芒果叶提取物体外抑菌及抑制鸡新城疫病毒增殖试验研究

进行了芒果叶水提物对部分畜禽常见致病菌的体外抑制试验以及对10日龄鸡胚人工感染鸡新城疫病毒(NDV)的抑制试验。抑菌试验结果表明,芒果叶水提物对大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、鸡白痢沙门氏菌、猪丹毒杆菌43-6混43-8、金色葡萄球菌86003、鸭疫里默氏杆菌、链球菌等致病菌有良好的抑菌效果。抑制NDV增殖试验结果表明,NDV强毒组在48h时的鸡胚保护率为10.00%,2.500g/mL芒果叶生药+NDV组的鸡胚保护率为63.64%,两者差异显著(P<0.05);1.250g/mL+NDV组、0.625g/mL+NDV组、0.313g/mL+NDV组的鸡胚保护率分别为72.72%、70.00%、69.23%,与强毒组相比,差异极显著(P<0.01),可见芒果叶水提物对NDV增殖具有抑制作用。     

SYBR Green Ⅰ模式荧光RT-PCR检测新城疫病毒

针对新城疫病毒（NDV）F基因保守区内的核苷酸序列设计1对引物,以此对引物和标准NDV毒株（含NDV强毒和弱毒）的RNA为模板,建立并优化SYBRGreen Ⅰ模式荧光RT-PCRNDV检测方法.如果待测样品扩增产物的Tm值和阳性对照的Tm值相差在2℃范围之内判为阳性.此法比文献报道的普通RT-PCR法更敏感,但仍低于鸡胚接种分离病毒法.     

马立克氏病病毒MEQ蛋白对MDV增殖影响的研究

在马立克氏病病毒MDV致病机理的研究中，弄清致病基因meq与病毒增殖之间的关系及其分子机制是十分重要的基础，以重组反转录病毒（RCAS-meq)感染鸡胚成纤维细胞（CEF），使源于MDV强毒参考株（vMDV)GA株的meq基因表达于宿主细胞内，然后再用GA株感染这些细胞。通过利用MDV强毒株特异的抗pp38单克隆抗体所进行的“黑斑”试验以确定MDV的增殖水平，并与未接种RCAS-meq的CEF进行比较。研究结果发现，细胞内表达的meq基国产物可促进GA株于体外培养细胞中的感染与增殖（病毒斑数增多）。根据试验的结果，作者认为meq基因在感染细胞内的表达水平是MDV增殖以及进而能致病、致瘤的分子基础。     

鸡传染性支气管炎病毒鸡胚传代毒对SPF雏鸡的致病力的变化

应用鸡胚连续传代的第5(P5)和115代(P115)鸡传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitisvirus,IBV)中国分离株CK/CH/LDL/97Ⅰ进行动物实验,评价两个不同代次毒对SPF雏鸡的致病性、病毒在机体内复制动态以及病毒刺激机体产生抗体的变化。结果显示,P5接种的鸡群发病率为100%,死亡率为10%;P115接种的鸡群发病率和死亡率均为0%。表明,P115较P5毒力明显减弱。病毒复制动态检测结果显示,P5和P115均能在鸡的上呼吸道中复制,但P5接种的鸡群上呼吸道带毒时间为15d左右;P115接种的鸡群上呼吸道带毒时间为9d左右。抗体检测发现,P5与P115均能刺激机体产生血清抗体,SPF鸡对P5与P115感染均能产生良好的体液免疫应答,说明致弱毒P115仍然保持良好的免疫原性。P115代病毒可作为IBV疫苗研制的候选毒株。     

一株野禽新城疫强毒分离株的分子特性及其对不同宿主的致病性

新城疫(newcastle disease,ND)是禽类的两大疫病之一,新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是该病的病原体。为了解野禽NDV的分子特性、致病性及其与家禽NDV之间的关系,2011年分离到一株野禽NDV,将其命名为NDV2;通过标准生物学毒力检测证实其为强毒株。参照GenBank发布的NDV全长基因序列设计9对特异性引物,对NDV2进行全基因的序列测定和分析。拼接后序列分析表明,NDV2株的全基因组序列总长为15 192 nt,包含6个开放阅读框,分别编码6种蛋白nucleocapsid protein(NP)、phosphoprotein(P)、matrix protein(M)、fusion protein(F)、haemagglutinin-neuraminidase(HN)和large protein(L)的基因,长度分别为1 753、1 451、1 241、1 792、2 004和6 703 nt(GenBank登录号:KF306265)。与国内多数禽源分离毒株相似,NDV2毒株亦属于ClassⅡ、基因Ⅶ型。综合各个蛋白的同源性比较,NDV2株与近年国内流行的一些基因Ⅶ型毒株如:Egret.GX.11、Duck.WF.00、Goose.GD450.11等的同源性较高,远高于其他地区和其他基因型的毒株,这说明NDV2毒株与国内的野毒株亲缘性较高;与NDV2同源性差距最大的为ClassⅠ的JS10毒株。F基因的裂解位点显示:全基因长度为15 192nt的毒株(包括NDV2毒株在内)在裂解位点处的氨基酸序列为RRQKRF或KRQKRF,为强毒株序列。从基因分型结果来看,NDV2毒株和绝大多数参考毒株F基因和HN基因分型结果是一致的;唯一不同的就是印度鸡源分离株NDV4毒株,F基因分型它属于Ⅱ型,HN基因分型它属于Ⅶ型。分析各个基因的起始序列和终止序列后发现:NDV2株与其它参考NDV毒株的各个基因的起始序列完全相同,说明各基因起始序列保守性较高;不同之处是NDV2毒株F和HN基因的终止序列与La Sota和Sweden95一致,与其他野禽毒株不同。以NDV2人工感染无特定病原(Spicific pathogenfree,SPF)鸡(Gallus gallus)、鸭(Anas platyrhynchos platyrhynchos Linnaeus.)和鸽(Rupestris Pallas),并且每个攻毒组设同居感染组;来观察NDV2毒株对不同宿主的致病性。结果表明,NDV2毒株均可引起3种攻毒动物发病,剖解后肠道、腺胃、气管等处有淤血、出血现象;而且病毒对鸡和鸽的致病性明显高于鸭。同时NDV2毒株可引起50%同居鸡和20%同居鸽感染发病,不能引起同居鸭发病。本研究为NDV的遗传变异特征和致病规律等方面提供基础资料。     

禽流感病毒、新城疫病毒、猪瘟病毒和口蹄疫病毒多联RT-PCR诊断技术的建立

选择禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒（NDV)、猪瘟病毒(CSFV)和口蹄疫病毒(FMDV)基因组序列高保守区，按照多联PCR引物的设计要求，利用DNAsis计算机软件设计并合成了4对特异性扩增引物，扩增片段大小分别为470、320、200和140bp。以AIV、NDV、CSFV和FMDV的培养物提取RNA并反转录，进行RT-PCR特异性扩增。结果表明，各单项RT-PCR扩增产物与设计的4对引物之间的序列大小一致。在分别建立了各病毒单项RT-PCR及AIV与NDV、CSFV与FMDV二联RT-PCR的基础上，进一步优化各种多联PCR扩增条件，成功建立了上述4种病毒的四联RT-PCR技术。经特异性和灵敏度实验证明，本方法具有高度的特异性和灵敏性，其灵敏度为10pg总RNA。在3h内即可完成样品的检测。     

鸡胚致死孤儿病毒Ⅲa蛋白基因的克隆、表达及其抗原性鉴定

通过随机引物PCR鉴定了鸡(Gallus domesticus)胚孤儿致死病毒(CELOV)污染鸭肝炎病毒鸡胚尿囊液种毒。根据GenBank上已公布的核苷酸序列，自行设计一对引物。PCR扩增到1728bp的特异性条带，将其在大肠杆菌(Escherichia coli)中高效表达，产物蛋白经Western blot鉴定为阳性后，又长程免疫小白鼠获得抗Ⅲa蛋白的抗血清。间接免疫荧光实验(ⅢA)鉴定蛋白产物具有抗原性。     

新型鸭呼肠孤病毒RT-PCR方法的建立与应用

研究建立检测新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)的RT-PCR方法,并运用建立的检测方法对分离毒与人工感染样品进行应用检测.根据NDRV-NP03株S3基因全序列(NDRV-NP03,GenBank登录号:GQ888710),设计合成了一对引物,以NDRV分离株为模板,建立了检测NDRV的RT-PCR方法.结果显示:该方法仅能从NDRV分离毒中扩增到与预期大小相符长度为586 bp的特异性目的片段,检测灵敏度达到2 pg病毒RNA,而其它病毒,番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)、禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)、鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)、番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)、鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)、鸭副粘病毒(Duck paramyxovirus,DPMV)、鸭病毒性肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)等样品的扩增结果均为阴性.应用该方法对8株NDRV分离毒和3份人工感染鸭肝脾组织进行检测均为阳性.表明建立的RT-PCR方法特异性强、敏感度高,可用于NDRV的临床诊断和流行病学调查.     

鸡传染性支气管炎病毒肾致病株的致弱及免疫研究

用已鉴定的广西鸡传染性支气管炎病毒(IBV)分离株G,C,Z和Q分别通过鸡胚传代进行致弱,在一定代次时分别接种敏感鸡作毒力测定试验.然后用已致弱的毒株在实验室进行攻击保护试验,最后取已致弱而且抗原性良好的毒株在广西各地鸡场进行田间应用试验。结果表明,C株在传至40代时,G,Z和Q株分别传至20代时对鸡的毒性均已大大降低;免疫鸡用标准强毒株(M_(41))攻击,然后用病毒回收的技术来衡量其免疫力,结果各株经免疫两次后均有很好的保护率(60％～100％),均显著优于对照组(P<0.01);致弱株分别在南宁、柳州、容县、岑溪和博自5县市的11个鸡场进行田间试验,试验的鸡有30群共103761羽,试验时分别对疫苗免疫对鸡生产性能的影响、安全性和育成率进行观察和测算,结果表明,作者培育的IBV弱毒苗对鸡是安全的,使用C_(60)或C_(80)和G_(20)株先后两次免疫鸡,对IB有较好预防效果,这些弱毒株有希望成为供生产使用的疫苗。     

鸡新城疫病毒F基因与鸡白介素-2(IL-2)基因在真核载体中串连表达及免疫原性

为了探索鸡白介素-2(IL-2)对鸡新城疫病毒(NDV)F蛋白免疫效果的增强作用,本研究通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)利用连接子(G2SG3S)将鸡IL-2基因和鸡NDV F基因串连,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了表达质粒pcDNA-IL-2-F.通过脂质体介导DNA瞬时转染法,将重组质粒pcDNA-IL-2-F和pcDNA-F分别转染鸡胚成纤维细胞,Western blot验证表明,pcDNA-IL-2-F和pcDNA-F均能瞬时表达F蛋白,表达蛋白分别为76.0和59.6 kD,表达蛋白的大小与预期一致并具有抗原性.将表达质粒免疫SPF鸡(Gallus domedticus),6d后开始用ELISA方法检测NDV的特异抗体,免疫20 d后,用F48E9进行攻毒.结果显示,免疫pcDNA-IL-2-F的鸡群产生的抗体水平(P＜0.05)高于混合免疫pcDNA-IL-2和pcDNA-F,高于免疫pcDNA-F的鸡群,但比免疫Lasota组的抗体水平要低.攻毒试验说明免疫pcDNA-IL-2-F组比免疫其他质粒组保护率高,这说明串连表达的免疫效果要好于二者的联合使用,为病毒病疫苗的研制提供了思路.     

新城疫病毒融合蛋白基因片段的构建与鉴定

本文重组和构建了新城疫病毒 ( NDV)融合蛋白基因 ,并对该基因进行了鉴定 :将新城疫病毒 F基因片段经 RT— PCR扩增 ,插入经 Eco R I/ Sal 酶切的克隆载体 p UC18及表达载体 p GEMEX,转化大肠杆菌 JM10 9株。用氨苄青霉素平板法初步筛选克隆 ,再用双酶切法、核酸探针、 PCR及核苷酸序列分析法鉴定 ,表明插入成功并且阅读框架正确     

Rapid separation of lysozyme from chicken egg white by reductants and thermal treatment

Reductants (0.1-2.0% ascorbic acid, cysteine, or cystine and 0.04-1. 0% beta-mercaptoethanol) were added to 5-fold diluted, salted duck egg whites (commercially and laboratory prepared) and fresh egg whites (chicken and duck), and subsequently the mixtures were heated at 70 degrees C for 1-10 min. The maximal recovery and purification fold of lysozyme obtained from fresh chicken egg whites added with 1. 0% ascorbic acid were 78% and 2.4, respectively. Storage tests showed that the obtained lyophilized lysozyme powder after dialysis was stable when refrigerated at 4 degrees C for 3 months.     

11株鸡新城疫病毒强毒株的分子特性

选取2002～2007年从上海市分离鉴定的11株鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）强毒株,克隆其融合蛋白（Fusion,F）基因片段,测序后登录GenBank,序列号分别为NDV 022433（EU258661）、022435（EU258662）、0210149（EU258653）、0210154（EU258654）、0210227（EU258656）、0210252（EU258658）、03024（EU258637）、04011（EU258639）、05013（EU258640）、07011（EU258642）和07023（EU258643）。序列分析结果显示：上述分离株的F基因扩增片段为1 654 bp,编码551个氨基酸,其核苷酸序列同源性为94.6%～100%,推导的F蛋白氨基酸序列同源性为93.0%～100%;各分离株F蛋白裂解位点序列均为112R-R-Q-K-R-F117,为基因Ⅶ型NDV强毒株。系统发育分析表明：这11株NDV分离株之间的遗传距离较近,而与传统疫苗株B1、La Sota、V4和F48E9的遗传距离较远。此外,这11株NDV强毒株均具有大多数鹅源NDV毒株特有的973和1 249 nt RsaⅠ位点。     

表达外源基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆的构建及病毒拯救

为建立表达标记基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作平台,本研究在PRRSV HuN4-F112疫苗株感染性分子克隆的基础上,采用突变PCR技术将新城疫病毒(NDV)NP蛋白末端优势抗原区插入PRRSV NSP2蛋白的复制非必须区,经基因片段的克隆、拼接,构建了含有外源标记基因的感染性的PRRSV cDNA克隆psk-HuN4-F112-Δ52+NP49。用限制性内切酶SwaΙ将psk-HuN4-F112-Δ52+NP49线性化后通过细胞外转录获得病毒RNA,用脂质体法将病毒RNA转染叙利亚仓鼠肾细胞(BHK-21)包装出病毒粒子,再转接到猴胚胎肾上皮细胞(MACR-145)传代拯救病毒。对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定。结果表明,拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记(病毒基因组14667位人工产生的MluⅠ酶切位点)和插入的标记基因序列。间接免疫荧光试验表明,外源基因NP49在拯救的PRRSV中表达,且能够在PRRSV传代过程中稳定遗传。病毒生长特性比较显示,拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性。本研究构建了含有标记基因PRRSV的感染性克隆并获得了拯救病毒,为进一步开发新型PRRS疫苗提供了有效的反向遗传操作平台。     

鸡传染性喉气管炎的研究 Ⅰ．应用间接ELISA法检测鸡传染性喉气管炎病毒抗体

采用原代鸡胚肾（ＣＥＫ）细胞增殖鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ），并用ＰＥＧ－２００００粗提病毒蛋白抗原，建立了用来检测抗ＩＬＴＶ抗体的间接酶联免疫吸附试验。应用该法检测从广西９个大、中型鸡场采集的２３９份未免疫鸡血清样品，结果血清样品阳性率为４５．１９％，各个鸡场均为阳性场（１００％），首次证实广西存在ＴＬＴＶ抗体阳性鸡群．     

一株对小鼠具有高致病性的H5N1亚型禽流感病毒的拯救

禽流感病毒(Avianinfluenzavirus)正在逐渐获得突破种间屏障感染哺乳动物的能力,揭示其获得此种能力的分子机制已经成为禽流感病毒的研究热点。A/Chicken/Guangdong/04(H5N1)是一株高致病性禽流感病毒,同时对BALB/c小鼠也具有高致病力。实验通过反向遗传操作技术对该病毒进行拯救,获得了拯救毒R-A/Chicken/Guangdong/04(R-CG)。R-CG与其亲本毒A/Chicken/Guangdong/04(W-CG)在胚半数感染量(EID50)、细胞培养半数感染量(TCID50)、对SPF鸡和BALB/c小鼠致病力等生物学特性保持一致。即R-CG与W-CG对鸡都为高致病力,静脉接种指数分别为2.88和2.91;R-CG与W-CG一样,以106EID50鼻腔感染BALB/c小鼠后,均能引起小鼠死亡,在小鼠脑、肺、肾和脾脏中都能分离到病毒,说明拯救的病毒与亲本毒一样,都可在小鼠体内有效复制,对小鼠具有高致病性。本实验成功地拯救了A/Chicken/Guangdong/04,拯救病毒R-CG可作为背景毒株,为研究禽流感病毒突破种间屏障感染哺乳动物的分子机制奠定了实验基础。     

AA肉种鸡胚胎性疾病的病原学研究及主要病原的PCR 检测

2004年6月份以来，山东某一大型AA父母代肉种鸡场孵化场出现胚胎死亡、弱雏增多、孵出的雏鸡30日龄左右免疫应答不良、生长缓慢等症状。为了探明其病因，作者通过流行病学调查和病原学检查，结果表明造成该病的主要原因是由禽波氏杆菌(Bordetella avium)、沙门氏菌(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)、支原体(滑液囊和鸡败血支原体)及鸡传染性贫血病病毒（CIAV）和病毒性关节炎病毒（VAV）共感染种鸡后，由种蛋垂直传播到鸡胚、雏鸡造成的。同时对其主要病原禽波氏杆菌进行了16S rRNA基因的扩增，结果扩增出783 bp的目的条带; 通过PCR对CIAV VP3基因及VAV S1基因进行扩增，结果分别扩增出582和532 bp的目的条带，其PCR产物均分别能与相应的探针杂交，呈现阳性反应。     

果树脱毒及病毒检测技术的研究进展

果树病毒的扩散性很强 ,严重威胁果树的生长发育和果业生产。简述了果树病毒对生产的危害 ,总结了果树病毒脱除技术和检测技术的研究进展情况 ,论述了病毒检测与脱毒之间的关系 ,并对这些技术进行了评述     

Determination of 4,4'-dinitrocarbanilide (DNC), the active component of the antifertility agent nicarbazin, in chicken, duck, and goose plasma

4,4'-Dinitrocarbanilide (DNC) was extracted from chicken, duck, and goose plasma and isolated by reversed-phase high-performance liquid chromatography. DNC was detected by ultraviolet absorbance at 347 nm and quantified by comparison to a calibration standard. Recovery data were determined by analyzing DNC-fortified control plasma. The mean recovery of DNC in fortified chicken plasma samples was 99.7 +/- 1.9% for 0.18 and 9.1 ppm DNC, and in fortified duck and goose plasma samples was 99.5 +/- 4.9% and 101.4 +/- 4.5%, respectively, for 0.18, 9.1, and 18 ppm DNC.