利用RNA沉默抑制子HC-Pro提高基因表达的策略

利用植物生物反应器生产药用蛋白具有独特的发展优势,但外源基因在受体内会发生基因沉默现象而影响基因的表达。由于基因沉默抑制子能有效抑制外源基因的沉默反应,本研究利用沉默抑制子蚜传辅助因子(helper component-proteinase,HC-Pro)转基因烟草有效提高了外源基因的表达。采用叶片注射法将携带表达载体p35S-30B-GFP的农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)重悬液分别侵染野生型烟草(Nicotiana bentamiana)和HC-Pro转基因烟草(N.bentamiana),通过蛋白电泳检测和Western blot检测技术对绿色荧光蛋白(GFP)表达进行比较。研究结果表明,与野生型烟草Nb相比,HC-Pro转基因烟草中GFP的表达水平显著增加。本研究为基因沉默抑制子在植物生物反应器中的应用提供了理论依据。     

过表达SlMPK3基因提高番茄低温耐受能力

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK/MPK)级联是植物响应外界环境变化的重要信号传导途径.为了验证番茄促分裂原活化蛋白激酶3(Solanum lycopersicum mitogenactivated protein kinases 3,S1MPK3)在低温胁迫中的功能,本研究将醋栗番茄(Solanum pimpinellifolium)SlMPK3基因在栽培番茄(S.lycopersicum)M82中过表达,获得了过表达SlMPK3的转基因番茄后代.结果表明,低温胁迫下转基因番茄幼苗SlMPK3基因被迅速诱导表达.低温处理8h处,SlMPK3的表达量达到最大值,转基因植株(OE4,OE6和OE7)中SlMPK3的表达量显著高于野生型(P＜0.05).苗期耐冷性鉴定结果表明,转基因植株耐冷指数(OE4(0.81),OE6 (0.78),OE7(0.77))显著高于对照((0.37),P＜0.05).低温胁迫下表型观察发现,4℃低温胁迫24 h,野生型番茄叶片边缘失水萎蔫,叶面出现明显黄色枯斑;转基因番茄植株叶片表现正常.低温胁迫120 h后,野生型植株的相对电解质渗透率为74.66％,而转基因植株的电解质渗透率平均为59.79％,比对照低14.87％;转基因植株叶片中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量为6.76 μmol/g FW,比对照(9.77 μmol/g FW)低30.81％;野生型植株叶片中的H2O2含量显著高于转基因植株(P＜0.05),比转基因植株高22.02％.低温胁迫处理引起了转基因植株和野生型植株的抗氧化酶(antioxidant enzymes,AOEs)活性显著增加(P＜0.05),低温处理120 h后,转基因植株中超氧化物歧化酶(super-oxide dismutase,SOD)、过氧化物酶(peroxidase,POD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性分别比对照高29.40％、24.24％和22.83％.转基因和野生型植株中可溶性蛋白(soluble protein)和可溶性糖(soluble sugar)含量均随低温处理时间的推移逐步增加,4℃处理120 h后转基因植株可溶性蛋白含量为40.02 mg/g FW (OE-4),42.21 mg/g FW (OE-6)和40.33 mg/g FW (OE-7),显著高于对照(36.86 mg/g FW)(P＜0.05);转基因植株可溶性糖含量平均为51.87 mmol/g FW,比对照高21.82％.本研究证明,SlMPK3过表达提高了番茄植株的低温耐受能力,为进一步研究番茄SlMPK3基因的功能提供依据,同时为耐低温番茄育种提供了新种质.     

利用拟南芥rd29A启动子驱动AtNHX1基因提高烟草耐盐性

拟南芥液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(AtNHXl)在植物耐盐机制中有重要作用.为了鉴定AtNHX1基因功能和创制耐盐烟草新种质,本研究用农杆菌介导法将rd29A启动子驱动的AtNHX1基因导入烟草(Nicotiana tabacum L.),获得72株卡那霉素抗性再生植株,17株在MS+85.5 mmol/L NaC1培养基上生长良好.对其进行PCR、Southern杂交和Northern杂交检测,证实AtNHX1基因已整合到烟草基因组中,并进行正常转录,且其转录受盐逆境的诱导.在含盐(85.5、171、256和342 mmol/L NaCl)培养基上进行对照植株和转基因植株生长及叶片丙二醛含量的分析,结果显示,转基因株系的生长势和根发生能力明显优于对照,且叶片丙二醛含量显著低于对照,表明rd29A启动子驱动AtNHX1基因的导入和表达可显著提高转基因烟草植株的耐盐性.结果提示rd29A启动子驱动的AtNHX1基因表达单元可在异源植物中正常转录和表达,可用于植物耐盐基因工程育种.     

转PSAG12-BAS1基因抑制烟草叶片的衰老

衰老被认为是烟草(icotiana tabac um)叶片发育的最后阶段,伴随着叶绿素,脂类等降解,严重影响了光合产物的积累,导致作物产量降低、品质下降.因此,利用转基因技术使烟草在生长期间衰老延迟,光合产物量增加,从而增加产量,同时在收获之后,延缓衰老的叶片,可以维持烟草的新鲜程度,解决储存及运输问题.本研究利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化法将含有衰老相关基因12 (senescence-associated gene 12,SAG12)启动子驱动光敏色素B激活标签的抑制蛋白1(phyB activationtagged suppressor1,BAS1)基因表达的元件导入烟草中,经抗性筛选和PCR鉴定,共获得45株转基因植株,其中有8株转基因烟草叶片具有衰老延缓现象.在叶片开始衰老时对野生型和转BAS1基因烟草叶片叶绿素含量、保护酶活性检测以及植物生长期状态进行观察测定,结果表明,转BAS1烟草植株叶绿素含量从顶端到基部均高于野生型;野生型和转BAS1基因烟草超氧化物歧化酶(super-oxide dismutase,SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量分析表明,转BAS1烟草植株中SOD活性比野生型高了31.98％,MDA含量比野生型降低了48.28％,通过对烟草生长发育过程观察,转基因烟草比野生型烟草衰老延缓10～15 d.在烟草叶片开始衰老时测定野生型和转BAS1基因植物细胞分裂素含量,结果发现,野生型烟草细胞分裂素的含量比转基因烟草降低了40.2％,上述结果说明,转BAS1基因延缓了烟草叶片的衰老,与细胞分裂素含量、保护性酶活性提高以及衰老性启动子启动有关.本研究为进一步研究SAG12-BAS1基因功能机制提供理论依据,同时该基因为创制转基因抗衰老材料提供了基础.     

大丽轮枝菌蛋白激发子PevD1诱导的烟草对烟草花叶病毒(TMV)系统获得性抗性及其分子机制

从大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的胞外分泌物中分离到一种蛋白激发子PevD1 (UniProtKB accession No.P86840).为了明确该蛋白激发子的特性以及诱导植物抗病的机制,本研究在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达了重组蛋白6His-PevD1.该重组蛋白激发子可以引起烟草(Nicotiana tabacum cv.Samsun-NN)悬浮细胞死亡,提高烟草植株对烟草花叶病毒(TMV)的系统获得抗性(SAR),枯斑抑制率最高可达46.64％.重组蛋白激发子处理后的烟草叶片中的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)活性均有大幅度提高.处理后144 h PAL活性最大,是对照的3.3倍;处理后120 h,PPO和POD活性分别增加236.8％和204.6％.PevD1可以诱导抗性相关基因酸性病程相关基因1(acid pathogenesis-related gene 1,PR1-a)、碱性病程相关基因1(basic pathogenesis-related gene 1,PR1-b)、病程相关基因非表达子1(nonexpressor ofpathogenesis-related gene 1,NPR1)和苯丙氨酸解氨酶基因(phenylalanine ammonia lyase gene,PAL)的表达.研究表明,防御相关酶的活性提高和抗病相关基因的诱导表达是PevD1诱导烟草产生系统性抗性的主要机制.     

高粱SbSKIP基因的克隆及其在烟草中的抗旱功能分析

SKIP(ski-interacting protein)是一种RNA代谢相关蛋白,在植物抵抗非生物胁迫伤害中起着很重要的调节作用,本研究克隆了高粱(Sorghum bicolor)SbSKIP基因,cDNA编码区全长1 485 bp,编码494个氨基酸;进化树分析表明,高粱SbSKIP基因编码的氨基酸序列与节节麦(Aegilops tauschii)相似性为52％;定量PCR分析表明,在模拟干旱条件下SbSKIP基因表达量上调,在干旱处理16h后,表达量显著增加了2倍以上.构建植物表达载体pSH-SbSKIP,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘法遗传转化烟草(Nicotiana tabacum),获得25个转基因植株.选取3个不同株系TP4、TP9和TP13,在不同浓度甘露醇模拟干旱条件下对种子发芽率和幼苗期进行抗旱性分析,结果发现,在300 mmol/L甘露醇处理10d,种子的发芽率比野生型高60％以上,而且从苗期根的生长发现,野生型根的生长明显受到抑制.在自然条件下生长的烟草幼苗,用20％ PEG 6000处理14d,结果显示,转基因烟草正常生长,而野生型烟草大部分叶片黄化甚至出现萎蔫,其中转基因植株超氧化物歧化酶(super-oxide dismutase,SOD)的平均活性值比野生型高91.2％,H2O2和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量分别比野生型降低了42％和32.7％,可溶性糖(soluble sugar)含量达野生型的1.1倍.结果表明,SbSKIP基因表达提高了烟草植株的干旱耐受能力.本研究为进一步研究SbSKIP基因功能提供依据,同时该基因的克隆和功能分析可为创制转基因抗旱材料提供基础资料.     

高温胁迫对淮阴苜蓿差异蛋白表达及生理的影响

为进一步了解紫花苜蓿在高温胁迫下的生理变化和相关差异蛋白表达情况,本研究以淮阴苜蓿(Medicago sativa L.cv.Huaiyin)为材料,以25℃为对照,对30℃、35℃和40℃不同高温胁迫下,淮阴苜蓿不同时期(0 h、0.5 h、1 h、4 h、12 h和24 h)幼苗叶片的电导率、丙二醛(MDA)、细胞活力的动态变化进行监测,并进一步对35℃和40℃高温处理24 h的幼苗叶片差异表达蛋白进行筛选、分析和鉴定研究。结果发现,淮阴苜蓿在35℃和40℃高温下,生长0.5 h,叶片的电导率含量开始急剧上升,1 h后电导率下降,并随着处理时间的延长,电导率变化趋缓;生长1 h时,叶片的MDA含量较高,4 h后MDA含量平缓下降;细胞活力随着时间的延长总体表现出下降的趋势。差异蛋白点筛选分析结果显示,在35℃处理24 h时,有27个点存在显著差异,其中19个点是上调的,与对照图谱相比,新增了5个特殊的蛋白点。在40℃处理24 h时,有51个点存在显著差异,其中40个点是上调的,与对照图谱相比,新增了11个特殊的蛋白点。对40℃时51个蛋白点进行二级质谱鉴定发现,20 k D chaperonin、Hsp70、Hsp23和Hsp17这4个蛋白与防御机制有关,说明40℃诱导产生更多的防御蛋白,对膜系统损伤起到一定的修复功能。     

高温对红掌幼苗叶片茉莉酸浓度及抗氧化系统的影响

试验研究30℃和38℃高温处理对红掌幼苗叶片茉莉酸(JAs)浓度及抗氧化系统的影响,结果表明:38℃高温处理6h,叶片内JAs浓度急剧升高,其后又呈下降趋势,但其浓度仍高于对照;30℃高温处理12h,叶片内JAs浓度达最大值,之后随处理时间的延长而降低,但仍高于对照。高温处理后叶片抗氧化系统中的过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性均有不同程度升高,O 2含量在高温处理的前期有所降低,后期又逐渐升高。一定程度的高温处理可通过提高JAs浓度和抗氧化酶活性来提高红掌幼苗的抗热性。     

水稻白叶枯病菌蛋白质激发子HarpinXoo诱导植物的防卫反应

摘要：含质粒pHRF4的表达菌株BLHR4在培养基中经IPTG诱导，16 h Harpin表达接近最高量。用不同浓度的HarpinXoo喷雾处理烟草(Nicotiana tabacum L.)、油菜(Brassica campestris L.)和番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)，对烟草花叶病毒(TMV)、油菜菌核病(Sclerotinia sclerotiorum (lib.) de Bary)和番茄灰霉病(Botrytis cinerea Pers.)均表现较好的诱导抗病效果。以浓度为100μg/mL的HarpinXoo处理烟草后，分别测定叶片中与防卫反应相关的一些生理指标的变化，结果表明，处理叶片中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（PO）和多酚氧化酶（PPO）活性都有不同程度的增强。三种酶活性高峰分别在处理后24、12和3 h出现，分别比清水对照增加110.1%、211.2%和273.0%；同时，两个病程相关蛋白（pathogenesis-related protein，PR）基因PR-1b和PR-1a在HarpinXoo处理24 h后被诱导显著表达，36 h时达到最高表达水平。这表明HarpinXoo与HarpinEa一样能够诱导烟草不同抗病信号通路的启动，从而使植株获得抗病性。     

大豆叶绿体转化载体pJY系列的构建及其在烟草上的转化研究

为解决杂交大豆(Glycinemax)制种过程中不育系易与保持系混杂的问题,开展了大豆叶绿体转基因的研究。通过转基因方法在不育系的细胞质中植入筛选标记基因,以区分不育系和保持系。根据已发表的大豆叶绿体序列(GenBankX07675)设计引物,用PCR方法获得两段大豆叶绿体同源重组序列LHRR和RHRR,克隆到质粒pUC19中,并将来源于质粒pTF102的壮观霉素抗性基因aadA克隆到两段同源重组序列之间,以构建大豆叶绿体转化表达载体pJY01。aadA基因的启动子Prrn和终止子psbA基因3′序列,分别从烟草叶绿体基因组中扩增而来。在此基础上,将草丁膦抗性基因或绿色荧光蛋白与GUS的融合蛋白基因克隆到该载体上,得到pJY03与pJY04,并初步应用于烟草(Nicotianatobacum)的叶绿体转化,获得了具壮观霉素抗性的绿色愈伤和幼苗,PCR扩增出aadA基因的条带,并在激光共聚焦扫描下检测到GFP的表达。     

腺病毒介导的秦川牛固醇调节元件结合蛋白2基因(SREBP2)过表达载体的构建与鉴定

固醇调节元件结合蛋白2（sterol regulatory element binding protein 2,SREBP2）属于碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链转录因子家族,在胆固醇的代谢过程中具有重要的调控作用。克隆秦川牛（Bos taurus）的SREBP2基因并构建相应腺病毒过表达载体,包装扩繁获得高滴度腺病毒,对于在细胞水平上研究SREBP2基因的功能和作用机制具有重要作用。本研究以秦川牛脂肪组织为实验材料,提取总RNA并反转录为cDNA,依据GenBank收录的牛的SREBP2基因（Accession No.NM₀01205600）mRNA序列设计引物,克隆出SREBP2基因编码区（coding sequence,CDS）全长。将SREBP2基因与穿梭载体连接构建pAdTrack-CMV-SREBP2表达载体,用PmeⅠ分别酶切线性化pAdTrack-CMV-SREBP2和空白对照pAdTrack-CMV载体并转化含有骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌（Escherichia coli）BJ5183感受态进行同源重组,得到腺病毒重组载体pAd-SREBP2和pAd-CMV,分别用PacⅠ酶切后胶回收DNA大片段,并将回收产物转染293A细胞包装得到腺病毒Ad-SREBP2和Ad-CMV,增殖并提高病毒滴度,得到高滴度病毒后,用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记法测定显示Ad-SREBP2和Ad-CMV的病毒滴度分别为7×108和1.3×109GFU/mL。将Ad-SREBP2和Ad-CMV腺病毒侵染秦川牛前体脂肪细胞检测病毒的有效性,实时定量PCR检测结果显示,侵染48h时SREBP2基因的表达量提高了102.3倍。本研究成功克隆了秦川牛的SREBP2基因,构建了病毒重组体,包装增殖获得了高滴度病毒,为在细胞水平上基因功能的研究提供了基础资料。     

谷子CIPK基因(Seita.5G145900)对非生物逆境的响应

在谷子基因组中鉴定出一个CIPK(Seita.5G145900,命名为SiCIPK19)基因。为揭示SiCIPK19对逆境胁迫的响应,对其基因结构、蛋白特征、功能、进化等性状进行了系统的分析和预测,并用实时定量PCR(RT-qPCR)检测了其在谷子苗期不同逆境及关键生育期干旱胁迫下的表达。结果表明,SiCIPK19基因位于谷子5号染色体,基因组序列长1 353 bp,编码450个氨基酸,基因无可变剪切,且不含内含子。功能域分析和多序列比对发现,SiCIPK19蛋白具有非常保守的序列结构,与其他植物CIPK蛋白也非常相似。RT-qPCR分析表明,SiCIPK19基因被聚乙二醇6000(PEG 6000)、ABA、高盐和低温胁迫强烈诱导。此外,SiCIPK19基因在谷子拔节期、抽穗期和灌浆期干旱条件下参与了对干旱胁迫的响应,推测该基因参与谷子对非生物逆境的应答,尤其在抽穗期和灌浆期干旱胁迫应答中发挥重要作用。本研究结果为进一步分析CIPK基因逆境应答机制,以及利用基因工程方法改善谷子抗逆性和提高产量提供了理论支持。     

鸭脂肪型脂肪酸结合蛋白基因（A-FABP）内含子1序列多态性分析

根据鸭A-FABPmRNA序列和鸡A-FABP基因组序列设计1对引物扩增出鸭脂肪型脂肪酸结合蛋白基因(A-FABP)内含子1序列(GenBank登录号:FJ536257),并根据扩增产物设计4对引物,利用PCR-SSCP对鸭A-FABP基因部分序列进行SNP检测,且对不同鸭群体进行群体遗传学分析.结果表明:克隆序列包含鸭A-FABP基因外显子1、2部分序列和完整的内含子1序列,与鸡A-FABP基因内含子1同源性为75.1%;经SSCP检测,发现引物P1扩增片段有3处碱基突变,引物P3扩增片段有6处碱基突变,这些突变分别产生了3种和8种基因型.在P1位点樱桃谷鸭和苏牧麻鸭偏离了Hardy-Weinberg平衡(P0.05),在P3位点3个群体均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05).同时,这些基因型在不同鸭群体中分布存在显著或极显著差异(P<0.05或P<0.01).群体遗传学分析结果显示A-FABP基因在不同鸭群体中具有丰富的单核苷酸多态性,可以进一步作为候选基因来分析其与脂肪性状相关性.     

茶树生长素抑制蛋白基因CsARP1的克隆与表达分析

从茶树休眠芽抑制消减杂交文库中分离得到生长素抑制蛋白基因的3＇-片段,以休眠芽为材料,利用RACE技术克隆了其cDNA全长,并利用荧光定量PCR研究了该基因在不同休眠阶段芽的相对表达量。结果从茶树休眠芽中获得一个全长为711bp的生长素抑制蛋白基因CsARP1（GenBank登录号为HQ225758）。该基因开放阅读框...     

表达播娘蒿突变基因DsALS-108的抗苯磺隆甘蓝型油菜植株构建

利用化学杀雄剂如苯磺隆(tribenuron-methyl,TBM)除草剂诱导雄性不育,是甘蓝型油菜(Brassicanapus)杂种优势应用的主要途径之一.选育具有TBM除草剂抗性的甘蓝型油菜作为父本,有利于简化制种程序,降低制种成本,对提高甘蓝型油菜的产量和品质具有重要意义.乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase,ALS)是合成支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)的关键酶.ALS抑制类除草剂以乙酰乳酸合成酶为靶标,通过抑制其活性阻碍支链氨基酸的合成,导致植株死亡.TBM属于一种磺酰脲类(sulfonylureas,SU) ALS抑制类除草剂.为了改良甘蓝型油菜抗除草剂的遗传特性,本研究首先从一个抗TBM除草剂的播娘蒿(Descurainia sophia)天然突变体(#108)中克隆了ALS基因(GenBank登录号:EU520490),命名为DsALS-108.和拟南芥(Arabidopsis thaliana)乙酰乳酸合成酶AtALS蛋白序列的比对结果显示,保守氨基酸位点脯氨酸197在突变型蛋白DsALS-108中替换为苏氨酸(即P197T).为了验证含有P197T突变的DsALS-108基因是否使植株产生TBM除草剂抗性的原因,构建表达载体PBI 121-DsALS-108,并通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将该载体转化拟南芥,共获得12个阳性转基因株系.喷洒浓度大于等于1.0× 10-4 g/L TBM后,野生型植株停止生长,趋于死亡,而拟南芥转化植株均能正常生长,说明表达突变基因DsA LS-108致使拟南芥植株抗TBM除草剂.在甘蓝型油菜转化中,以下胚轴为外植体,通过农杆菌介导法将载体pCAMBIA3301-DsALS-108导入甘蓝型油菜中,共获得23个阳性转基因株系.结果发现,DsALS-108的表达使甘蓝型油菜对苯磺隆的抗性提高至野生型致死浓度的3倍,即7.5×10-3g/L.而且,当用化学杀雄使用剂量(0.05 mg/L TBM)处理甘蓝型油菜转化植株后,其花粉育性正常,说明该转化植株可作为父本应用于化学诱导的雄性不育系统,进行杂交制种.本研究为利用化学诱导的雄性不育系统实现杂种优势提供新材料.     

翻译调节肿瘤蛋白(TCTP)与细胞生长调控

翻译调节肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)是一个在物种间高度保守、广谱表达和多功能的蛋白质,具有调节细胞骨架的动态变化和调节细胞的生长与增殖的作用；能够激活干细胞标记基因Oct4和Nanog的转录；调节细胞凋亡、肿瘤逆转、细胞分化、炎症反应和保护细胞免受多种应激的损伤等.本文综述了TCTP的结构、表达调控、生物学功能等研究进展.     

灯盏花乙素(Scu)对猪肾小管上皮细胞(LLC-PK1)细胞热休克蛋白72(HSP72)及凋亡相关基因表达的影响

灯盏花乙素(scutellarin,Scu)具有清热解毒、扩张心脑血管、改善微循环等作用。通过观察不同浓度Scu对猪肾小管上皮细胞(pig kidney proximal tubular,LLC-PK1)热休克蛋白72(heat shock protein72,HSP72)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cellymphoma/leukemia-2,Bcl-2)及Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associated X protein,Bax)表达的影响,探讨灯盏花乙素提高细胞耐热性的可能机制。将培养的LLC-PK1细胞随机分为37℃空白对照(Ⅰ组),42℃单纯热应激1 h(Ⅱ组),以及分别用不同浓度(1×10-5、1×10-6和1×10-7mol/L)Scu处理并42℃热应激1 h组(分别为Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组),提取各组细胞总RNA和总蛋白,用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测HSP72、Bcl-2和Bax基因及蛋白的表达量。结果显示,与Ⅰ组相比,Ⅱ组LLC-PK1细胞HSP72和Bax的mRNA及蛋白表达量显著升高(P0.05),Bcl-2/Bax mRNA和蛋白比值显著降低(P0.05),Bcl-2 mRNA和蛋白表达量并无显著差异(P0.05)。与Ⅱ组相比,Ⅳ和Ⅴ组LLCPK1细胞HSP72 mRNA和蛋白的表达量均显著升高(P0.05),Ⅲ组无显著差异(P0.05);Ⅳ组细胞Bcl-2 mRNA和蛋白表达量均显著升高(P0.05),Ⅲ和Ⅳ组并无显著差异(P0.05);Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组Bax mRNA和蛋白表达量均显著降低(P0.05);Ⅳ和Ⅴ组Bcl-2/Bax蛋白比值显著升高(P0.05)。研究结果表明,热应激条件下Scu可诱导LLC-PK1细胞HSP72表达,提高Bcl-2/Bax比值。结果提示,Scu可增强细胞的抗热休克作用。本研究丰富了体外培养细胞热应激反应的理论,为在实践中增加细胞抗热休克能力提供了理论依据。     

牛血管生成素样蛋白4基因(ANGPTL4)编码区SNPs检测及其与南阳牛生长性状的相关性

牛血管生成素样蛋白4(Angiopoietin-like protein4,ANGPTL4)是一种与脂肪代谢相关的分泌蛋白,为研究ANGPTL4基因在调节脂肪和能量代谢中的作用,本实验采用DNA测序技术和PCR-RFLP技术,对南阳牛、郏县红牛、鲁西牛、秦川牛共计789头个体该基因的多态性进行了分析,并对检测到的多态位点与南阳牛的生长性状进行了相关性分析。多态性检测结果显示,该基因(NC_007305.4)第3和第5外显子各存在1处SNP(1422T>C,4899C>T),分别为错义和同义突变。相关性分析结果表明,2处突变位点不同基因型对南阳牛12月龄平均日增重均有显著影响(P<0.05);且第3外显子突变位点不同基因型对南阳牛12月龄体重指标也有显著影响(P<0.05)。研究结果提示,该基因2处突变位点有可能对牛的生长性状产生影响,可作为牛潜在分析育种标记。     

梅山猪氨肽酶基因N(pAPN)cDNA克隆、序列分析及重要变异位点的筛选

氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)蛋白是猪(Sus scrofa)传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪的流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)等一系列冠状病毒的受体蛋白。为探讨梅山猪APN基因的分子结构特征以及重要的变异位点,本研究通过PCR扩增和测序技术,结合生物信息学分析梅山猪APN基因功能区域和重要变异位点,对其蛋白质结构进行预测和分析。结果表明,梅山猪APN基因cDNA全长2 886 bp(GenBank登录号:KF280271),含有20个外显子,编码961个氨基酸。与GenBank数据库公布的标准序列(登录号:NM_214277.1)相比,梅山猪APN基因编码区变异共引起10处氨基酸突变与2处氨基酸缺失,其中Phe82Asn、Leu107Phe、Leu108 Ile、Ser330Pro、Trp399Arg和Glu465 Gly等6处突变位于APN酶催化活性区域,Gln747His突变、748Tyr和749Ser缺失突变位于APN病毒结合区域。蛋白结构和编码产物功能分析发现,pAPN为不稳定的亲水性蛋白,无信号肽,具有1个跨膜螺旋(跨膜区位于12~34氨基酸,二级结构元件以α螺旋和β折叠为主,编码产物主要参与细胞被膜(cell envelope)、中央中间代谢(central intermediary metabolism)、辅酶因子生物合成(biosynthesis of cofactors)等功能。Gln747His、748Tyr和749Ser缺失突变可能与氨肽酶N结合病毒能力有关。本研究对梅山猪pAPN基因功能的分析及变异位点的筛选,为今后筛选猪抗病毒性腹泻的有效遗传标记提供理论基础。     

黄芩苷对热应激条件下猪近端肾小管(LLC-PK1)细胞凋亡率及B细胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白基因(Bax)表达的影响

为探讨不同浓度黄芩苷对热应激条件下猪近端肾小管细胞(pig kidney proximal tubular cells,LLC-PK1)细胞凋亡率及B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cellymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白基因(Bcl-2 associated X protein,Bax)表达的影响,将培养的LLC-PK1细胞随机分为7个组,Ⅰ组为37℃空白对照组,Ⅱ组为42℃单纯热应激1 h组,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ组分别为用不同浓度黄芩苷(0.01、0.1、1、10和100μg/m L)处理组后42℃热应激1 h组,运用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测Bcl-2和Bax基因及蛋白的表达,流式细胞仪(Annexin V-FITC/PI双染法)检测细胞凋亡率。结果表明,与Ⅰ组相比,Ⅱ组能显著诱导LLC-PK1细胞Bcl-2 m RNA的表达(P0.05),极显著诱导细胞Bax m RNA和蛋白的表达(P0.01),能极显著降低细胞Bcl-2和Bax m RNA和蛋白的比值(P0.01),极显著增加细胞凋亡率(P0.01),但对细胞Bcl-2蛋白的表达无显著影响(P0.05)。黄芩苷处理组与Ⅱ组相比,Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组LLC-PK1细胞Bcl-2 m RNA的表达量均升高,其中Ⅴ组差异极显著(P0.01),Ⅳ及Ⅵ组差异显著(P0.05),Ⅲ及Ⅶ组差异不显著(P0.05),而细胞Bcl-2蛋白的表达量与Ⅱ组相比均差异不显著(P0.05);同样与Ⅱ组相比,黄芩苷处理的各组细胞Bax m RNA及蛋白的表达量均降低,其中Ⅴ及Ⅵ组差异极显著(P0.01),其余各组差异显著(P0.05);除Ⅲ组外,其他各组细胞Bcl-2和Bax m RNA及蛋白的比值与Ⅱ组相比均显著升高(P0.05),其中Ⅴ组细胞Bcl-2和Bax蛋白的比值差异极显著(P0.01);细胞凋亡率仅有Ⅲ组与Ⅱ组相比差异不显著(P0.05),而Ⅴ及Ⅵ组细胞凋亡率极显著低于Ⅱ组(P0.01),其余的Ⅳ和Ⅶ组显著低于Ⅱ组(P0.05)。一定浓度范围内的黄芩苷(0.1~100μg/m L)可能通过下调热应激条件下LLC-PK1细胞Bax的表达,从而提高Bcl-2和Bax的比值,降低细胞的凋亡率,对细胞起到保护作用。本研究从分子水平研究黄芩苷缓解热应激对猪LLC-PK1细胞的损害作用,可为明确其解热机制提供理论基础,并为其在临床上的应用提供有价值的参考资料。