RNA干涉及其在棉花研究中的应用

RNA干涉（RNA interference,RNAi）技术是一门新兴的基因阻断技术,可通过将外源双链RNA导入细胞介导同源靶基因mRNA序列的降解,使靶基因表达沉默,是一种转录后的基因沉默现象。目前,RNA干涉技术在植物研究中已经得到广泛应用。本文简介了植物的RNA干涉研究及RNAi表达载体的构建,综述了RNAi在棉花基因功能和功能基因组学研究、棉花品质性状的遗传改良和棉花的抗虫抗病研究中的应用进展及其在棉花研究中存在的主要问题和应用前景。     

RNA沉默—新型的植物病毒病害防治策略

植物RNA沉默(RNAsilencing)是植物本身固有的一种抗病毒防御系统,是对病毒在复制过程中形成双链RNA(dsRNA)的特殊反应。RNA沉默介导的dsRNA干涉病毒侵染转基因抗病毒有其不足,几种体外生产dsRNA的抗病毒体系能弥补这一不足,它们与转基因表达病原RNA不同,但仍然依赖RNA沉默机制来获取病原抗性。综述了近年来发展起来的各种启动RNA沉默的dsRNA产生策略、抗病状况和存在的问题及发展前景     

RNA干扰技术在植物寄生线虫中的应用

已证实在植物寄生线虫中存在RNA干扰(RNAi)现象,当寄生前的线虫幼虫或卵吸取能激发系统RNA干扰反应的双链RNA后,能诱导特定类型细胞中的基因表达沉默。RNAi将成为基因组范围内鉴定基因功能的有力工具,可以帮助更好地了解植物寄生线虫。最近的研究描述了RNAi技术在植物寄生线虫中的作用机制、途径、表现型的决定、专化性和持久性等。研究进展表明,植物双链RNA表达靶定的线虫基因能够成功地诱导线虫基因沉默。     

RNA沉默介导的转基因烟草抗中国番茄黄化曲叶病毒研究

近年来,中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)病在我国自南向北不断蔓延,发病地块减产甚至绝产,造成了巨大的经济损失.本研究应用RNA沉默(RNA silencing)防治病毒病原理构建TYLCCNV外壳蛋白(coat protein,CP)部分基因片段dsRNA(double-strand RNA)导入本氏烟(Nicotiana benthamiana)获得了抗TYLCCNV的转基因烟草.实验结果表明,目的基因已整合到转基因烟草植株的基因组中.用TYLCCNV侵染性克隆接种转基因烟草,症状观察和PCR检测发现,对TYLCCNV表现为免疫的转基因烟草占14.6％.Northern blot分析表明,在不同的抗病类型转基因植株中,目的基因mRNA的积累量存在明显的差异,其积累量与抗病型呈负相关.研究结果对利用RNA沉默防治TYLCCNV有一定的理论指导意义.     

马铃薯Y病毒CP基因RNAi载体构建与干涉效果测定

RNA沉默（RNAi）介导的植物抗病毒研究是近年来引起广泛关注的一项植物抗病毒基因工程策略。马铃薯Y病毒（PVY）在世界范围内引起马铃薯、烟草等重要经济作物的病害,并且造成严重的经济损失。本文以PVY的外壳蛋白（CP）基因为模板扩增300bp和354bp两个片段,正向和反向分别插入植物表达载体pROKⅡ的35S启动子下游,从而构建了以PVY的CP基因为靶标的RNAi植物表达载体pROKY300,转入农杆菌EHA105中,以农杆菌渗入法在本氏烟中瞬时表达与wyCP同源的hairpin RNA。结果表明,瞬时表达的hairpin RNA有效干涉了PVY侵染。     

瞬时表达黄瓜花叶病毒部分复制酶基因和番茄花叶病毒移动蛋白基因的dsRNA能阻止相关病毒的侵染

根癌农杆菌介导的瞬时表达法已开始用于研究RNA沉默，在非转基因植物细胞中，如能建立借助于根癌农杆菌介导的瞬时表达法。考察反向重复片段转录出的dsRNA对入侵病毒的干涉作用，则可以快速预测所构建重组载体用于抗病毒基因工程的效果。本研究证明用根癌农杆菌浸润法在植物的叶片组织中瞬时表达dsRNA，可以阻止相关病毒的侵染。     

植物系统性RNAi的研究进展

RNAi作为反向遗传学手段,以其序列特异性、高效性等特点,在植物基因功能验证、抗病和品种改良等方面发挥了积极作用,RNAi的系统性也同时受到研究者的广泛关注。系统性RNAi（systemic RNA interference）传统定义是指沉默信号从一个细胞或一种组织,传递到另外的细胞或同一个体的另外组织中去的现象。本文主要综述植物基因工程研究中应用系统性RNAi技术的研究现状,总结了植物系统性RNAi的特征及沉默效应的抑制。对植物系统性RNAi的研究方法与应用,特别是在植物抗性研究和遗传改良等方面作了重点介绍,并分析了技术存在的限制因素。     

4个沉默鸡恒定链基因(Ii)慢病毒载体的构建及其效果比较

恒定链(invariant chain,Ii)是脊椎动物重要的免疫分子,在主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ类分子递呈抗原中起重要作用。为研究鸡(Gus gallus)Ii与MHCⅡ类分子的关系,本研究构建了4个沉默Ii基因的慢病毒表达载体,并比较了其干扰效果。首先,用自行设计合成的4条鸡Ii基因干扰序列,分别经一步退火法获得双链短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA),并将其用双酶切法插入慢病毒载体pLL3.7。4个构建的慢病毒重组载体经酶切和测序鉴定,分别命名为pLLIi-shRNA236、pLL-Ii-shRNA376、pLL-Ii-shRNA527和pLL-Ii-shRNA539。然后把这些重组载体分别转染293T细胞(转染腺病毒E1A基因(lethal infection gene)的人肾上皮细胞系),进行病毒包装,再用包装的慢病毒感染鸡源巨噬细胞HD-11。结果表明,重组载体感染的293T细胞表达绿色荧光蛋白,用包装的慢病毒接种293T细胞,其滴度达2.2×107~5.1×107TU/mL;接种HD-11细胞的感染率均达到95%以上。最后用荧光定量PCR方法检测其沉默鸡源巨噬细胞HD-11的鸡Ii mRNA的效率,与对照组相比,4个重组慢病毒干扰效率分别为37%、52%、88%和78%;其中,pLL-Ii-shRNA527的干扰效率最高。综上所述,本研究从4个构建的重组载体中筛选出1个高效沉默鸡巨噬细胞Ii基因重组载体,并提示shRNA序列是决定沉默特定基因的关键。实验结果为研究鸡Ii在递呈抗原中与其他免疫分子的关系提供了基础资料。     

植物miR168的研究进展

microRNAs（miRNAs）是真核生物中一类长约22 nt的非编码小分子RNA,它通过对靶mRNA的切割或抑制靶mRNA的翻译调控基因的表达,从而对靶基因实施转录后水平负调控,在植物器官的形态建成、生长发育、信号转导及植物对逆境胁迫的应答中起着重要的作用。miR168是植物特有的一类RNA小分子,其主要的靶基因AGO1蛋白是RNA沉默复合体的重要组成成分,广泛参与对靶mRNA的剪切。本文综述了miR168的发现及其在植物中的分布、miR168与AGO1蛋白的关系、miR168对逆境胁迫的响应以及其在动植物间的跨界调节等,为进一步帮助人们了解miR168的功能及其参与动植物间跨界调节这一特性奠定良好的基础。     

低毒病毒及板栗疫病菌低毒力机制

低毒病毒是一类存在于板栗疫病菌细胞质中自主复制的无衣壳正链RNA病毒。感染低毒病毒后,板栗疫病菌的致病力显著降低,色素分泌减少,菌丝体由感染病毒前的桔黄色变为白色,产孢量降低或不产孢,漆酶表达水平明显下降。低毒病毒侵染性克隆的获得以及高效转化和转染体系的建立,使得低毒病毒成为目前唯一可以进行全面遗传操作的真菌病毒。利用低毒病毒作为探针来探测板栗疫病菌的致病力组成和毒力调节机制,己获得了一些很有意义的发现。本文介绍近几年低毒病毒及其与真菌相互作用的研究进展,包括低毒病毒的基因组和功能基因研究、低毒病毒和线粒体损害引起的板栗疫病菌低毒力机制、板栗疫病菌的RNA沉默系统以及低毒病毒抗RNA沉默的机制。低毒病毒／板栗疫病菌系统已经成为研究病毒与宿主相互作用以及病原真菌致病机理的很好的模式系统。     

Articulating beneficial rhizobacteria-mediated plant defenses through induced systemic resistance: A review

Induced systemic resistance (ISR) is a mechanism by which certain plant beneficial rhizobacteria and fungi produce immunity, which can stimulate crop growth and resilience against various phytopathogens, insects, and parasites. These beneficial rhizobacteria and fungi improve plant performance by regulating hormone signaling, including salicylic acid (SA), jasmonic acid (JA), prosystemin, pathogenesis-related gene 1, and ethylene (ET) pathways,which activate the gene expression of ISR, the synth...     

VIGS沉默番茄SlDCL2和SlDCL4破坏Ty-1/Ty-3对TYLCV的抗性

番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)严重威胁茄科蔬菜作物的生产。抗性标记Ty-1和Ty-3是一对等位基因,在番茄抗TYLCV育种中应用较为广泛。为了探究Ty-1/Ty-3抗病毒分子机制,本研究以携带Ty-1/Ty-3抗性标记的番茄Y19为材料,利用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术,沉默RNA干扰(RNAi)机制关键基因,即番茄核糖核酸内切酶编码基因2a/b/c/d(SlDCL2)和番茄核糖核酸内切酶编码基因4(SlDCL4),初步分析其在Ty-1/Ty-3抗TYLCV中的功能。PCR与测序结果发现SlDCL2、SlDCL4的VIGS沉默载体pTRV2∶SlDCL2和pTRV2∶SlDCL4构建成功。以沉默番茄八氢番茄红素脱氢酶(SlPDS)基因为标记植株,定量PCR检测SlDCL2、SlDCL4沉默株系中SlDCL2、SlDCL4基因的沉默效率,结果显示SlDCL2、SlDCL4沉默株系中对应基因的表达均小于对照植株的50%,表明SlDCL2、SlDCL4沉默载体确实可以降低对应基因的表达,且不影响其他DCL基因的表达。VIGS沉默植株SlDCL2、SlDCL4基因后接种TYLCV,接种TYLCV 30dpi结果显示,Y9材料表现出明显的TYLCV病毒症状,通过比较植株发病严重度发现,SlDCL2、SlDCL4沉默株系发病严重度分别为1.97、2.35,显著高于空载体注射株系(0.14)和对照株系(0.07)。本研究结果表明RNAi通路关键基因SlDCL2、SlDCL4在Ty-1/Ty-3抗TYLCV中发挥着重要作用,这为利用Ty-1/3抗性标记基因育种奠定了基础。     

叶绿体转化及其用于疫苗表达研究的最新进展

随着植物转基因研究的不断深入,核基因组转化的转基因沉默现象严重影响了基因工程的应用效果.植物叶绿体遗传转化以叶绿体基因组为平台对植物进行遗传操作,外源基因定点整合及母性遗传特性能较好地解决＂顺式失活＂和＂位置效应＂等类的基因沉默问题和转基因逃逸等安全问题,成为植物基因工程发展的新方向,在工业、农业及医药生物领域发挥了重要作用,也为生产廉价、安全的植物疫苗提供了新思路.本文在简要介绍叶绿体转化的原理、转化方法与优势的基础上,重点综述了近年来通过该技术表达的一些重要的病毒抗原和细菌抗原.最后,对叶绿体转化技术在表达外源基因方面存在的问题进行分析.未来随着叶绿体基因表达、调控机制研究的逐渐深入及相关技术体系的日臻完善,叶绿体转化有望成为疫苗生产的生力军.     

Comparative analysis of <Emphasis Type="Italic">Argonaute</Emphasis> gene sequences in bananas (<Emphasis Type="Italic">Musa</Emphasis> sp.) shows conserved species-specific Ago-7 PIWI domains

The Argonaute proteins are key components in the effector complex of RNA silencing pathways which interact with small RNAs to mediate sequence specific silencing of nucleic acid targets. In plants, these proteins are involved in a diversity of biological roles such as antiviral defence, heterochromatin regulation and in the regulation of growth and development. This report describes the study of Argonaute gene sequences in bananas which are an important food staple for many developing nations. This study successfully isolated AGO7-specific PIWI domain genomic sequences from 12 diploid Musa species of three Musa sections and also from Ensete. The Musa AGO7-specific PIWI domain sequences showed the highest similarity to rice AGO7/SHOOTLESS4 with an average amino acid identity of 78%. Phylogenetic analysis of the Musa sequences revealed phylogenetic grouping that agrees fairly well with the present knowledge of the taxonomic classification of Musa species. In addition, this study estimated that there are at least 15 Argonaute genes or loci containing PIWI domain sequences in the genome of Musa acuminata ssp. malaccensis.     

水稻OsHsfA7基因RNA干扰载体的构建及遗传转化研究

为研究水稻热激转录因子基因OsHsfA7的功能及其在水稻耐热育种方面的应用价值,本文通过构建水稻OsHsfA7基因RNA干扰载体获得功能抑制变异材料,从反向遗传学进行基因的功能分析。扩增OsHsfA7c DNA3'编码区470bp片段,分别以反向和正向插入到中间载体pBSK连接的GUS片段两侧,然后将得到的RNA干扰片段克隆到改造的植物表达载体p1301M,构建以CaMV35S启动子驱动表达的水稻OsHsfA7基因RNA干扰表达载体。将该载体转入根癌农杆菌EHA105后,采用农杆菌介导法进行了水稻日本晴品种的遗传转化,获得了23株具有潮霉素抗性的转基因植株,其中12株经GUS染色呈蓝色并且DNA检测10株已插入目的片段,RNA检测其中6株OsHsfA7基因的表达水平下降甚至未检出。结果说明本研究构建的OsHsfA7基因RNA干扰载体对该基因表达沉默是有效的。     

甜叶菊RNA分离方法研究

甜叶菊组织中酚类、萜类和多糖等代谢产物含量较高,RNA难分离,易降解,使用现有的方法提取甜叶菊组织RIgA产率低、质量差,无法应用于实验操作。本文针对甜叶菊组织次生代谢物多的特点,以传统的CTAB法（cetyl trimethyl ammonium bromide）为基础,分别采用不同的方法进行RNA抽提和纯化。结果发现采用CTAB－LiCl法提取的RNA完整性好,且纯度高;传统的CTAB法提取的RNA完整性好,但有DNA和其它杂质的污染;高盐溶液法提取的RNA降解比较严重,同时还有杂质污染。结论说明CTAB—LiCl法适用于多糖类植物RNA的分离。