作效应分析

摘要：采用朱军包括基因型×环境互作效应的加性-显性-母体效应遗传模型（ADM模型）分析方法,研究了不同环境条件下不同发育时期玉米叶片蛋白质含量的遗传主效应及其与环境互作遗传效应。结果表明：玉米叶片蛋白质含量在不同发育时期（吐丝期、灌浆期、乳熟期、腊熟期、成熟期）分别受到不同遗传效应及其与环境互作效应的影响,育种中需考虑不同遗传效应在不同时期不同环境中的差异。关键词:玉米;蛋白质;遗传效应;基因型×环境互作     

海岛棉单株成铃性状的发育遗传研究

采用包括基因型与环境互作的加性-显性-母体遗传模型,分析了两年的海岛棉7个亲本及其21个F1组合不同发育期的单株成铃数资料。遗传方差分析表明,成铃前期遗传主效应与遗传×环境互作效应所占比例相当;成铃中期加性效应和显性效应的影响降低,显性×环境互作效应及母体×环境互作效应增加;成铃后期遗传×环境互作效应在8月2日上升至最大,之后逐渐下降但仍然起重要作用。控制单株成铃数的基因在成铃前期到7月17日表达比较活跃。同一遗传效应的非条件遗传相关多为显著的正值,而条件遗传相关则检测到显著负值与正值。两种分析方法的结合能充分阐明海岛棉成铃发育中的基因活动特点。结果表明:海岛棉单株成铃性状的发育遗传特点与陆地棉存在差异。     

气候变化对河北省棉花物候期的影响

【目的】研究河北省棉花物候期对气候变化的响应。【方法】利用气象数据和棉花物候期数据,分析了1981—2010年河北省棉花各生育阶段气候变化特征、物候期变化趋势、各生育阶段长短变化趋势以及各生育阶段长短与该生育阶段气象因子的相关性。【结果】1)棉花各生育阶段平均温度和≥0℃积温整体呈升高趋势;2)棉花播种期、出苗期、现蕾期、开花期、吐絮期呈提前趋势,而收获期呈延后趋势。开花之前各生育阶段缩短,开花之后各生育阶段延长,整个生长期延长;3)吐絮之前各个生育阶段的平均温度、≥0℃积温与该生育阶段长短呈负相关,吐絮到收获及全生育期的天数与该时期平均温度、≥0℃积温呈正相关。【结论】研究结果有助于理解气候变化对棉花生长发育的影响,并据此提出棉花生产应对气候变化的适应技术与策略。     

Dynamic analyses of rice blast resistance for the assessment of genetic and environmental effects

A doubled haploid population was employed to characterize the dynamic changes of the genetic components involved in rice blast resistance, including main-effect quantitative trait loci (QTLs), epistatic QTLs and QTL-by-environment interactions. The study was carried out at three different developmental stages of rice, using natural infection tests over 2 years. The number of main-effect QTLs, epistatic QTLs and their environmental interactions differed across the various measuring stages. One QTL ( d12 ) on chromosome 12 was detected at all stages, whereas most QTLs were active only at one or two stages in the population. These findings suggest that the unstable expression of most QTLs identified for blast resistance was influenced by the developmental status of the plants, epistatic effects between different loci and the environments in which they were grown. These findings demonstrate the complexity of expression of rice blast resistance and have important implications for durable resistance-breeding and map-based cloning of quantitative traits.     

不同分离方法及培养方式对绵羊腔前卵泡发育能力的影响

研究的目的在于分析用不同的方法分离绵羊腔前卵泡以及用不同的培养方式对分离得到的腔前卵泡进行培养,对于绵羊腔前卵泡存活和发育能力的影响。实验分两部分进行：实验1为分离卵巢皮质,分别用显微分离法和胶原酶法分离腔前卵泡。实验2是在实验1的基础上,将较优方法获得的腔前卵泡分别进行单独培养和群体培养。结果显示,显微分离法与胶原酶法相比,在获得的腔前卵泡数量上差异不显著,但显微分离法获得的腔前卵泡基膜完整率显著高于胶原酶法（P<0.05）。获得的腔前卵泡使用单独和群体两种方式进行培养,其直径增加值在第三天和第六天差异不显著,但单独培养法在第三天和第六天的存活率显著高于群体培养法（P<0.05）,且有卵泡腔形成。研究显示使用显微分离法分离腔前卵泡与胶原酶法相比具有优势,相对简单,廉价并且对卵泡的损害很小。经显微分离法获得的腔前卵泡,使用单独培养法进行培养能够促进卵泡的生长发育。     

玉米光周期敏感相关性状发育动态QTL定位

玉米是短日照作物,大多数热带种质对光周期非常敏感。光周期敏感性限制了温、热地区间的种质交流。研究玉米光周期敏感性的分子机理,有利于玉米种质的扩增、改良、创新,提高玉米品种对不同光周期变化的适应性。本研究以对光周期钝感的温带自交系黄早四和对光周期敏感的热带自交系CML288为亲本配置的组合衍生的一套207个重组自交系为材料,在长日照环境条件下对不同发育时期的叶片数、株(苗)高变化进行QTL分析。结果表明,双亲间的最终可见叶片数和株高差异很大;发育初期CML288的叶片数和苗高都低于黄早四,而发育后期CML288的叶片数和株高都明显高于黄早四;测定各时期F₇重组自交系间也存在显著差异。利用包含237个SSR标记、图谱总长度1 753.6 cM、平均图距7.40 cM的遗传连锁图谱,采用复合区间作图法,分别检测到控制叶片数和株(苗)高发育的QTL 11个和20个。但是,没有一个条件QTL 能在测定的几个时期都有效应。在长日照条件下,控制叶片数与株(苗)高的非条件与条件QTL主要集中在第1、9和10染色体上,特别是在第10染色体的标记umc1873附近均检测到了影响这两个性状的QTL,且在不同的发育时期单个条件和非条件QTL所解释的表型变异分别为4.34%~25.74%和10.02%~22.57%,表明这一区域可能包含光周期敏感性关键基因。     

番茄耐贮突变体Lok过氧化物酶同工酶分析

对耐贮番茄Lok、自交系97—l14、大黄柿子、桔黄佳辰、樱桃黄、小黄梨和醋栗番茄分8个生育阶段取样，进行过氧化物酶同工酶酶谱分析，探讨耐贮番茄的亲缘关系和来源。结果表明，耐贮番茄Lok是普通栽培品系97—l14的突变体，而与野生亚种的亲缘关系较远。另外，耐贮番茄Lok随生育期进展谱带增减发生了变异，从而也映证了Lok发生了基因突变。