新生物催化剂的筛选与开发

生物催化剂是具有催化作用的游离或固定化细胞和游离或固定化酶的统称。目前,筛选新生物催化剂的方法有两种:一是从环境样品中筛选全新的生物催化剂;二是探索现有生物催化剂的非天然新活力。本文详细综述了筛选新生物催化剂的方法及策略,并着重介绍了从微生物源开发新生物催化剂的方法。     

pEGFP-loxP-Lox2272载体的构建及牛胎儿转基因阳性细胞筛选程序的优化

绿色荧光蛋白(GFP)是一种分选细胞的理想标记,将绿色荧光蛋白基因定点整合到牛的Y染色体上是利用GFP分选X和Y精子的关键.本研究通过特殊的引物设计和高保真酶PCR扩增将loxp位点和Lox2272位点引入pEGFP-N3载体中,构建了重组质粒pEGFP-loxp-Lox2272.采用LipofectamineTM (Lip)2000介导线性化质粒p EGFP-loxp-Lox22 72转染牛胎儿成纤维细胞,结果显示,在质粒用量一定的情况下30μL Lip 2000转染细胞的效果最理想;转染后的牛胎儿成纤维细胞用G418筛选,结果显示,浓度为600μg/mL的G418最适合筛选转基因细胞.本实验的结果为载体改造提供了一种有效的方法并为牛体细胞基因打靶阳性细胞系的筛选提供了重要的技术参考.     

分解秸秆纤维素菌群的发酵及保存方法

探索一种简洁、高效的秸秆纤维素分解菌的发酵及保存方法,便于后续的秸秆沼气开发应用。将中国农业大学生物质工程中心前期工作中筛选到的一组纤维素分解菌（ADS-3）作为供试菌种,分别用5种培养基分别进行菌种发酵,通过测定各发酵液总DNA浓度,并采用基于16Sr RNA基因的变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术比较其微生物组成,综合评定最优培养基;将最适培养基发酵后的产物分别用“秸秆粉吸附风干”、“秸秆粉吸附冷冻干燥”和“直接冷冻干燥”3种方法保存,在6个月的保存过程中,通过测定各产物保存的pH值和复壮后对秸秆的降解效果,及比较处理间微生物组成,评定适宜的保存方法。结果表明：改良Czapek培养基的发酵质量最好,其微生物组成和供试菌种的相似率最高;保存方法“秸秆吸附冷冻干燥”的保存效果最好,其pH值在7.2和7.4之间与供试菌种最接近、复壮后分解能力和原供试菌种无显著差异,微生物组成和供试菌种相似率最高,且和“直接冷冻干燥”相比具有成本低的优势。该研究为纤维素菌群的进一步利用提供了研究基础。     

土壤微生物群落多样性研究方法及进展

微生物多样性是指群落中的微生物种群类型和数量、种的丰度和均度以及种的分布情况。研究土壤微生物群落多样性的方法包括传统的以生化技术为基础的方法(直接平板计数、单碳源利用模式等)和以现代分子生物技术为基础的方法(从土壤中提取DNA,进行G C%含量的分析,或杂交分析,或进行PCR,产物再进行DGGE/TGGE等分析)。现代生物技术与传统微生物研究方法的结合使用,为更全面地理解土壤微生物群落的多样性和生态功能提供了良好的前景。     

叠氮溴化丙锭筛选环境活性微生物的原理及其应用

环境微生物总DNA主要来源于游离DNA以及活性和非活性微生物群。因此,单纯基于环境微生物总DNA的直接研究技术可能无法反映出环境中真实的活性微生物群落结构及组成,极易造成微生物丰度及群落多样性的高估,急需建立有效可行的活性微生物筛选方法。叠氮溴化丙锭(Propidium monoazide,PMA)是一种能够不可逆地共价结合死细胞DNA和胞外DNA (统称为relic DNA)的光敏性核酸染料,致使relic DNA被钝化,不能完成PCR扩增。基于此,结合后续荧光定量PCR和高通量测序等分子生物学技术,可快速、准确且高效地筛选区分出环境样本中的活性微生物类群。本文针对近几年关于PMA染料法在底泥、土壤和水体等常见环境样品中的应用研究结果进行综述,并探讨了目前PMA染料法应用中存在的问题,提出了相应的改进和完善对策,为深入研究复杂环境样品活性微生物类群及其结构功能提供了新思路。     

多功能地衣真菌的筛选及其复合菌剂的研制

为了从地衣真菌中筛选高效多功能菌种,研制出高效的微生物菌肥,对地衣真菌采用水解圈法初筛,再分别采用DNS法、钼锑抗比色法、平板对峙法复筛出具有高效降解纤维素、溶解无机磷、抑制病原菌活性的菌株;以不同的菌株组合研制生物菌剂,并进行盆栽试验筛选出促生活性最好的组合。从120株地衣真菌中筛选出高效降解的纤维素菌株为1905-2、1909-7、1913-6、1915-2,其中菌株1905-2和1915-2兼具有抑制病原菌的活性;高效溶磷菌株为1905-4,同时具有抑制病原菌的活性。结合形态学及分子序列鉴定菌株1905-2为高山弯颈霉(Tolypocladium tropicale),1905-4为塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis),1909-7为黄曲霉(Aspergillus aflatoxiformans),1913-6为产黄青霉(Penicillium chrysogenum),1915-2为淡紫拟青霉菌(Purpureocillium lilacinum)。组合5(1905-4、1915-2)在增加茎长和鲜重上占有优势,且溶磷效果及降解纤维素效果最好,因此综合选取以组合5研制的生物菌剂作为最终的微生物菌剂。从地衣真菌筛选出高效功能菌株,复合后研制出具有高效降解纤维素、溶解无机磷、抑制病原菌的复合菌剂,旨在为微生物资源的开发与利用、探究研制高产的生态菌肥提供理论基础。     

环境微生物基因组学的生态学管窥

自然界约99%的微生物不能通过传统的分离筛选途径进行培养(即未培养微生物),为获得新的基因资源,更全面地认识微生物多样性和微生物在自然环境和生物圈中的重要作用,近年来随着分子生物学的快速发展及其在微生物研究中的广泛运用,以环境中未培养微生物为研究对象的新兴学科--环境微生物基因组学成为国内外学者的研究热点.本文介绍了环境微生物基因组学的分析研究策略及生态作用:从环境样品中直接提取所有微生物的总DNA,采用适宜的载体克隆到宿主细胞中构建宏基因组文库,再筛选新的活性物质或基因;从生态学角度分析微生物不可培养的原因,可利用环境微生物基因组技术进行土壤污染修复、畜禽养殖除臭、鉴定新物种以及确定特定生态环境体系中未培养微生物种群与群落的结构组成及物种的进化模式.     

白酒糟纤维素降解菌的优选及酒糟降解工艺

白酒酿造行业产生的酒糟含有大量纤维素,不仅原料利用率低,而且丢弃的酒糟会对环境产生污染。为了获得酒糟纤维素降解能力强的微生物并进行应用,从酱香型酒醅、清香型酒醅、浓香型大曲、竹林里的土壤腐殖质中分离筛选酒糟纤维素降解菌,并对菌种分类、理化特征和降解酒糟的特性进行研究。pH值、温度和酒精胁迫性试验进一步确定了最佳酒糟纤维素降解菌为B2菌株,该菌株在pH值3.0、温度44℃、酒精含量为体积分数4%环境中生长良好。基于形态学、生理生化和分子生物学分析,鉴定B2菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在单因素试验结果的基础上,采用Box-Benhnken响应面法进行优化,确定了B2菌株降解酒糟的最佳工艺条件为酒糟添加量71 g/L、温度37℃、pH值6.4、接种量8%,此时酒糟降解率为15.23%。该研究丰富了酒糟纤维素降解菌的微生物资源库,同时为酒糟的资源化利用提供技术参考。     

反硝化微生物分子生态学技术及相关研究进展

反硝化是微生物以氮氧化物作为电子受体产生能量的过程。由微生物推动的反硝化使地球生物圈中被固定的氮素重新回到大气中去,从而实现整个自然界的氮素循环。反硝化作用与人类的生产、生活密切相关,它能使江河湖海脱除氮素富营养化而得以净化,也能使农田氮肥反硝化流失造成重大经济损失。多年来,基于培养技术的传统微生物研究方法很难了解环境中的反硝化微生物,因为人们目前能够培养的微生物不足环境微生物总量的3%。近年来,分子生物学和现代生物技术的迅猛发展极大地推动了环境微生物学的发展,人们可以直接提取环境DNA、通过分子标记和多种技术研究环境微生物。本文综述了环境反硝化微生物的分子生态学研究技术及国内外相关领域的研究进展。     

植物体细胞无性系变异的研究与应用

本文综述了有关植物体细胞无性系变异的类型、机理、筛选与鉴定方法等方面的研究成果,并对其在新品种培育中的应用现状和前景进行了讨论。     

不同小麦基因型耐铝性的差异及筛选方法的研究

采用了大体积溶液培养法、培养皿快速鉴定法和小盆钵土培筛选法对小麦基因型进行了耐铝性筛选。供试的 24个小麦基因型的耐铝性存在极显著的差异。所采用的各项筛选指标间呈极显著的正相关 ,且都能不同程度地区分基因型间的耐铝性差异。其中相对根长的SD、CV及分布范围最大 ,可以灵敏、可靠地反映不同基因型的耐铝性差异 ;其次是相对根系干重 ;相对株高和相对地上部干重的SD、CV及分布范围较小 ,反映基因型间耐铝性差异的灵敏度较低。 3种筛选方法能克服传统筛选方法如小体积溶液培养、土培和田间试验的繁琐、费时和筛选效率低等缺点 ,具有快速简便 ,一次可筛选较多样本 ,且条件易于控制等优点 ,大大地提高了筛选的可靠性和筛选效率。     

空间环境诱发作物突变的筛选技术及其应用

本文综述了作物经过空间诱变后的突变分析鉴定技术及其应用。分析鉴定技术主要包括:形态学鉴定技术、细胞学鉴定技术、物理学鉴定技术、同工酶鉴定技术、生理指标鉴定技术、分子标记鉴定技术以及其他一些鉴定技术,同时综述了各种鉴定技术在水稻、玉米、小麦、番茄、辣椒、油菜等作物上的应用情况。     

利用扩孔筛分提高物料筛分效率

研究了利用扩孔筛分提高筛分效率的方法,结果表明：在允许少量误筛时,扩孔筛分法无论在平面筛上,还是在圆筒筛内都是完全可行的;它具有快速、高效等特点,能够极大地提高物料筛分的效率;并根据扩孔筛分法的特点,提出了一个综合评价指标——筛分有效系数,为扩孔筛分的合理选取及评价筛分方案的好坏提供了依据和手段。     

多轮次筛选选育高酚酸耐受性丁醇生产菌

纤维原料预处理过程中会产生酚酸等抑制菌株生长的物质,为选育出高丁醇产量及高耐受酚酸胁迫丁醇生产菌株,该研究利用多因子复合筛选策略筛选出一株能够合成足够还原力与对丁醇耐受性较好的菌株Clostridium beijerinckii W6。通过丁醇胁迫适应性进化获得丁醇耐受菌W6-1,其丁醇和总溶剂产量相较于菌株W6分别提高了14.01%和16.85%。通过紫外诱变处理菌株W6-1并结合理性筛选模型最终获得丁醇产量较高菌株W6-2,其丁醇及总溶剂产量分别可达到（9.51±0.06）和（15.32±0.11）g/L。最后将菌株W6-2通过酚酸胁迫适应性进化得到突变菌W6-3,其能耐受1.0 g/L酚酸胁迫环境,且丁醇和总溶剂产量相较于菌株W6-2分别提高了18.17%和17.49%。当以葛渣水解液为底物进行丙酮丁醇发酵时,突变菌W6-3的丁醇产量达（8.54±0.31）g/L,相较于菌株W6-2提高了26.71%。经多轮次诱变及适应性进化处理获得的突变菌的酚酸耐受性及发酵性能均有较大提高,该文所采用的多轮次筛选方法可以为其他快速筛选优良生产菌提供可靠的理论参考。     

基于层次分析法和模糊综合评价的沼气工程技术筛选

不同沼气工程技术对地域自然条件、环境制约条件、原料种类等因素的适应性有较大差异,科学客观的沼气工程技术筛选方法,是保证沼气工程长期稳定发挥其最大能效的重要基础。该文提出了基于层次分析法(analytic hierarchy process,AHP)和模糊综合评价的沼气工程技术筛选方法和决策流程,构建了沼气工程技术筛选的指标体系;以领域专家实地调查结果为基础,通过AHP法获得沼气工程技术筛选不同指标的权重,然后采用模糊综合评价方法对沼气工程技术进行排序。利用该方法筛选的结果与武汉地区的实际运行效果一致。采用AHP和模糊综合评价方法相结合解决复杂的多因素决策问题,既能克服AHP指标不易量化的主观性,又能避免模糊综合评价方法对指标权重的忽视,可为沼气工程技术筛选提供科学方法。     

水蜜桃酒速酿酵母菌的筛选、鉴定及发酵条件优化

为获得快速酿造水蜜桃酒的专用酵母菌株,生产优质水蜜桃酒,以水蜜桃自然发酵醪为筛菌原料,通过TTC显色法与杜氏小管法初筛;再经耐酒精能力、发酵速度与产酒能力以及发酵液风味分析与感官评定三级复筛,获得了优质高效的酿酒酵母菌PY01(Saccharomyces cerevisiae PY01);并以初始pH值、主发酵温度、酵母接种量为自变量,以酒精度为响应值作酿酒工艺的响应面优化。结果表明,PY01菌株发酵水蜜桃酒最适发酵参数为初始pH 值3.9,发酵温度26℃,酵母接种量6.2%。在此条件下发酵可得到酒精度为12.78% vol,总糖含量为6.71 g·L^-1,风味纯正,口感醇厚,典型性的半干型水蜜桃发酵酒。本研究结果为水蜜桃发酵酿酒产业菌种的选择与工艺优化提供了基础。     

SNP检测方法在动物研究中的应用

单核苷酸多态性(SNP)作为第三代分子标记技术,以其数量丰富、遗传稳定性高、易于快速自动化检测等优点备受关注。该文综述了基于不同原理的SNP分型检测方法,包括几种常见的测序技术、基于酶学及杂交原理的分析检测技术和基于色谱及质谱的相关技术。阐释了方法的原理、分析了方法的优缺点及适用范围。总结了目前在动物遗传育种、亲缘鉴定、动物品种及产品溯源等方面的应用研究现状。为下一步开发更灵敏准确、简便易行、高通量及低成本的SNP检测方法及拓展SNP的应用领域提供参考。     

A critical review of current methods in earthworm ecology: From individuals to populations

Earthworms play an important role in the functioning of many terrestrial ecosystems, and while their importance is frequently acknowledged significant challenges still remain in determining their operant roles within the soil. This lack of knowledge becomes increasingly important as the spatial scale of analysis increases from individuals to populations within the landscape. To effectively develop understanding, research techniques must be able to determine the effects that earthworms have on the soil system, as well as to establish how many and which species are present. A range of techniques are required to facilitate meaningful analysis from the micro-scale within a soil profile (e.g. drilosphere effects) to a field scale or landscape scale. Furthermore, an additional framework of understanding is required to investigate the role of earthworms in the biogeochemical cycles.By critically evaluating recent advances in methods and data analysis techniques in three areas of earthworm research we highlight that combinations of common approaches often offer the most significant insights into the functional roles of earthworms within a soil system. Through particular reference to earthworm sampling and identification, biochemical functions and persistent pollutant ecotoxicology of temperate ecosystems we emphasise how a range of investigation methods can be a hindrance to developing a whole-system level understanding. The complex and diverse nature of soil systems means that a traditional compartmentalised approach studying single species using a single research technique is no longer sufficient to gain further insights into the earthworm contribution to ecosystem goods and services delivered at the whole landscape scale. The integration of technologically advanced methods in combination with systems based modelling will be critical to develop landscape scale understanding of the functions of earthworms as individuals and as populations within in their ecosystems.     

磷高效基因型玉米的筛选研究

田间试验表明,在中等肥力的土壤上,38个玉米自交系的产量频率分布基本符合正态分布,从中选择出22个典型,且具有代表性的自交系用于磷高效基因型的研究。结果表明,玉米的生物产量及子粒产量差异显著,在不施磷肥的条件下,综合考虑子粒减产率(耐低磷力)和高于平均产量的百分率(品种适应性)两项分级指标,筛选出4个磷高效的玉米自交系:交51、苏37、035 6、5311。经DPS系统的多因素分析,在玉米苗期进行品种筛选的重要指标是生物量、根冠比及叶面积指数,其累积贡献率达到95%,但磷浓度、磷吸收效率和磷利用效率的累积贡献率不足5%,难以作为磷高效基因型玉米的筛选指标。