鲨烯环氧酶基因(SQEs)的克隆及其在温度胁迫下与枇杷悬浮培养细胞中熊果酸(UA)含量的相关性

熊果酸(ursolic acid,UA)是枇杷(Eriobotrya japonica L.)中重要的生物活性成份,鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SQE)是UA等五环三帖生物合成途径中的限速酶之一。为了克隆SQEs基因,寻找枇杷细胞悬浮培养获取UA合适的胁迫温度,建立此胁迫温度下SQEs的差异表达及其与UA含量的联系,本研究以枇杷悬浮培养细胞为材料,在对数生长期中后期设置低温15℃和高温35℃处理,研究收获时(12 d)细胞生长与目标产物UA的相互关系。同时,采用同源克隆方法分离SQEs,研究15℃处理中,两个枇杷鲨烯环氧酶基因(ej SQE1和ej SQE2)的差异性表达。结果表明,ej SQE1(Gen Bank登录号:JQ294053.2)与ej SQE2(Gen Bank登录号:JQ294054.2)氨基酸序列的相似度为69.89%,序列的两末端差异最大;15℃下,距离收获48 h的处理中UA总含量最高;ej SQE1和ej SQE2的表达量均出现峰值。ej SQE1和ej SQE2的表达量均出现峰值。15℃下,距离收获24 h的处理,两者表达量显著下降(P<0.05);距离收获长于24 h的处理,枇杷悬浮细胞中ej SQE1和ej SQE2两个基因的表达量之和以及ej SQE2基因与UA的含量呈现出显著正相关(P<0.05)。本研究获得了SQEs基因序列及胁迫温度下的表达特征,为枇杷细胞悬浮培养UA调控机制的研究提供基因源及参考资料。     

刺五加皂苷合成关键酶基因表达的半定量RT．PCR分析

根据己克隆的刺五加鲨烯合酶（squalene synthase,SS）、鲨烯环氧酶（squalene epoxidase,SE）和β-香树酯醇合成酶（B—amyrin synthase,bAS）基因序列信息设计引物,通过半定量RT-PCR分析了SS、阳和bAS基因在刺五加不同生长发育时期和不同器官中表达量的变化。结果表明,SS、SE和bAS基因在各生长发育时期和各器官中均有表达,但表达量差异显著（P〈0．05）,三者均在盛花期表达量最高,之后降低,进入果实成熟期后豁和bAS的表达量迅速回升,阳无显著变化。册和bAS在叶片和根中的表达量较高,舾表达量的最大值出现在叶片和幼茎中。刺五加SS、SE和hAS基因的表达间存在显著的正相关关系（P〈0．05）。研究结果为讲一步分析关锋酶基因对刺百加三萜皂苷生物合成的影响奠定了基础。     

γ辐照对'巴西蕉'体细胞胚发生的影响

以经60Co γ射线辐照处理过的'巴西蕉'(Musa AAA Cavendish)未成熟雄花为外植体进行愈伤组织诱导,以获得的胚性愈伤组织为起始材料建立胚性细胞悬浮系(ECS),然后通过体胚发生途径进行植株再生,测定辐照处理对ECS植株再生能力的影响.结果表明:20～80Gy的辐照处理能显著提高未成熟雄花的胚性愈伤组织...     

水杨酸诱导下人参培养物差异表达基因片段的克隆

本研究以人参愈伤悬浮细胞为材料,在其生长的第28天添加1×10^-3mg／L水杨酸,测定水杨酸添加后,过氧化物酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶等3种酶在72h内的变化及皂苷含量,结果表明：水杨酸添加后对过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶的活力影响最大,分别在24h和48h达到最大峰值,在18h开始影响多酚氧化酶的活力,培养物生长的第28天添加水杨酸可以明显提高人参愈伤组织中皂苷的合成。确定添加水杨酸后24h提取总RNA,进行cDNA-RDA分析,筛选差异片段。确定差异基因并在GenBank中注册,注册号为FE900130。为探讨水杨酸作为诱导子对人参次生代谢的影响奠定基础。     

OsEXPA8基因对水稻悬浮细胞的周期和大小的影响

膨胀素是植物细胞特有的一种细胞壁松弛蛋白,在很大程度上决定着植物细胞的生长速率.α-膨胀素(α-expansin,EXPA)和β-膨胀素(β-expansin,EXPB)是植物膨胀素家族中两个较大的亚家族.水稻(Oryza sativa)中至少有34个α-膨胀素基因.本研究通过转基因技术,研究了一个水稻根特异性表达的α-膨胀素基因OsEXPA8对水稻悬浮细胞的细胞周期和细胞大小的影响.利用流式细胞仪,分析不同培养时期野生型和转基因型细胞周期的差异,结果发现,35S∷OsEXPA8(过表达)转基因悬浮细胞大部分处于G2/M期,而OsEXPA8-RNAi (knock-down)转基因悬浮细胞多处在G1期;利用血球计数板测定细胞数量,结果表明,35S∷OsEXPA8转基因细胞数量＞野生型细胞数量＞OsEXPA8-RNAi转基因细胞数量;利用显微镜测定不同培养时期的细胞大小,发现35S∷OsEXPA8转基因细胞大小＞野生型细胞大小＞OsEXPA8-RNAi转基因细胞大小;测定愈伤组织块大小,发现35S∷ OsEXPA8转基因愈伤组织块大小＞野生型愈伤组织块大小＞ OsEXPA8-RNAi转基因愈伤组织块大小.本研究结果表明,OsEXPA8能够促进水稻悬浮细胞的分裂和生长,从而增加细胞数量,增大细胞体积,对水稻悬浮细胞的生长具有调控作用.该研究将有助于更好地了解植物细胞壁的松弛过程,从而深入地认识植物的生长发育进程.同时,膨胀素作为一种细胞壁松弛因子在农业上具有潜在的生物工程应用价值.     

鸡屎藤愈伤组织诱导及细胞悬浮培养研究

建立鸡屎藤愈伤组织的诱导、增殖继代培养及其细胞悬浮培养的技术体系。研究不同植物激素组合对叶片、茎段和带腋芽茎段愈伤组织诱导的影响;采用正交试验研究不同处理对叶片愈伤组织增殖的影响;采用液体振荡培养法测定叶片愈伤组织细胞悬浮生长曲线。结果表明：叶片最易诱导产生愈伤组织,最佳激素配比为MS＋6-BA1.0mg/L＋NAA0.5mg/L,诱导率可达100%。叶片愈伤组织最佳增殖培养基为MS＋2,4-D0.5mg/L＋NAA0.3mg/L＋6-BA0.5mg/L,pH5.8。由叶片愈伤组织建立的细胞系生长呈＂S＂型曲线,培养24d达到最大生长量,最适继代周期为18～20d。以叶片为外植体经愈伤诱导、增殖培养可建立良好的细胞悬浮系。     

空竹悬浮细胞系的建立

竹子悬浮细胞培养比较困难,本研究首次获得空竹悬浮细胞.以空竹种胚为材料诱导愈伤组织,建立稳定的悬浮细胞培养体系;通过固体培养法获得悬浮细胞来源的愈伤组织,可为竹类悬浮细胞系遗传转化或诱变后单克隆的筛选提供材料.空竹种胚在3/4MS+500mg/L脯氨酸+500mg/L谷氨酰胺+300mg/L胰蛋白胨+3.0mg/L 2...     

油菜素内酯对水稻细胞伸长和分裂的调控

油菜素内酯(brassinosteroid,BR)是调控植物生长发育的重要的激素之一。为明确BR在调控水稻(Oryza sativa)细胞发育过程中的作用,本研究以不同浓度外源BR处理的水稻愈伤组织、悬浮系和内源BR信号增强的BR突变体Os BZR1-OE为材料,对BR处理后水稻愈伤组织的体积和细胞分布状况、单个悬浮细胞的形状和大小、Os BZR1-OE转基因水稻的细胞进行了观察,并对细胞分裂关键基因的表达量、对细胞分裂具有重要作用的细胞骨架蛋白(F-actin)的积累进行了分析。结果表明,低浓度(1×10-10 mol/L)BR处理的愈伤组织块体积(1.03 cm3)大于对照(0.73 cm3),但高浓度BR(1×10-6 mol/L)处理的愈伤组织块的体积(0.27 cm3)明显小于对照;从细胞核的分布也能印证上述结果,低浓度BR处理后的愈伤组织细胞核排列疏松,表明细胞体积较大,即1×10-10 mol/L BR促进了水稻愈伤组织细胞体积的增加,高浓度BR处理后的愈伤组织细胞核密度大,表明细胞体积较小,即1×10-6 mol/L BR抑制了水稻愈伤组织细胞体积的增加;低浓度BR促进水稻悬浮系单个细胞的伸长,而高浓度的BR抑制悬浮系细胞的伸长;内源BR信号增强的突变体Os BZR1-OE下胚轴细胞明显短于野生型水稻下胚轴细胞;本研究通过碘化丙碇(propidium iodide,PI)和异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate isomerⅠ,FITC)-鬼笔环肽染色对悬浮系细胞的形态和微丝细胞骨架进行观察,发现BR处理可促进水稻悬浮系细胞和微丝骨架的分裂,高浓度BR对细胞分裂的促进效果更明显;双向电泳结果表明,BR处理可促进微丝骨架蛋白的表达;RT-PCR结果表明,BR可增加促进有丝分裂的CDC48(cell division cycle protein 48)和能缩短细胞周期的CYCD2(cyclin D2)基因的表达。上述结果表明,低浓度BR促进水稻细胞的伸长,高浓度BR抑制水稻细胞的伸长,BR促进微丝骨架F-actin的积累,通过促进有丝分裂基因CDC48和缩短细胞周期的因CYCD2的表达而调控水稻细胞的分裂。本研究为BR在作物控高抗倒伏方面的应用提供了理论依据。     

青梗花椰菜和白梗花椰菜转录组分析

为探讨花椰菜花梗颜色的遗传基础,采用高通量测序技术(Illumina Hi Seq 4000)对青梗和白梗花椰菜进行转录组测序,共获得52 253 822个序列读取片段(reads),对测序的结果从头组装获得66 450个单基因(Unigene),N50为1 285 bp,平均长度为717.40 bp。转录物注释结果显示,45 390个基因有同源比对信息;21 060个基因无匹配序列信息,可能为花椰菜特异的基因序列。对所得差异基因(DEGS)进行不同数据库注释,GO注释到2 540个DEGS,分为细胞组分、分子功能及生物学过程3大类54个功能组;COG注释到的753个Unigene功能系统分为24类;以KEGG数据库为参考,将946个DEGS定位到119个代谢途径分支,注释到6个差异基因与类胡萝卜合成途径有关,9个DEGS与类黄酮生物合成途径有关,1个DEGS与叶绿素代谢相关,且与花椰菜的花梗颜色形成密切相关。16个差异基因通过qRT-PCR验证,结果与RNA-Seq测序结果一致。本研究结果进一步揭示花椰菜花梗颜色的形成机理,为花椰菜品种遗传改良奠定了一定的理论基础。     

转青蒿反义鲨烯合酶基因对烟草鲨烯合酶基因表达的影响

利用反义技术，通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导，将青蒿（Artemisia annua）的反义鲨烯合酶基因导入烟草（Nicotiana tabacum）株系W38中，存转基因烟草中，鲨烯合酶的表达成功地得到抑制，其mRNA的水平降低。对鲨烯合酶的下游产物之一胆同醇的检测显示，转基因烟草的胆固醇含量低于对照，同时以法呢基焦磷酸为前体的二萜支路产物之一的GA，含量得到提高。实验结果表明，反义抑制烟草鲨烯合酶可以降低植物甾醇的生物合成，并促进类异戊二烯途径中以法呢基焦磷酸为前体的其它代谢支路的生物合成。     

油菜素甾醇对沟叶结缕草长期培养愈伤组织生长和再生的影响

为了维持长期培养植物愈伤组组织的高再生率,以应用于体细胞无性系进行变异筛选。本研究以继代15年的沟叶结缕草[Zoysia matrella (L.) Merr.]胚性愈伤组织为材料,用不同浓度的表油菜素内酯(EBL)处理,研究油菜素甾醇(BR)对其生长和再生的影响,选出可提高长期离体培养愈伤组织生长及再生效率的最优EBL浓度。同时,测定EBL处理的愈伤组织和再生植株中过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧岐化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量等生理指标变化,探究BR调控沟叶结缕草体细胞胚发生过程中抗氧化系统的作用机理。结果表明,0.02 μmol·L^-1EBL对愈伤组织生长和再生的促进作用最明显,直径增长率和再生率分别为131.11%和43.8%,且愈伤组织胚性维持最佳。高浓度的EBL(>0.10 μmol·L^-1)抑制愈伤组织的胚性维持和再生。EBL处理激活了植物体内的抗氧化反应系统,继代生长中POD活性降低;再生过程中,CAT、POD、SOD活性均增强;继代和再生过程中MDA含量均降低,表明BR途径能激活愈伤组织的抗氧化系统的响应,加强继代和再生过程中的抗氧化反应,从而调控体细胞胚胎发生过程中的生理生化进程。本研究为缓解长期培养的愈伤组织再生率随着培养时间增长而下降的难题提供了解决方案。     

紫色黄秋葵转录组功能基因测序及分析

黄秋葵为药食兼用型植物,富含花青素、多糖、黄酮及萜类等活性成分。为探讨黄秋葵次级代谢过程中这些活性物质合成的遗传基础,以紫色黄秋葵嫩茎叶为材料,采用Illumina Hi Seq 2500高通量转录组测序技术获得23 026 500个短读序,经组装获得42 484个Unigene,平均长度877 bp。31 931个和21 926个Unigene分别在Nr和Swiss Prot数据库有同源比对信息;Unigene与COG、KOG数据库进行比对,根据其功能各分为24类和25类;通过Pfam数据库,所注释到的20 031个Unigene分属于7 277类蛋白结构域;GO注释到18 602个Unigene分为细胞组分、分子功能及生物学过程等三大类的51个功能组,其中大量Unigene与细胞部分、细胞、催化活性、结合活性、代谢进程及细胞进程相关;根据KEGG数据库,可将7 619个Unigene定位到119个代谢途径分支,其中有1、3、35、61、13和70个Unigene分属于花色素苷、黄酮、类黄酮、N-多糖、二萜类和萜类骨架生物合成路径,它们可能参与这些活性物质的生物合成。本研究结果为后续深入开展黄秋葵花青素、黄酮类等物质代谢合成途径及相关功能基因研究奠定了基础。     

植物法呢基焦磷酸合酶基因(FPPS)研究进展

植物法呢基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase,FPPS)是甲羟戊酸代谢途径分支点的关键酶,参与叶绿素、类胡萝卜素、细胞分裂素、脱落酸、赤霉素、长萜醇、类萜、辅酶Q、甾醇和植物毒素等类异戊二烯物质的合成,而类异戊二烯是维持植物生长发育等所必需的重要有机物质.本文综述了植物法呢基焦磷酸合酶基因克隆、基因表达、酶动力学研究等方面的重要进展,旨在为其在植物进化分类、遗传改良中的应用提供参考.     

水稻野生型愈伤组织中耐盐细胞频率的影响因素

利用组织培养技术研究愈伤组织的倍性、品种、外植体对野生型愈伤组织中耐盐细胞频率的影响。发现 :( 1)单倍体和二倍体愈伤组织的耐盐细胞频率比较接近 ,四倍体愈伤组织的耐盐细胞频率一般比单倍体和二倍体愈伤组织的小 ;( 2 )不同品种的耐盐细胞频率差异大 ;( 3)二倍体植株幼穗培养产生的二倍体愈伤组织和四倍体植株花药培养产生的二倍体愈伤组织的耐盐细胞频率没有显著的差异     

外源多胺对野牛草成熟胚愈伤组织内源多胺与乙烯合成影响

以野牛草成熟胚诱导的愈伤组织为材料,研究了外源多胺对愈伤组织褐化的影响及愈伤组织不同生长时期内源多胺和乙烯合成代谢规律。结果表明,精胺(Spm)3 mg/L和亚精胺(Spd)3 mg/L在不同程度上改善了愈伤组织生长质量,愈伤组织开始褐化的时间明显延迟。外源多胺对愈伤组织内源多胺与乙烯合成的影响在不同生长时期差异明显,继代培养10 d,外源多胺促使愈伤组织内源多胺含量增加,而乙烯释放量保持较低水平;培养至20 d,除Spd促使愈伤组织内源Spm含量增加外,其它处理的内源多胺含量均呈下降趋势;至30 d时,内源多胺含量与乙烯释放量降至最低。因此认为野牛草成熟胚的愈伤组织褐化与乙烯和多胺的代谢有关。     

玉米未成熟胚胚性愈伤组织诱导率与内源激素含量的关系

以胚性愈伤组织诱导率高低不同的9个玉米自交系未成熟胚为外植体,用改良N6培养基诱导培养愈伤组织。酶联免疫法测定不同培养时间后未成熟胚,以及由此诱导的胚性和非胚性愈伤组织,内源脱落酸(ABA)、吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3、GA4)和细胞分裂素(DHZRI、PA、ZR)含量。结果发现,胚性愈伤组织诱导率与未成熟胚ABA和IAA含量正相关,与胚性和非胚性愈伤组织ABA含量正相关,与胚性愈伤组织GA3含量负相关。在胚性愈伤组织开始发生之际,外植体的ABA和IAA含量出现峰值,GA3含量出现低谷。因此认为,未成熟胚高水平的ABAI、AA含量和低水平的GA3含量,有利于胚性愈伤组织的诱导。但是胚性愈伤组织的ABA含量却低于非胚性愈伤组织,且胚性愈伤组织诱导率与胚性愈伤组织IAA含量负相关。由此看来,胚性愈伤组织的诱导和保持,可能还与各种激素的协同作用有关。     

西洋参愈伤组织悬浮培养物细胞分化与皂苷合成关系的研究

研究了西洋参愈伤组织悬浮培养物细胞生长曲线 ,观察了细胞形态结构和组织化学变化。结果表明 ,在延滞期愈伤组织细胞无分化 ,皂苷含量低 ;对数生长期细胞刚刚开始分化 ,皂苷开始积累 ;到直线生长期 ,培养物细胞导形成较多 ,皂苷大量积累 ;到静止期 ,皂苷积累达到高峰 ,此时用高效液相色谱法测定培养物 ,皂苷含量为 3.2 0 8% ,Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2 、Rd含量分别为 0 .0 2 %、0 .2 8%、1 .1 6%、0 .1 6%、0 .1 6%和 0 .2 2 % ,说明西洋参皂苷合成与细胞分化呈正相关。     

玉米组培材料的玻璃化法超低温保存及冻后植株再生

本研究针对玉米遗传转化中常用的受体材料幼胚、胚性愈伤组织和悬浮细胞系进行了玻璃化法超低温保存。对玻璃化超低温保存中的几个主要因素（预培养、过渡液处理时间、脱水时间、脱水时的温度等）进行了比较实验。结果表明：预培养可以大幅度提高悬浮细胞系超低温保存后的细胞存活率;在较短的脱水时间内致密型愈伤组织比松散型愈伤组织具有较高的存活率。随着脱水时间的延长,TTC相对存活率一直呈上升趋势;经过玻璃化法冻存后的玉米幼胚愈伤诱导率可达73％。冷冻保存后的幼胚和愈伤组织在恢复生长后,再经分化得到了大量的再生植株。     

南方红豆杉组织培养研究进展

阐述了组培微繁诱苗过程中不同外植体诱导愈伤组织的效果差别、培养基选取和优化、植物生长调节剂浓度和配比、生理碳源、光条件和小分子添加剂等因素的作用影响;从细胞次生代谢诱导和生物反应器应用两方面总结了细胞悬浮培养生产紫杉醇研究现状。此外,对南方红豆杉组织培养的主要问题和方向进行了探讨和展望。     

籼稻胚性愈伤组织继代培养基体系优化及愈伤组织褐化原因剖析

农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)介导的转化技术己广泛应用于粳稻品种(Oryza sativa ssp.japonica)中,但迄今未能找到适合于籼稻品种(O.sativa ssp.indica)高效遗传转化的农杆菌介导转化体系,籼稻品种的愈伤组织在继代过程中的严重褐化是最主要的制约因素之一.本研究以籼稻品种93-11为材料,通过响应面设计分析方法,进行二次多项式回归拟合,预测数学模型,研究2,4-二.氯苯氧基乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)浓度、N6-呋喃甲基腺嘌呤(kinetin,KT)浓度和碳源中蔗糖和麦芽糖的比例对籼稻品种愈伤组织诱导的影响,确定了最适宜93-11成熟胚诱导愈伤组织的培养基成分:以MS为基本培养基,添加2.92 mg/L 2,4-D、0.59 mg/L KT、16.37 g/L蔗糖和13.63 g/L麦芽糖;并以此优化培养基继代籼稻愈伤组织.为了研究93-11愈伤褐化的原因,采用组织学与解剖学方法,观察93-11正常愈伤组织和褐化愈伤组织.结果表明,两者的表观结构存在较大差异,正常愈伤组织表面粗糙,凹凸不平;褐化愈伤组织表面结构看似光滑,但是放大后发现这种平滑结构是由于所有细胞失去规则圆形变为无活性扁平状,且细胞不易成团,细胞之间空隙小而少形成的.用qRT-PCR技术分析了褐化相关基因在褐化愈伤组织中的表达情况,发现切伤后与褐化相关的基因生长素输入载体1基因(auxin1,AUX1)和蔗糖非依赖1蛋白激酶2基因(sucrose non-fermenting 1-related nrotein kinase 2,SnRK2)的表达量虽然都比较低,但是在93-11成熟胚诱导的正常愈伤组织和褐化愈伤组织中存在明显差异,而酚类物质氧化途径中与酚类物质合成的基因苯丙氨酸解氨酶基因(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)和多酚氧化酶基因(polyphenol oxidase,PPO)在正常愈伤组织还是褐化愈伤组织中都没有检测到表达量.发现组织培养切伤是愈伤组织褐化的主要原因,为进一步阐明愈伤组织的褐化机理提供参考.