玉米PLATZ基因GRMZM2G006585启动子的克隆及表达分析

高转录活性籽粒特异性启动子可调控目的基因在植物籽粒中特异性、高水平表达。为发掘玉米籽粒特异性启动子，以公开发表的玉米表达谱芯片数据为切入点，筛选出籽粒优势表达基因GRMZM2G006585,克隆其编码区上游约2 000 bp的DNA序列，命名为PZm2G006585。利用在线网站New PLACE和PlantCARE对其进行启动子顺式作用元件分析，发现其含有E-box、P-box等多个籽粒特异性相关元件，初步认为所克隆编码区上游序列为玉米来源的籽粒特异性启动子。为验证其功能，构建该启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的表达载体并进行植物遗传转化。转基因水稻的GUS组织化学染色结果表明，该启动子驱动外源基因表达模式为籽粒特异、胚优势表达；转基因拟南芥单拷贝株系T₃种子中GUS活性检测结果显示，PZm2G006585驱动的GUS活性为909.52 nmol/(min·mg)。籽粒特异性启动子PZm2G006585的发掘和功能验证为驱动目标基因在玉米、水稻等单子叶植物籽粒中特异性表达提供了候选启动子资源。     

玉米ZmNAOD基因的克隆与功能分析

玉米籽粒发育和光周期特性是影响产量的关键因素。本文通过RT-PCR方法, 从玉米骨干自交系昌7-2籽粒的cDNA中克隆得到一个乙酰鸟氨酸脱酰酶基因, 命名为ZmNAOD。ZmNAOD的CDS (coding DNA sequence)长1344 bp, 编码447个氨基酸。qRT-PCR分析表明, ZmNAOD基因在玉米雄穗中的表达量最高, 其次是在籽粒、叶、茎、根中; 该基因在授粉后不同天数籽粒中的表达趋势为, 0~15 d快速上升, 之后迅速下降。对该基因的过表达转基因拟南芥的研究表明, ZmNAOD基因在转基因拟南芥的根中表达量最高; 经暗处理10 d后, 转基因株系根的长度显著长于野生型; 转基因拟南芥的生育期明显提前, 其粒长和千粒重显著大于野生型拟南芥。这些结果表明, ZmNAOD基因的表达可能与籽粒发育和光周期调控有关。     

玉米叶绿体表达载体构建及绿色荧光蛋白基因瞬时表达检测

Tps1是生物保护物质海藻糖的关键合酶基因.构建含Tps1的玉米叶绿体表达载体,首定从玉米叶绿体基因组中克隆16S/trnI-trnA/23S片段,作为定点整合同源片段;然后将编码酵母海藻糖合酶基因Tps1表达盒(Prrn-Tps1-TpsbA-ter)、草丁膦抗性基因Bar表达盒(RpsbApro-Bar-RpsbAter)、卡那霉素抗性基因Npt Ⅱ和绿色荧光蛋白基因Gfp构建的融和基因表达盒(Prrn-Npt Ⅱ/Gfp-RrbcLter)一起克隆到定点整合同源片段之间,构建了玉米叶绿体的稳定表达载体mTKGB.通过基因枪轰击法将mTKGB转化到玉米幼嫩叶片中,培养2 d后,在激光扫描共聚焦显微镜下脱测到玉米一些细胞的叶绿体中有很强的GFP绿色荧光,结果表明构建的载体可在玉米叶绿体中表达.     

逆境诱导型启动子rd29A诱导ipt基因转化烟草的研究

构建诱导型启动子rd29A驱动下ipt基因表达载体,经农杆菌介导转入烟草,同时构建CaMV35S启动子驱动下的ipt表达载体作为对照,以研究两种启动子诱导下目的基因的表达差异.同时对遗传转化后的外植体进行常温(25℃)和4℃低温诱导处理,比较分析不同温度及处理时间对rd29A-ipt及35S-ipt转化的受体材料的愈伤组织诱导、生长和分化情况的影响,结果表明:rd29A启动子在4℃低温诱导12h时,能够很好的调控ipt基因的表达,使烟草外植体正常分化,获得较高的抗性愈伤诱导率,与转rd29A-ipt植株在常温处理以及对照载体低温和常温三种处理之间差异性显著.35S启动子由于诱导ipt基因过量表达而使植株生长受到抑制.PCR检测结果表明ipt基因和rd29A基因已整合到烟草基因组中.     

利用可视化标记建立Cre-loxP介导的抗生素删除载体系统并应用于玉米转基因研究

本研究通过Cre-loxP系统,构建了Kan基因的删除载体系统,利用花青素合成途径中转录因子的表达指示删除的效果。首先,利用两次PCR方法对pGreen载体进行改造,在卡那霉素抗性(Kan)基因的两侧加入两个同向的loxP位点,在多克隆位点前插入5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶的表达框作为筛选标记基因,命名为pBAC823。在此载体基础上,构建了两个植物表达载体,组成一个抗生素可删除的载体系统。其一是在pBAC823载体Kan基因的一侧加入花青素合成途径中两个转录因子bi基因和cl基因的表达框,命名为pBAC9008。该载体可以作为基础植物表达载体,用于表达目的基因。其二是含Cre酶基因表达框的植物表达载体。将hsp70启动子驱动的cre基因的表达框插入pBAC823载体Kan基因的一侧,并将玉米花青素基因合成途径中转录因子bi和cl的表达框插入多克隆位点,命名为pBAC9009,此载体作为一个删除载体,单独转化植物,之后可以通过杂交方法删除目的基因表达载体中两个loxP位点之间的Kan基因片段。将上述载体转化玉米幼胚,得到T0代转基因玉米的种子,其中部分籽粒为紫色,分子检测结果表明紫色籽粒有花青素基因的插入,验证了花青素合成基因作为可视化标记的可靠性。本研究采用了可视化标记跟踪外源基因的表达和抗生素抗性基因的删除,不仅大大降低了外源基因的检测成本,为转基因食品安全提供技术保证,在转基因研究中具有重要的意义。     

小鼠FABP4基因启动子驱动红色荧光蛋白载体的构建及在牛体细胞中的表达

小鼠脂肪型脂肪酸结合蛋白(FABP4)的启动子/增强子元件是脂肪组织特异性启动元件,为了鉴定该元件在牛体细胞中的启动效果,首先以小鼠肝脏DNA为模板,通过PCR克隆得到5.9 kb的FABP4基因启动子片段,连入p MD19-T载体后进行酶切及测序鉴定,经Eco T 22I酶切去除非核心启动子区后精简为2.3 kb的片段,通过SacⅡ酶切将5.9 kb片段和2.3 kb片段的启动子连入红色荧光蛋白载体p Ds-Red 2-1的多克隆位点,构建为表达质粒p MF5.9-Red和p MF2.3-Red,利用脂质体法将上述载体分别转染牛脂肪间充质干细胞及牛胎儿成纤维细胞,24 h后实时定量PCR检测红色荧光蛋白转录水平。结果表明,克隆得到的5.9 kb小鼠FABP4启动子片段酶切及测序结果正确,与红色荧光蛋白载体相连的载体p MF5.9-Red和p MF2.3-Red酶切结果与预期相符,表达载体构建成功,实时定量PCR结果显示以上2种细胞在转染后24 h红色荧光蛋白均有表达,且p MF2.3-Red的转录水平是p MF5.9-Red的2倍以上。成功构建了小鼠FABP4启动子驱动红色荧光蛋白表达载体p MF5.9-Red和p MF2.3-Red,5.9 kb片段和2.3 kb片段均可驱动外源基因在牛体细胞中转录,且2.3 kb片段启动效率高于5.9 kb片段。     

黄土高原旱作玉米籽粒水分与机械粒收质量的关系

玉米机械粒收是全程机械化的关键, 但存在着籽粒破碎、果穗和落粒损失严重等备受关注的问题。开展机械粒收质量及其影响因素研究, 对推进旱作玉米机械粒收技术应用具有重要意义。本研究选择国内玉米主栽品种33个, 于2016-2017年在甘肃泾川同一地块上用福田雷沃谷神收割机械粒收, 分析籽粒水分与机械粒收质量指标的关系。结果表明, 基因型差异是造成玉米机械粒收质量不同的主要原因, 两年收获时平均籽粒水分26.05%, 破碎率7.47%, 产量损失率3.25%, 落穗损失率2.58%, 杂质率1.04%; 籽粒水分(X)与破碎率(Y₁)、产量损失率(Y₂)显著正相关, 并且存在Y₁ = 0.027X ²-0.987X+14.06 (R ² = 0.373 ^**, n = 51), Y₂ = 0.052X ²-2.223X+24.86 (R ² = 0.418 ^**, n = 51)的变化关系, 籽粒水分依次下降到18.3%、21.4%时, 对应的破碎率(5.1%)、产量损失率(1.1%)最低, 即在一定含水率范围内随着籽粒水分的增加破碎率、产量损失率升高, 机械粒收的籽粒适宜水分为18%~22%, 破碎率可控制在5.0%~5.5%的范围内; 籽粒水分对落穗损失的影响大于落粒损失, 随着籽粒水分增加落穗损失率增加的幅度明显高于落粒损失率的升高; 各因素对玉米机械粒收产量损失的影响为: 落穗损失率(0.924)>籽粒水分(0.048)>破碎率(0.043), 因而籽粒水分高和落穗损失量大是影响黄土高原旱作玉米机械粒收质量的主要因素。     

木霉双价基因表达载体的构建

利用几丁质酶基因和β-1,4-葡聚糖酶基因构建双价基因表达载体,为木霉转化奠定基础。利用限制性内切酶酶切得到目的基因片段,通过T4 DNA ligase将基因插入表达框中,并采用PCR、酶切和核苷酸序列分析验证双价基因表达载体的正确性。利用启动子CaMV35S和终止子PolyA构建几丁质酶基因chi42的表达框,获得表达载体pC1302-C42;利用启动子CaMV35S和终止子Nos构建β-1,4-葡聚糖酶基因glu14的表达框,获得表达载体pC1300-2-G14;在单基因表达载体的基础上,通过串联构建双价基因表达载体pC1300-2-G14-C42,该表达载体含有潮霉素B抗性基因。经检测证实表达元件35S-chi42- PolyA和35S-glu14-Nos连接成功。得到的双价基因表达载体pC1300-2-G14-C42可直接用于木霉等丝状真菌的遗传转化,为构建木霉广谱高效工程菌株奠定基础。     

玉米miR395基因家族生物信息学分析及靶基因预测

MicroRNA(miRNA)具有调控基因表达的作用,为了揭示玉米miR395基因家族进化规律、表达模式及功能,开展了基因定位、多序列比对、顺式作用元件分析、二级结构分析、靶基因预测及表达模式分析。结果共鉴定到16个成员,且均集中分布在第2号、第10号染色体上;19个碱基完全相同,表明在进化过程中具有高度保守性;具有18个ABRE类顺式作用元件,推测其通过参与调节ABA信号传导,提高玉米抗逆性;多数靶向基因参与硫酸盐同化,初步推测玉米miR395基因家族参与玉米硫代谢;转录组分析发现zma-miR395基因家族中一些成员为下调表达模式。研究结果为后续玉米相关基因的功能解析奠定了基础。     

牛筋草EPSPS基因启动子对草甘膦的响应

杂草对草甘膦抗药性机理及抗草甘膦转基因作物研究主要围绕草甘膦靶标酶EPSPS展开,EPSPS基因表达量增加是杂草抵抗草甘膦胁迫的主要分子机制之一,但EPSPS基因表达调控机理及其对草甘膦的响应却鲜有研究。本研究根据Gen Bank中牛筋草EPSPS基因启动子序列设计引物,从牛筋草基因组DNA中扩增EPSPS基因启动子序列及其5'端缺失序列;将各启动子片段构建到含绿色荧光蛋白基因GFP的p35S-GFP载体上,在农杆菌的介导下,利用洋葱表皮细胞瞬时转染体系分析EPSPS基因启动子活性及对草甘膦的响应,结果表明,各启动子片段均能启动下游基因的表达,具有较强的启动子活性,可作为较好的实验材料用于抗草甘膦转基因作物的研究。此外,EPSPS基因启动子能够响应草甘膦信号,调节下游GFP基因的表达,响应元件可能存在于3'端的345 bp内。研究结果有助于进一步丰实杂草对草甘膦抗药性机理及抗草甘膦转基因作物研究的理论基础。     

干旱胁迫下枯草芽孢杆菌对玉米种子抗旱性及生理指标的影响

为了寻找有助于增强玉米种子萌发期抗旱性的菌种,研究了干旱胁迫下枯草芽孢杆菌菌种对玉米种子萌发的生理调控作用。以4种来自贵州省不同地点且不同植物根际的枯草芽孢杆菌菌种（R29-1、R9-1、R59、R60）为材料,运用隶属函数和标准差系数赋予权重法分析干旱胁迫下玉米种子发芽指标以及生理生化指标。结果表明,接种4种枯草芽孢杆菌均增强了玉米萌发过程中的抗旱性,抗旱性评价为R60>R9-1>R59>R29-1>CK2（15% PEG）,尤其接种枯草芽孢杆菌R60与R9-1能够更好地提升玉米抗旱性。接种枯草芽孢杆菌能同时提升玉米萌发过程抗逆性与叶片游离脯氨酸含量,降低叶片超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶的活性,从而减轻细胞膜受到的伤害,因此接种枯草芽孢杆菌R60能有效促进玉米的萌发及萌发期的生长。     

玉米弱势粒库活性与籽粒内源激素及多胺含量的关系

玉米籽粒形成期的库活性是弱势粒败育或灌浆受限的核心限制因子,明确弱势粒中内源激素及多胺水平对其库活性的调控机制,对探索密植条件下玉米弱势粒调控途径具有重要意义。本研究以典型玉米杂交种郑单958和先玉335为材料,在控制授粉条件下(不完全授粉Ic P、完全授粉CP),比较分析了成功发育弱势粒(Ic P处理)和发育不良弱势粒(CP处理)的内源激素及多胺水平差异及其与库活性的关系。结果表明,品种和年度对籽粒库活性、内源激素和多胺水平整体无显著影响。Ic P处理下弱势粒的可溶性酸性蔗糖转化酶(SAI)活性显著高于CP处理,平均差异和最大差异分别达13.5%和21.8%。在玉米籽粒形成期,弱势粒中玉米素和玉米素核苷(Z+ZR)、生长素(IAA)、赤霉素(GA3)和脱落酸(ABA)含量在两种控制授粉处理间无显著差异。弱势粒中多胺含量表现为Ic P处理显著高于CP处理,而乙烯释放速率则恰恰相反。弱势粒中SAI活性与多胺含量显著正相关,而与乙烯释放速率显著负相关,且多胺含量与乙烯释放速率显著负相关。可见,在玉米籽粒形成期,其弱势粒中Z+ZR、IAA、GA3和ABA与其库活性即SAI活性无关;弱势粒库活性主要受多胺和乙烯含量影响,多胺促进SAI活性而乙烯则抑制其活性,二者的平衡关系决定了弱势粒成功发育与否;多胺和乙烯平衡关系受同化物质供应水平的调控。     

不同灌水施氮方式对玉米叶片生理特性和产量的影响

为了研究不同灌水施氮方式对玉米叶片生理特性、产量及其构成的影响。以春玉米‘宜单629’为供试材料,监测不同灌水方式下玉米生育期内的叶面积指数(LAI)、生理特性指标和籽粒产量。结果表明,与均匀灌水均匀施氮(CICN)相比,交替灌水均匀施氮(AICN)和交替灌水交替施氮水氮协同供应(AIANS)显著提高玉米抽雄期及以后第7、14、21、28和35天的LAI和叶绿素含量及抽雄期、灌浆期和乳熟期叶片的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性、可溶性蛋白含量、玉米行数、行粒数、穗粒数、千粒质量和籽粒产量(P<0.05),但显著降低相应生育期叶片的MDA、可溶性糖和脯氨酸含量(P<0.05)。可见,AICN和AIANS有利于提高玉米的LAI和抗氧化酶活性,改善活性氧产生与清除之间的关系,从而使玉米产量增加。     

waxy基因功能标记开发及在糯玉米育种中的应用

为利用分子标记辅助选择加快糯玉米种质资源改良进程,以糯玉米自交系云539和普通玉米自交系昌7-2为材料,通过DNA序列测定和分析,探明糯玉米自交系云539 wx基因属于wx-D7突变类型。根据2个自交系基因组序列差异,开发出waxy基因功能标记FMD7,并通过了表型验证和通用性验证。利用开发的基因功能标记FMD7进行分子标记辅助选择,结合产量、株型和品质性状分析,获得携带wx基因的优良昌7-2改良系6个。利用本研究开发的基因功能标记FMD7进行辅助选择可加快回交转育进程,提高育种效率,为选育高产糯玉米杂交种提供材料基础,同时也为分子标记辅助选择单基因或少数主效基因控制的性状提供理论参考。     

玉米籽粒蛋白质含量的遗传效应及其与产量的关系

用来自5个不同基础群体的14个自选系作母本,不同优势群的5个测验系作父本,采用NC II交配设计配成70个杂交组合,进行了2年3点的田间试验。利用近红外光谱,对亲本及其杂交种的籽粒蛋白质含量进行了分析,同时分析了籽粒产量与蛋白质含量的相关性。结果表明,父、母本及其70个杂交组合间的基因型方差均达到极显著水平;8822和M是蛋白质含量较高的两个基础群体,以之作母本对提高杂交种籽粒的蛋白质含量起主导作用。控制籽粒蛋白质含量的基因以加性效应为主,加性方差占基因型方差的94.29%,但广义遗传力和狭义遗传力相对较低,分别为35.83%和33.94%,说明环境因素对籽粒蛋白含量影响明显。籽粒产量与蛋白质含量相关不显著(r = 0.053),因此,扩大变异选择范围,实现优良基因聚合,产量和蛋白质含量性状可以同步得到改良。     

玉米HSP90基因家族的全基因组鉴定与分析

热激蛋白90（HSP90）广泛参与生物体的生长发育,且积极响应多种非生物胁迫。为全面解析玉米HSP90基因家族信息,对HSP90基因家族进化树、基因结构、保守基序（motif）、GO富集和组织表达模式等进行分析,并进一步分析ZmHSP90-1基因响应干旱胁迫的表达模式及蛋白互作关系。结果显示,从玉米全基因组水平共鉴定到11个ZmHSP90家族基因,被划分为5个亚族（I~V）;相邻进化树分支上的ZmHSP90基因具有相似的motif和基因结构;GO富集分析显示,11个ZmHSP90基因均参与了蛋白质折叠过程;表达模式分析显示,11个ZmHSP90基因在不同组织或器官中均有表达,其中ZmHSP90-1基因的表达量相对较高;ZmHSP90-1基因在耐旱性强的玉米自交系中具有更高的表达量,且积极响应干旱和复水过程;蛋白互作预测显示,ZmHSP90-1可能与其互作蛋白协同响应非生物胁迫,发挥生物学功能。     

抗双链RNA依赖性蛋白激酶PKR基因表达载体构建及在玉米中的遗传转化

玉米病毒性病害和杂草严重影响其产量和品质。以pCAMBIA5300为基础载体,应用In-Fusion克隆技术构建了双价植物表达载体pCAMBIA5300-Ubi-PKR-CaMV35S-EPSPS,其中含有抗双链RNA依赖性蛋白激酶PKR基因和磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶EPSPS基因,分别由玉米泛素Ubi启动子和花椰菜花叶病毒35 S启动子启动。以玉米种子黄化苗的茎尖分生组织为受体,用农杆菌介导法进行遗传转化,将抗双链RNA依赖性蛋白激酶基因PKR和抗除草剂草甘膦基因EPSPS导入玉米自交系掖478中,获得转基因植株及其子代。     

玉米灌浆期果穗不同部位籽粒碳水化合物积累与淀粉合成相关酶活性变化

玉米果穗顶部籽粒通常较中、下部籽粒充实差,粒重轻,其机制不清楚。本研究旨在探明玉米果穗不同部位籽粒淀粉合成相关酶活性变化及其与籽粒灌浆的关系。以玉米品种登海11为材料,分别进行春播和夏播试验,观察果穗不同部位籽粒中可溶性糖、蔗糖和淀粉的含量及淀粉合成相关酶活性变化。结果显示,与夏播玉米相比,春播玉米具有较多的每穗粒数、较高的百粒重和产量。虽然产量在春播和夏播间有差异,但两季玉米籽粒的最大灌浆速率、平均灌浆速率、百粒重、可溶性糖和蔗糖含量、最大淀粉积累速率、平均淀粉积累速率均表现为果穗下部籽粒中部籽粒上部籽粒。灌浆期果穗不同部位籽粒腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(St S)和淀粉分支酶(SBE)活性变化均呈单峰曲线,果穗上部籽粒AGPase、St S和SBE活性峰值和平均值均显著低于果穗中、下部籽粒。相关分析表明,淀粉积累速率、籽粒灌浆速率与AGPase、St S和SBE活性均呈极显著正相关。说明玉米果穗顶部籽粒较低的AGPase、St S和SBE活性是其灌浆较差、粒重较低的重要原因。春播玉米粒重较高,与其灌浆期较强的淀粉合成能力有关。     

玉米籽粒突变体smk7的表型分析和基因定位

In this study, a stable small kernel mutant, named small kernel 7 (smk7), was isolated from ethylmethane sulfonate (EMS) mutagenesis of maize inbred line B73. Compared with wild type, the smk7 mutants showed smaller kernel size, defective embryo and endosperm development and a significant decrease in 100-kernel weight. The smk7 kernels showed a low level of germination rate at 10% and cannot grow into normal plants. No significant changes were detected in protein, starch and oil content between mature wild type and smk7 kernels, but the starch grains became significantly smaller and irregular in smk7 kernels compared with wild type. The smk7 kernels could be clearly distinguished from the wild type as early as 12 days after pollination (DAP), on the basis of their smaller and emptier phenotype. Microscopic inspection of the paraffin sections revealed that the development of embryo and endosperm were delayed, and the cell wall in growth in basal endosperm transfer layers (BETL) were arrested in smk7 compared with wild type. The F₂ populations with multiple backgrounds were constructed by crossing heterozygous plants (+/smk7) with several other inbred lines. Genetic analysis showed that the mutant phenotype was controlled by a single recessive gene. Based on genotyping by target sequencing (GBTS) strategy, the SMK7 was initially mapped on the short arm of chromosome 2. The fine mapping results suggested that SMK7 was located between markers RM1433917 and RM1535316, with a physical distance of 120 kb. There were eight protein-coding genes in this region. This study laid a foundation for further genes cloning and research of the SMK7 function in regulating maize kernel development.     

基于控制授粉技术的玉米弱势粒发育与库特征的关系

明确弱势粒败育和灌浆受限与其库容量或库活性关系,对于探讨弱势粒调控途径、实现密植群体产量挖潜具有重要意义。本研究以典型玉米杂交种郑单958和先玉335为材料,在控制授粉条件下(不完全授粉IcP、完全授粉CP),比较成功发育弱势粒(IcP处理)和发育不良弱势粒(CP处理)的库容量和库活性及籽粒灌浆参数的差异。结果表明,不同控制授粉处理下,玉米弱势粒胚乳细胞增殖过程和最大胚乳细胞数无显著差异;IcP处理弱势粒可溶性酸性蔗糖转化酶(SAI)活性显著高于CP处理,平均差异和最大差异分别达12.6%和21.8%,且实测百粒重、籽粒终极生长量、最大灌浆速率和平均灌浆速率皆表现为IcP处理高于CP处理。可见,玉米果穗顶部弱势粒败育或灌浆停滞不受其库容量的限制,籽粒形成期的库活性是弱势粒败育或灌浆受限的核心限制因子。