转CBF1基因烟草植株的花器官变异及其插入区侧翼序列的分析

在转CBF1基因烟草的后代中发现了花器官变异的植株，主要有花瓣裂瓣、花型变小、花丝变短花粉萌发率降低和育性降低等表型变化。采用TAIL－PCR方法，从花器官变异明显和不明显的植株中分别克隆到了各自的T－DNA插入区域的侧翼序列。将这些侧翼序列与GenBank database及pBI121质粒进行比对。结果表明表型差异明显的2个植株的T－DNA插入位点相同，属于一个转基因株系；且T－DNA插入区位于烟草基因组的非编码区。说明这些花型的变异并非由T－DNA在受体基因组中插入位点不同造成的，也不是由外源转基因对受体功能基因的破坏引起的。     

转百脉根BIO ORGANS(BIO)和突变基因(bio)烟草植株的生长及表型分析

BIO ORGANS(BIO)是百脉根中调控花器官形态和器官大小的基因,为深入研究其基因功能,利用根癌农杆菌介导法把BIO及其突变的截断基因bio定向导入烟草(Nicotiana tobacum)中,共获得18株转BIO基因烟草植株以及21株转bio烟草植株.转BIO及转bio植株表型具有一定的相似性:与野生型相比,转基因植株的生长周期显著缩短;接近一半的叶片出现缺刻或呈现一个叶片向两个叶片分裂的趋势;花冠颜色变浅,花器官大小、数目、形态等都表现出了一定的变化.不同的是,与野生型相比,转BIO植株明显矮化,器官变小;而转bio植株株高变高,器官变大.通过表型分析显示,BIO基因参与了植株形态建成的多个方面,包括植株的高度、叶片以及花器官的形态等,同时推测bio基因缺失的一段序列可能对调控器官大小起着重要的作用.对BIO及bio测序后进行序列比对,结果显示其基因序列及蛋白序列与豆科植物大豆(Glycine max)、蒺藜苜蓿(Nledicago truncatula)中的部分序列相似性均达到90％以上.该研究为下一步探索BIO基因的调控机理以及与其他基因的互作关系提供了实验依据.     

蝴蝶兰PhAG1b基因的克隆及在突变体花器官中的表达分析

为深入研究兰科植物花器官发育的调控机理,采用RT-PCR和RACE技术从蝴蝶兰聚宝红玫瑰中克隆了一个C类MADS-box基因PhAG1b(GenBank登录号:KY475587),并分析了该基因在蝴蝶兰不同组织和5类突变体花器官中的表达水平。序列分析表明,该基因的cDNA全长为1 250 bp,含完整的开放阅读框,编码234个氨基酸,包含MADS和K-box结构域及AG基序。系统进化树分析显示,该基因编码蛋白与木石斛的DcOAG1和建兰的CeMADS2一致性最高。转录表达分析表明,PhAG1b基因在营养器官中不表达,在花器官的萼片、侧瓣和唇瓣中也不表达,只在花器官的蕊柱和子房中表达,在授粉后的子房中表达水平降低;在退化雄蕊变异为花瓣的突变体花器官中,PhAG1b基因的表达水平没有变化;在侧萼和侧瓣变异为唇瓣的突变体中,PhAG1b基因在蕊柱中的表达水平明显降低,而在侧瓣退化与蕊柱合生和侧瓣顶端长出花药的突变花器官中,PhAG1b基因在蕊柱中的表达显著升高。由此可见,PhAG1b基因主要参与花器官中蕊柱和子房的发育调控,其功能可能与B类基因的功能互为消长。该研究结果为进一步探究兰科植物花器官发育的分子调控机理提供了依据。     

低温诱导的位点特异性重组植物表达载体构建及小麦转化

选择标记基因的剔除是转基因植物商品化种植的重要基础.为建立小麦(Triticum aestivum)低温诱导的位点特异性标记基因删除体系,本研究以小麦西农928基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得小麦低温诱导表达wcs120启动子,序列分析表明,该序列与GenBank中序列AF031235相比有一段21 bp插入,与AY493570.1序列完全一致.以含有CinH/RS2单向位点特异性重组系统的植物表达载体pXL5513为框架,成功构建了包含有抗旱相关性基因PYL5(pyrabactin-resistance like gene 5)表达框的低温诱导的位点特异性重组植物表达载体pXL5513-fwcs-RDA;并对小麦绵阳19(M19)幼胚愈伤组织进行基因枪转化,1 745块愈伤组织经筛选分化共获得9株转基因植株,经PYL5基因特异引物PCR检测,6株为阳性植株,低温春化处理后经删除引物PCR检测,6株阳性植株初步证实成功删除了选择标记基因.本研究为利用低温诱导的位点特异性重组系统进行小麦无标记基因转化奠定了基础.     

转PSAG12-BAS1基因抑制烟草叶片的衰老

衰老被认为是烟草(icotiana tabac um)叶片发育的最后阶段,伴随着叶绿素,脂类等降解,严重影响了光合产物的积累,导致作物产量降低、品质下降.因此,利用转基因技术使烟草在生长期间衰老延迟,光合产物量增加,从而增加产量,同时在收获之后,延缓衰老的叶片,可以维持烟草的新鲜程度,解决储存及运输问题.本研究利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化法将含有衰老相关基因12 (senescence-associated gene 12,SAG12)启动子驱动光敏色素B激活标签的抑制蛋白1(phyB activationtagged suppressor1,BAS1)基因表达的元件导入烟草中,经抗性筛选和PCR鉴定,共获得45株转基因植株,其中有8株转基因烟草叶片具有衰老延缓现象.在叶片开始衰老时对野生型和转BAS1基因烟草叶片叶绿素含量、保护酶活性检测以及植物生长期状态进行观察测定,结果表明,转BAS1烟草植株叶绿素含量从顶端到基部均高于野生型;野生型和转BAS1基因烟草超氧化物歧化酶(super-oxide dismutase,SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量分析表明,转BAS1烟草植株中SOD活性比野生型高了31.98％,MDA含量比野生型降低了48.28％,通过对烟草生长发育过程观察,转基因烟草比野生型烟草衰老延缓10～15 d.在烟草叶片开始衰老时测定野生型和转BAS1基因植物细胞分裂素含量,结果发现,野生型烟草细胞分裂素的含量比转基因烟草降低了40.2％,上述结果说明,转BAS1基因延缓了烟草叶片的衰老,与细胞分裂素含量、保护性酶活性提高以及衰老性启动子启动有关.本研究为进一步研究SAG12-BAS1基因功能机制提供理论依据,同时该基因为创制转基因抗衰老材料提供了基础.     

冷诱导基因转录因子CBF1的组成型表达对植物的抗寒性及生长发育的影响

通过农杆菌介导法将玉米泛素启动子(Pubi)调控的CBF1基因以及CaMV35启动子调控的GUS基因一起转化烟草,研究了冷诱导基因的转录因子CBF1(CRT/DRE binding factor 1)对植物抗寒性及生长发育的影响。结果表明:CBF1的组成型表达增强了冷敏感植物的抗寒性;在表型上使植株矮壮,叶片着生密集,叶色深绿,叶厚度增加;促进侧枝生长,延长营养生长期,推迟花期;对植株的结实性无明显影响。植株抗寒能力以及表型变化程度与CBF1的表达强度相关。因此,利用CBF1基因进行植物遗传改良时应根据物种的应用特点采用合适的表达调控策略。     

PHAs合酶phaC2基因转化烟草叶绿体的研究

中长链羟基脂肪酸聚酯 (medium-chain-length-PHAs, mcl-PHAs) 属于微生物聚酯。Ⅱ型PHA合酶是mcl-PHAs生物合成途径中的关键酶。将编码Ⅱ型PHA合酶的基因phaC2与水稻(Oryza sativa )叶绿体psbA基因的启动子和终止子构建表达盒(RpsbA-pro-phaC2-RpsbA-ter)，连同壮观霉素抗性基因aadA表达盒(prrn-aadA-TpsbA-ter)一起克隆进烟草叶绿体基因组同源片段rbcL和accD中，构建了烟草叶绿体转化表达载体pTC2。基因枪法转化烟草(Nicotiana tobacum L.)叶片，获得具有壮观霉素抗性的转基因烟草。对T0代和T1代转基因植株的PCR和Southern blot鉴定结果表明, 外源基因确已整合进烟草叶绿体基因组中，T1代转基因植株已达同质化。RT-PCR分析结果证实phaC2基因已在转录水平上表达。转基因植株的正反交试验证明外源基因在转基因后代中遵循母性遗传规律，不存在转基因的花粉漂移现象。通过叶绿体遗传转化, 实现中长链羟基脂肪酸聚酯合成关键酶基因phaC2在烟草叶绿体基因组中的稳定转化。     

PTLF-PTAG-IR对转基因烟草开花的抑制效应

PTLF（LEAFY同源基因）和PTAG（AGAMOUS同源基因）是杨树中控制花发育的重要基因,为了解RNA干涉同时抑制PTLF和PTAG对花发育的影响,本研究采用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法将35S：：PTLF-PTAG-IR导入烟草（Nicotiana tabacum）。经PCR检测获得了15株阳性转化株系,进一步的Southern分析证实PTLF-PTAG-IR基因已整合到烟草基因组中。荧光定量分析结果显示,转基因烟草内源NFL（LEAFY同源基因）和NAG1（AGAMOUS同源基因）的表达量均低于野生型。对开花时间调查的结果表明：与野生型烟草相比,53.3%的转基因株系开花受到完全的抑制,26.7%的转基因株系开花时间平均推迟34.3d,仅20%的转基因株系与野生型在同一时期开花。另外,对转基因烟草花器官的观察发现花瓣形态,雄蕊着生方式、数目等方面发生变异,这些研究结果表明过量表达35S：：PTLF-PTAG-IR对烟草花发育起到抑制作用,本研究将为利用转基因手段获得不育材料提供参考。     

茶树抗寒基因CsCBF1与CsICE1低温下的表达分析

为探明茶树抗寒转录因子基因CsCBF1与CsICE1的表达特性,以茶树幼苗为试验材料,根据其他已知植物的抗寒转录因子基因CBF1与ICE1序列,通过同源克隆法获得茶树中相对应的同源基因CsCBF1与CsICE1的保守区域,长度分别为456 bp与643 bp,经比对确定为CBF与ICE转录因子家族基因中CsCBF1与CsICE1型基因,因此命名为CsCBF1与CsICE1。荧光定量PCR分析CsCBF1与CsICE1基因在冷胁迫条件下的表达情况,发现其在4℃处理8 h时表达量最高;在茶树叶片中表达量显著高于根、茎、花。低温下CsCBF1与CsICE1基因表达显著增加,并且在抗寒性较强的种质(0306I和黄旦)中的表达显著高于抗寒性相对较弱的种质(0306F和0306D)。本研究结果为进一步探究CsCBF1与CsICE1基因在茶树耐低温胁迫过程中基因表达的调控机制奠定了基础。     

RPW2表达载体构建及对烟草的遗传转化

将RPW2基因插入表达载体pBI121的表达盒中,构建了RPW2组成型表达载体。通过农杆菌叶盘转化法转化烟草叶片,经卡那霉素筛选、PCR扩增和Southern杂交鉴定证明,RPW2基因已成功转入烟草细胞中,获得6个转基因株系。RT-PCR半定量分析表明,转基因烟草株系的叶片中有RPW2基因的表达。不同转基因株系表达量不同,转基因株系T-R2和T-R4表达量较高。转基因植株叶片上人工接种烟草赤星病菌液检测转基因植株的抗病性,结果表明,与对照植株相比转RPW2基因植株对烟草赤星病抗性显著增强,说明RPW2基因在烟草中也具有抗病能力。另外,转基因株系间RPW2基因表达量虽有差异,但抗病性没有显著差异。     

烟草线粒体基因coxⅡ的SNP检测及其与CMS的相关性分析

对烟草胞质雄性不育性(CMS)的分子机理进行了研究。以7个CMS系及其相应的保持系为材料,利用特异引物PCR法扩增其线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅱ(coxⅡ),通过直接测序和比对,检测到coxⅡ中有3个核苷酸位点存在碱基变异,分别是:C-770G、G-772A和G-773C,其中第770位碱基的变化导致了相应位点编码氨基酸的改变,第772和773位碱基的变化共同导致了1个编码氨基酸的改变。对coxⅡ基因中第770位C→G的突变进行了240个烟草植株个体的PCR-RFLP检测及分析,结果表明,所有保持系单株的线粒体coxⅡ基因片段都可以被HapⅡ酶切,酶切后出现2种条带;而全部雄性不育系单株的线粒体coxⅡ基因片段由于第770位C→G的突变都不能被HapⅡ酶切,电泳图中仅有1条未被切开的条带。说明coxⅡ基因第770位的SNP位点与烟草CMS特性存在极显著的相关性。     

沙冬青CBF/DREB1转录因子cDNA的克隆及序列分析

CBF/DREB1(C-repeat binding factor/dehydration resistance element binding protein 1)是一类抗逆相关的转录因子,它们的表达可以激活下游一系列抗逆应答基因的表达,从而提高植株的抗逆性。沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)主要生长在中国西北荒漠和半荒漠地带,是典型的旱生资源植物,具有突出的抗寒、抗旱、耐盐碱特性。本文以沙冬青为实验材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆了沙冬青CBF/DREB1基因cDNA序列,并对其进行了序列分析。结果表明:沙冬青CBF/DREB1转录因子基因序列全长为991bp,包括624bp的开放阅读框(ORF),起始密码子ATG,终止密码子TAA,114bp的5’UTR和253bp的3’UTR,以及加尾信号AATAAA及poly(A)11。生物信息学预测其演绎的氨基酸序列具有AP2结构域,且AP2结构域的两端拥有CBF家族特有的PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR两段短多肽序列,属于CBF家族。沙冬青CBF/DREB1转录因子的克隆为进一步研究植物抗逆和获得抗性基因提供了新的候选基因,也为进一步从分子水平上验证其功能,深入理解植物适应干旱、低温和高盐机制奠定基础。     

人肥胖基因(Obese)转基因小鼠动物模型的建立

用三个含有兔乳清酸性蛋白基因(rWAP)启动子,人ob基因(cDNA)及rWAP基因终止子的质粒经亚克隆构建了融合表达载体.用NotI消化表达载体,回收包含上述三个表达元件且插入方向正确的片段(约7.5 kb)并进行显微注射.注射用的DNA浓度为2 g/mL,每mL注射液中DNA的拷贝数约为2.4??011 ,每一枚原核期小鼠胚胎注射1～2 pL.采用标准的显微注射方法,获得48只后代小鼠.四周龄时剪尾并提取尾组织DNA,以人ob基因cDNA为探针,用EcoRI消化总组织DNA,经Southern杂交确证其中两只母鼠为转人ob基因小鼠.在出生的后代小鼠中,转基因阳性率约为4 %(2/48).     

棉花水通道蛋白基因(GhAQP2)的表达特征及功能初步分析

水通道蛋白(aquaporin,AQP)是位于生物膜上的一类古老的通道蛋白,能够高效地运输水分,在整个植物生长发育过程中发挥重要作用。本研究从棉(Gossypium hirsutum)纤维细胞中分离出1个编码水通道蛋白的基因,该基因序列中有3个内含子和4个外显子,开放阅读框为837 bp,编码一个含278个氨基酸残基的多肽。序列比对和进化分析表明该基因与烟草NtPIP2;1同源性最高(86%),属于PIP2水通道蛋白,将该蛋白编码的基因命名为GhAQP2(GenBank登录号:KJ920936)。利用半定量RT-PCR对GhAQP2基因在棉花不同器官和不同发育阶段纤维中的表达模式进行分析,发现该基因在纤维细胞中优势表达,其表达量在开花后随着纤维的发育逐渐升高,在开花后6~18 d的纤维细胞中持续高表达,然后下降。将GhAQP2基因转化BY-2烟草(Nicotiana tobacum)悬浮细胞对其功能进行初步分析,发现该基因在BY-2细胞中过量表达使细胞形态发生显著变化,由圆球状变为长条状,且细胞由聚集变为松散状态。这些结果提示GhAQP2可能在棉花纤维伸长过程中起重要作用。     

玉米NAC转录因子基因ZmNAM的克隆及表达分析

为探究候选基因ZmNAM的功能,本研究从甜玉米自交系1132及其变异系704中克隆得到该基因。生物信息学分析表明,ZmNAM的c DNA长度为1 548 bp,开放阅读框(ORF)为1 302 bp,编码一个由433个氨基酸残基组成的蛋白,蛋白具有亲水性,N-末端具有保守的NAC结构域,定位于细胞核中,具有9个糖基化位点和35个磷酸化位点;与自交系1132相比,变异系在非编码区与编码区中的C-末端转录激活功能域对应核苷酸序列中存在差异,可导致多个氨基酸发生变异。系统进化分析结果表明,玉米ZmNAM蛋白属于NAC转录因子家族中的VND亚族,与拟南芥中的At VND3亲缘关系最近;时空特异性表达分析表明,不同发育时期内ZmNAM在根中的表达量明显高于其他器官,说明ZmNAM基因可能在调控玉米根部的生长发育过程中发挥着重要作用。变异系704中ZmNAM在各个发育时期和发育器官中表达水平基本都明显高于自交系1132,其中在根中的表达水平差异最明显。本研究结果为深入研究ZmNAM基因在玉米生长发育过程中的作用提供了理论支持。     

烟草K346品种叶数、株高变异株的RAPD分析

烟草是叶用作物，其叶数与经济产量密切相关。RAPD技术已被广泛应用于揭示烤烟品种及其它作物突变体基因组DNA的差异和基因定位旧。本实验利用RAPD技术探讨烟草变异株和对照株的遗传物质差异，为探明烟草变异株的叶数或株高突变基因位点提供参考。     

狗蔷薇RcKN1基因的克隆及功能分析

Class-Ⅰ KNOX(KNOX1)基因是真核生物中高度保守的同源盒转录因子,在植物的器官和胚胎发生中起着重要作用。本研究从狗蔷薇(Rosa canina L.)的类原球茎中克隆出了其同源基因,通过对其编码的蛋白质序列比对和系统发育分析,认为其属于KNOX1 在狗蔷薇中的同源基因;该基因全长 1 509bp,其中编码区 1 185 bp,编码 395 个氨基酸,将其命名为 RcKN1 基因 (GenBank 登录号:JN998201)。RT-PCR分析表明,其在叶芽、花芽、类原球茎等幼嫩的器官中表达;进一步构建了组成型表达载体并导入烟草(Nicotiana tabacum L.)中分析其功能,转基因烟草出现了叶片浅裂、叶脉紊乱、叶片基部歪斜、叶片皱缩甚至类似于复叶的叶片等多种表型。研究结果表明,RcKN1 基因在植物发育中起着重要作用,是研究叶片发育机理和培育叶型奇特的花卉新品种有价值的目的基因。     

海岛棉 GbRac1基因过量表达提高转基因烟草离体叶片对赤星病的抗性

利用简并引物PCR和3’RACE，克隆了海岛棉(Gossypium barbadense)GbRac1的编码基因。Northern—blot分析表明，海岛棉GbRac1基因在转录水平上受棉花黄萎病菌(Verticillium dehliae)的诱导，诱导后mRNA表达量显著增加。构建组成型植物表达载体pRac，转化烟草(Nicotiana tabacum)品种NC89，离体叶片抗病性鉴定表明，转GbRac1基因烟草对烟草赤星病(Altemaria altemata)的抗性明显提高。这暗示GbRac1在植物抗病基因工程中具有潜在的应用价值。     

小麦Wcor719基因的原核表达及转化烟草和棉花提高抗冷性研究

为研究Wcor719基因的抗寒功能,获得具有抗寒性的棉花新种质,构建小麦冷诱导基因原核表达载体Wcor719-pET28a进行蛋白表达,SDS-PAGE分析表明其诱导蛋白大小约为24.0kD,表达量在诱导4h时达到最大,且与IPTG诱导浓度无明显相关性。同时通过农杆菌介导的叶盘法将构建的Wcor719-pCambia1301植物表达载体转入烟草(Nicotiana tabacum)SR-1中,T1代转基因烟草植株经过抗生素筛选和PCR检测后进行低温胁迫,测定抗寒生理指标,结果显示转基因植株的脯氨酸和可溶性糖含量均比对照有所提高。该基因经过功能验证后用花粉管通道法转入棉花(Gossypium hirsutum)新陆中49,T0代、T1代经过田间检测及PCR检测后研究T2代转基因棉花低温胁迫下的抗寒性,结果显示,转基因棉花脯氨酸含量和可溶性糖含量均在第5天达到峰值,且明显高于对照;而丙二醛含量低于对照,初步证明转基因烟草和棉花的抗寒性均有所提高,由此表明通过转冷调节基因来提高植物的抗寒性具有良好的应用前景。     

香菇低温胁迫应答基因的克隆及其表达分析

用RT-PCR和RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术相结合，从香菇(Lentinula edodes)苏香菌株中得到了1个与低温胁迫相关的全长2 432 bp的cDNA，该基因含1个1 962 bp的开放式阅读框，基因组序列分析发现该基因有11个内含子。经数据库同源查找及序列比较，发现该基因编码的氨基酸与青霉菌(Penicillium nordicum)的聚酮合酶和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α-氨基己二酸还原酶分别具有30%、22％的同源性和46%、40%的相似性。表达谱分析表明，当低温胁迫的温差为5 ℃时，该基因即开始表达，但mRNA丰度较低；温差达到10 ℃时，mRNA达到最大表达量；低温胁迫处理后，该基因在菌丝转色前的表达丰度低于转色后的丰度。将该基因初步命名为ICS (gene induced under cold stress, GenBank登录号为DQ211659)，并初步推测该基因可能参与了低温胁迫的信号传导，低温胁迫信号在影响氮代谢后进而诱发子实体的形成。