拟南芥抗致病疫霉突变体部分序列分析

目前获得拟南芥(Arabidopsis thaliana)突变体的主要方法是采用激活标签法(activation tagging)(Kakimoto,1996;Kardailsky et al.,1999)。本实验根据拟南芥突变体对致病疫霉表现的抗性差异,利用TAIL-PCR技术对感致病疫霉的拟南芥突变体进行遗传分析,为克隆拟南芥抗致病疫霉基因提供资料。     

质粒营救法和TAIL-PCR法获得水稻 T-DNA旁邻序列的效率比较

获得突变体中T-DNA的旁邻序列是通过反向遗传学进行功能基因研究的重要手段。实验比较了用质粒营救法和TAIL-PCR法获得T-DNA在水稻(Oryza sativa）基因组中旁邻序列的效率。利用质粒营救法获得T-DNA在水稻中的旁邻序列效率可高达900左右，而利用TAIL-PCR法的效率只有62％。质粒营救法和TAIL-PCR法获得的旁邻序列中水稻基因组DNA的效率分别是80％左右和89％左右。根据实验结果，质粒营救法从转基因植株获得的旁邻序列，水稻基因组DNA的效率是72％，比TAIL-PCR法高18％。     

热不对称PCR(TAIL-PCR)和Tn5转座子质粒拯救法快速分离水稻条斑病菌致病相关基因

构建植物病原菌突变体库是进行新基因发掘和功能基因组学研究的有效途径之一.为快速准确地鉴定Tn5的插入位点和相应的功能基因,研究采用热不对称PCR(TAIL-PCR)和Tn5转座子质粒拯救两种技术,鉴别了在筛选水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)Tn5插入突变体库过程中获得的8个在水稻(Oryza sativa)上毒性减弱的突变体.结果显示,TAIL-PCR和Tn5质粒拯救结合使用,可有效地鉴别Tn5的插入位点和相应的功能基因.TAIL-PCR鉴别的5株突变体是Tn5分别插入在分泌系统结构蛋白F基因(gspF)、cAMP调控蛋白、膜镶嵌蛋白酶酶原、S-蛋硫氨酸脱羧酶亚基和gspJ基因上;Tn5质粒拯救法鉴别的3株突变体是Tn5分别插入在致病性蛋白、功能未知的保守蛋白和鞭毛特异性ATP合酶基因上.序列同源性分析发现,8株突变体Tn5插入的基因与基因组测序的BLS256菌株中的对应基因同一性达100%.这表明,TAIL-PCR和Tn5质粒拯救技术可有效地应用于植物病原菌Tn5突变体库的鉴别和目标基因的分离.     

TAIL-PCR和 Tn5 转座子质粒拯救法快速分离水稻条斑病菌致病相关基因

构建植物病原菌突变体库是进行新基因发掘和功能基因组学研究的有效途径之一。为了快速准确地确定Tn5的插入位点和相应的功能基因,本研究采用TAIL-PCR和Tn5转座子质粒拯救两种技术对本实验室在筛选Tn5转座子插入水稻条斑病菌的突变体库过程中获得的8个在水稻上毒性减弱的突变体进行了鉴别。结果显示,TAIL-PCR和Tn5质粒拯救相互结合使用,可有效鉴别Tn5的插入位点和相应的功能基因。TAIL-PCR明确的5株突变体是Tn5分别插入在gspF、cAMP-regulatory protein、Integral membrane protease subunit、S-adenosylmethionine decarboxylase proenzyme和gpsJ 基因上从而导致水稻条斑病菌的毒性发生了改变;Tn5质粒拯救法明确的3株突变体是Tn5分别插入在pathogencity protein、conserved hypothetical protein和flagellum-specific ATP synthase 基因上。同源分析发现,8株突变体Tn5插入的基因与已基因组测序的BLS256菌株中的基因同源性达100%。这表明,TAIL-PCR和Tn5质粒拯救技术可有效应用于植物病原菌Tn5突变体库的鉴别和目标基因的分离。     

不同TAIL-PCR通用引物在转基因大豆、水稻、油菜侧翼序列分离中的应用评价

为研究不同转基因作物T-DNA插入位点侧翼序列分离中所用的通用简并引物对TAIL-PCR的影响,本研究使用5个通用简并引物分别对8个转基因大豆、30个转基因水稻和2个转基因油菜株系进行了TAIL-PCR分析,结果表明,5个简并引物在TAIL-PCR中的扩增效果存在显著差异,同一简并引物在不同转基因物种的扩增效果显著不同.AD1引物在转基因水稻和转基因油菜中扩增效果较好,AD2引物在转基因水稻、油菜和转基因大豆中扩增效果均较好,AD3引物在转基因水稻中扩增出1个株系,在转基因油菜中扩增出1个株系,但AD3引物与pFGC5941 T-DNA RB上游有匹配,不适用于以pFGC5941为载体的转基因材料分析.AD4和AD5 2个引物在3个转基因物种的扩增均较差.对AD1和AD2两个引物的TAIL-PCR扩增产物进行测序,结果表明,扩增产物均对应转基因材料的侧翼序列.研究表明,不同通用引物在不同转基因事件中侧翼序列的分离效果差异较大,通用引物AD1和AD2TAIL-PCR成功率最高.不同通用引物的应用效果不仅与不同物种有关,也与外源基因的插入位点有关,而且还与载体序列匹配程度相关.为提高TAIL-PCR中T-DNA插入位点侧翼序列分离成功率,建议同时采用多个通用引物平行扩增.     

致病疫霉基因组微卫星标记开发

致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的马铃薯晚疫病是影响马铃薯生产的第一大真菌病害.通过致病疫霉基因组开发微卫星标记,旨为致病疫霉群体遗传结构研究提供更系统、有效的标记.利用软件SciRoKo和ClustalX对致病疫霉基因组中微卫星序列长度≥25 bp的适合标记开发的位点及两端序列进行筛选.然后在这些位点的两端序列上设计专一性PCR扩增引物,选择9株致病疫霉菌对引物的专一性和微卫星的多态性进行检测.最后利用40株不同年份和地理来源的致病疫霉菌株对可行性微卫星标记进行等位基因数的确定及其多态性评估,然后选取部分标记对40株致病疫霉群体进行遗传多样性分析.共获得了33个具多态性的微卫星标记,占开发总数的28.7％,其多态信息含量(PIC)值都在0.164～0.614之间,其中PIC≥0.5的标记有7个,0.25 ＜PIC＜0.5的标记有25个,PIC≤0.25的有1个.发现致病疫霉微卫星基因型与其交配型及地理来源有一定相关性,与甲霜灵敏感性不相关.本研究开发出一批具有多态性微卫星标记,为致病疫霉群体遗传学研究机理提供更多多态性高,稳定性强的分子标记.     

T-DNA插入突变在植物营养研究中的应用

随着拟南芥整个基因组序列测定的完成,T-DNA插入形成的功能缺失(Loss-of-function)突变体和功能获得型(Gain-of-function)突变体,已经越来越多地运用到植物的各种代谢研究中。它可以作为有效的工具从基因的结构、功能、表达上来了解植物营养机制,从而为遗传工程改良植物本身的营养特性来适应贫瘠、盐碱化、酸害以及重金属危害等不良的土壤环境提供了条件。本文综述了T-DNA的结构、转化过程、侧翼序列的获得,以及T-DNA插入诱变在植物营养胁迫研究中的应用。     

利用GFP基因的黄瓜T-DNA插入突变体构建与快速鉴定

为促进黄瓜功能基因组学研究,本研究开展了黄瓜T-DNA插入突变体快速构建与鉴定方法的研究。基于对黄瓜遗传转化体系农杆菌侵染活力和共培养条件的优化,本研究以绿色荧光蛋白GFP基因为插入片段,进行黄瓜T-DNA插入突变体的创制,并利用荧光显微镜进行快速鉴定,最后采用TAIL-PCR技术对突变体进行分子鉴定,确定突变位点。结果表明,选取农杆菌侵染液在活化至12~18 h时具有最佳的活力和浓度,而最佳共培养温度为23℃。采用体式荧光显微镜快速鉴定,从2 978个转化外植体中鉴定得到3株表达GFP再生苗,转化率为1.00‰。TAIL-PCR成功鉴定了一个突变体,其插入位点位于CsaV3_1G032940基因的第10个外显子中,该基因在拟南芥中的同源基因为AT4G18950 (blue light-dependent H⁺-ATPase phosphorylation 1,BHP1),参与蓝光介导的气孔开放过程,但在正常栽培环境中该突变体的T0植株与野生型无差异。本研究结果对黄瓜功能基因组学研究具有重要意义。     

转CBFI基因烟草植株的花器官变异及其插入区侧翼序列的分析

CBF1(C-repeat-binding factor1)基因来源于拟南芥的一个受低温调节的转录因子基因,能激活一系列其它低温相关基因的表达,从而提高植物的抗冻能力(Jaglo-Ottosen et al.,1998)。在研究中发现转CBF1基因烟草后代的部分群体中出现了明显的表型变异,主要表现为花器官的变异。为了探明这些变异是否是因为外源基因在受体基因组中插入的位点不同而造成,本实验从转CBF1基因烟草的后代中筛选了2个花器官差异较大的植株。用TAIL-PCR方法从该2株转基因烟草中分别扩增出了T-DNA插入位点的侧翼序列。     

拟南芥Nodulin MtN21家族At1g0938基因功能的初步研究

拟南芥Nodulin MtN21 蛋白家族含有1～2个DUF6结构域,具有内在膜蛋白的特性。推测该家族基因在小分子跨膜运输、信号转导和抗逆性等方面发挥作用。At1g09380是拟南芥Nodulin MtN21 基因家族成员。本研究通过PCR筛选获得At1g09380对应的T-DNA 插入纯合子,并通过RT-PCR鉴定该突变体为无效突变体。对突变体萌发和萌发后阶段进行盐胁迫和干旱胁迫分析,结果表明,At1 g09380 突变体萌发后对NaCl和干旱胁迫敏感,证明该基因参与拟南芥的盐和干旱胁迫响应过程。同时还发现在长日照条件下突变体植株比野生型植株早开花7d左右。以上研究结果为进一步分析该基因的生物学功能打下基础。     

转CBF1基因烟草植株的花器官变异及其插入区侧翼序列的分析

在转CBF1基因烟草的后代中发现了花器官变异的植株，主要有花瓣裂瓣、花型变小、花丝变短花粉萌发率降低和育性降低等表型变化。采用TAIL－PCR方法，从花器官变异明显和不明显的植株中分别克隆到了各自的T－DNA插入区域的侧翼序列。将这些侧翼序列与GenBank database及pBI121质粒进行比对。结果表明表型差异明显的2个植株的T－DNA插入位点相同，属于一个转基因株系；且T－DNA插入区位于烟草基因组的非编码区。说明这些花型的变异并非由T－DNA在受体基因组中插入位点不同造成的，也不是由外源转基因对受体功能基因的破坏引起的。     

稻瘟病菌T-DNA插入的突变表型分析

PCR技术检测28个形态发育和致病性相关T-DNA插入突变体，结果所有突变体均含磷酸转移酶基因序列。对这些突变体展开进一步生物学性状观察，发现15个颜色异常，8个菌落生长缓慢，2个分生孢子形态异常，2个附着胞形态异常，3个不能形成附着胞。致病性测定结果，9个突变体完全不能导致抗瘟（C101）和感瘟（日本晴）水稻苗致病，病害级别均为0级。用标准菌株1528和P131测定突变体有性世代的形成能力，结果发现， Y34-0211、Y34-1469和Y34-0635 3个突变体完全丧失产生有性世代的能力。     

农杆菌介导球孢白僵菌转化体系的建立及突变体筛选

以球孢白僵菌(Beauveria bassiana)YB-06为受体菌株, 采用农杆菌介导的遗传转化方法,实现了农杆菌AGL1(pATMT1)介导的球孢白僵菌的遗传转化,并研究了转化介质和pH对转化效率的影响。结果表明:在采用28℃、200μmol/L的乙酰丁香酮(AS)、农杆菌浓度OD₆₀₀=0.8、孢子浓度为1×106个/ml、pH5.1~5.8时可实现T-DNA的插入转化。当转化体系pH5.3时,转化效率最高,达586个转化子/106分生孢子;不同共转化介质对转化效率影响明显, 玻璃纸和硝酸纤维素膜转化效率较高。对3000个转化子生长速度和产孢量等性状分析获得46个性状特异突变体。本文结果为进一步研究球孢白僵菌的生长发育、致病机理和毒力相关基因功能奠定了基础。     

农杆菌介导的绿木霉遗传转化及重寄生缺陷突变体的筛选

绿木霉（Trichodermavirens）是一种重要菌寄生真菌,该菌己广泛应用于多种病害的生物防治上。本研究构建了双元载体pCATPH—I（GenBank登录号为：KC252999）,并利用该载体成功实现了农杆菌介导的绿木霉遗传转化,转化效率可达385～460个转化子／10s绿木霉分生孢子。转化子的PCR和遗传稳定性分析表明,T—DNA己整合进该菌的基因组中且在无选择压力的条件下能够稳定遗传。利用该转化体系成功建立了超过2000个转化子的转化子库,通过转化子与病原真菌立枯丝核菌限hizoctoninsolani）对峙培养在该转化子库中成功筛选到两个重寄生缺陷突变体,D441和A281。本研究的完成可为绿木霉的功能基因组学及重寄生分子机制的研究打下基础。     

利用外源基因侧翼序列扩增筛选纯合转基因植株

摘要：传统的纯化外源基因的方法主要是通过多代自交,该方法耗时长,效率低。通过对转基因材料中外源基因T-DNA区域插入位点侧翼序列的分析,本文开发了筛选纯合转基因植株的新方法。首先,利用酶切连接接头的PCR方法,我们在番茄转基因植株中扩增外源基因Avr3a的两翼序列并测序;然后通过该序列设计的引物在转基因植株中验证,得到的两翼序列通过与SGN数据库比对分析,发现外源基因的插入位点有40bp的碱基缺失;最后利用侧翼序列和边界序列设计的引物,成功在转基因T1代植株中筛选出纯合单株,并在T2代进行了验证。     

TAIL-PCR技术及其在植物基因中的克隆

热不对称性PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL—PCR）是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术。该技术利用3个根据已知序列设计的嵌套特异性引物分别和简并引物组合进行PCR反应，选择恰当退火温度对目标片段进行PCR扩增。TAIL-PCR技术作为一种使用技术简单易行，反应高效灵敏，产物特异性高，重复性好，能够在较短的时间内获得目标片段，已经在分子生物学研究领域广泛应用。本文从TAIL-PCR技术原理出发，对该技术特异性引物设计、随机引物组合选择、PCR反应条件等关键性问题进行综述，并介绍TAIL—PCR技术在植物基因克隆上的应用现状及发展前景。     

A hairy root culture of melon produces aroma compounds

Musk melon is the favorite fruit with a high market value in Japan, and the fragrance is one of the major factors determining the fruit quality of melon. In this study, mutant melon hairy roots which had been induced by means of the T-DNA insertion mutagenesis were found to produce volatile compounds with the fruity fragrance of mature melon. The volatile compounds were extracted and identified by GLC-mass spectrometry. Some essential oils such as (Z)-3-hexenol, (E)-2-hexenal, 1-nonanol, and (Z)-6-nonenol were stably synthesized by these hairy roots despite the increased number of subcultures. The productivity of these compounds by the best hairy root line was shown to be considerably higher than naturally ripened melon fruits.