易变山羊草中抗虫相关基因cDNA部分片段的克隆及序列分析

易变山羊草是小麦近缘种植物，对禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)、根结线虫(Meloidogyne naasi)都具有很高的抗性。本实验根据小麦另一近缘种植物节节麦的抗虫基因Cre3保守区核苷酸序列设计合成正向引物，通过cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)从易变山羊草的RNA中扩增出抗虫相关基因部分cDNA片段。     

松材线虫及其近缘种热激蛋白90基因(hsp90)克隆与序列分析

热激蛋白90家族(heat shock protein 90(HSP)family)是一种进化保守的蛋白质,在分子伴侣功能、细胞循环调控、抗原传递方面发挥着重要作用。本研究用RT-PCR和RACE技术,克隆得到了松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)和豆伞滑刃线虫(Bursaphelenchus doui)热激蛋白90基因的cDNA全长序列,分别命名为Bx-hsp90、Bm-hsp90和Bd-hsp90,(GenBank登录号分别为:GU013561、HMO34943和HM347331),其cDNA全长分别为2255、2193和2232bp,开放阅读框均为2127bp,编码708个氨基酸,5'端非编码区的长度分别为33、13和13bp,3'端非编码区的长度分别为95、53和92bp。其DNA全长分别为2440、2388和2407bp,包含3个内含子。三者氨基酸序列的一致性为98.78%。进化分析表明,松材线虫、拟松材线虫、豆伞滑刃线虫与秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)的亲缘关系较近,推测三...     

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素II基因的克隆、表达及其对小鼠的保护性研究

根据低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)基因编码区保守序列设计引物，对钩刺山羊草(Aegilops triuncialis L, 2n=4x=28, CCUU)PI483029总DNA进行PCR扩增，得到长度为900和1 065 bp的DNA片段，克隆测序后获得2个LMW-GS基因，GenBank登录号分别为AY841016和AY841017。它们具有小麦LMW-GS基因的典型结构特征。其中，AY841017具有完整编码区，长度为1 065 bp，可编码322个氨基酸残基的成熟蛋白，第一个半胱氨酸残基出现在重复区第13位。在重复区，AY841017的两个疏水单元为PIIIL和PVIIL，重复区中还存在一个连续13个Q(谷氨酰胺)组成的短肽。AY841016由于编码区内存在提前终止密码子，为假基因。氨基酸序列比较发现，AY841017与普通小麦(Iriticum aestivum L.)Glu-D3位点编码的LMW-GS基因有很高的一致性。     

甘薯茎线虫β-1,4内切葡聚糖酶基因(Dd-eng-1b)cDNA全长的克隆与序列分析

β-1,4内切葡聚糖酶是植物寄生线虫食道腺分泌的一类细胞壁降解酶,在植物线虫的侵染过程中具有重要的作用.以马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)为材料,用RT-PCR和RACE方法,获得了β-1,4-内切葡聚糖酶基因的cDNA全长,并将该基因命名为Dd-eng-1b(GenBank登录号为FJ430142).此cDNA全长序列为1 640 bp,包括1个1 443 bp的完整ORF,编码1含481个氨基酸的蛋白,其理论分子量为50.89 kD,等电点pI为6.94.序列比对分析表明,含有糖基水解酶的保守结构域,属于纤维素酶第五家族成员,N端具有19个氨基酸残基组成的信号肽,C端含有细菌式样的纤维素结合域(CBD Ⅱ).cDNA与基因组DNA重叠分析表明,此基因包含4个内含子,长度分别为36、76、187和344bp,切割点符合5'-GT……AG-3'的规律.系统进化树分析表明,该基因与细菌Bacillus subtilis和Erwina carotovora分泌的纤维素酶属于同一支,推测该基因可能来源于细菌的水平基因转移.     

甘薯肌醇-1-磷酸合成酶基因的克隆及序列分析

甘薯(Ipomoea batatas (L.) Lam.)新品系农大603是从感茎线虫(Ditylenchus destructor)病品种徐薯18的辐照后代中获得的一个抗茎线虫病的突变体。以农大603和徐薯18块根的mRNA为模板，根据植物抗线虫病基因NBS保守氨基酸序列设计引物，进行 RT-PCR分析，发现农大603的肌醇-1-磷酸合成酶(Myo inositol-1-phosphate synthase , MIPS)基因的表达量高于徐薯18。采用3'RACE技术扩增出MIPS基因的3'末端cDNA。根据植物MIPS基因 5'端一段保守的氨基酸序列设计兼并引物，并与3'端的特异引物组合，扩增出该基因的5'端cDNA序列。DNA序列比对表明，甘薯MIPS基因与大豆(Glycine max)、番茄(Lycopersicon esculentum )的MIPS基因同源性较高，分别达83.63 %和83.89 %。甘薯MIPS基因全长cDNA的克隆，有利于进一步研究该基因与抗甘薯茎线虫病的关系。     

甘薯茎线虫(Ditylenchus destructor)β-1,4内切葡聚糖酶基因(Dd-eng-1b)cDNA全长的克隆与序列分析

β-1,4内切葡聚糖酶是植物寄生线虫口针分泌的一类细胞壁降解酶,在植物线虫的侵染过程中具有重要的作用。本文以甘薯茎线虫为材料,用RT-PCR和RACE方法,获得了β-1,4-内切葡聚糖酶基因的cDNA全长,并将该基因命名为Dd-eng-1b (GenBank登录号为FJ430142)。此cDNA全长序列为1640bp,包括一个1443bp的完整ORF,编码一含481个氨基酸的蛋白,其理论分子量与等电点分别为50.89KD,pI为6.94。序列比对分析表明含有糖基水解酶的保守结构域,属于纤维素酶第五家族成员,N端具有19个氨基酸残基组成的信号肽,C端含有细菌式样的纤维素结合域(CBDⅡ)。cDNA与基因组DNA重叠分析表明,此基因包含4个内含子,长度分别为36bp、76bp、187bp和344bp,切割点符合5‘-GT...AG-3’的规律。系统进化树分析表明,该基因与细菌 Bacillus.subtilis和Erwina carotovora 分泌的纤维素酶属于同一支。     

钩刺山羊草（Aegilops triuncialis L.）低分子量谷蛋白基因序列分析

根据低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)基因编码区保守序列设计引物，对钩刺山羊草(Aegilops triuncialis L, 2n=4x=28, CCUU)PI483029总DNA进行PCR扩增，得到长度为900和1 065 bp的DNA片段，克隆测序后获得2个LMW-GS基因，GenBank登录号分别为AY841016和AY841017。它们具有小麦LMW-GS基因的典型结构特征。其中，AY841017具有完整编码区，长度为1 065 bp，可编码322个氨基酸残基的成熟蛋白，第一个半胱氨酸残基出现在重复区第13位。在重复区，AY841017的两个疏水单元为PIIIL和PVIIL，重复区中还存在一个连续13个Q(谷氨酰胺)组成的短肽。AY841016由于编码区内存在提前终止密码子，为假基因。氨基酸序列比较发现，AY841017与普通小麦(Iriticum aestivum L.)Glu-D3位点编码的LMW-GS基因有很高的一致性。     

小麦品种“良麦2号”α-醇溶蛋白基因序列分析

根据α-醇溶蛋白基因编码区两端保守区设计引物，对小麦品种“良麦2号”总DNA进行PCR扩增得到约900bp的DNA片段，对其进行克隆测序，获得3条基因序列，GenBank登录号分别为：DQ417343、DQ417344和DQ417345。其中，DQ417343和DQ417345分别为942bp和921 bp，可分别编码313和306个氨基酸残基；而DQ417344编码区长度为852bp，由于存在2个提前终止密码子，不能编码有功能的成熟蛋白，为假基因。序列比对显示这3个基因与已知α-醇溶蛋白基因有较高一致性，但在N-端重复区和多聚谷氨酰胺区存在一些差异。     

黑籽南瓜中NBS类抗病基因同源序列的克隆与表达分析

黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia)是云南特有的对病害有较强抗性的一种瓜类作物。为发掘利用其蕴含的优异抗病基因资源,本研究根据已克隆到的植物核苷酸结合位点(nucleotide binding site,NBS)类抗病基因的保守氨基酸结构域基因设计简并引物,通过PCR扩增从黑籽南瓜基因组中分离了8条黑籽南瓜抗病基因同源序列(resistance gene analogous,RGAs),聚类分析和相似性比较结果显示,黑籽南瓜抗病基因同源序列2(black seed squash resistance gene analogous 2,HQRGA2(Gen Bank No.:MG946756)单独为一类,且具有核苷酸结合衔接子(nucleotide-binding adaptor shared by APAF-1,R proteins and CED-4;NBARC)结构,其余7条序列均不具有NBS保守结构域。核苷酸相似性分析表明,HQRGA2与部分抗病基因序列的相似性达到87%~99%,其中与南瓜(Cucurbita maschata)NBS类抗病蛋白基因13(squash resistance gene analogous,SQRGA-13)和SQRGA-8的相似性分别达到98.0%和97.0%。对HQRGA2编码的氨基酸保守结构域分析表明,其含有NBS类抗病基因的4个保守模块:P-loop、Kinase-2、Kinase-3a和GLPL区,且属于无Toll蛋白或白介素1受体类似的NBS富亮氨酸重复(non toll/interleukin-1 receptor like of NBS plus leucine-rich region,non-TIR-NBS-LRR)类抗病基因同源序列。HQRGA2编码氨基酸的同源性分析结果表明,其与南瓜抗病蛋白基因SQRGA-13氨基酸同源性较高,达到96.6%,与其余抗病基因同源性在16.6%~43.8%之间,NBS区域氨基酸系统进化树分析结果表明,HQRGA2可能是一个新的抗病基因片段。q RTPCR分析表明,黑籽南瓜HQRGA2片段的表达受尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的胁迫诱导,表现出先扬后抑的表达模式,说明HQRGA2可能为抗病相关基因片段。黑籽南瓜中NBS类抗病基因同源序列HQRGA2的获得为分离克隆其完整抗病基因提供了新线索。     

钩刺山羊草(Aegilops triuncialis)低分子量谷蛋白基因序列分析

根据低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)基因编码区保守序列设计引物,对钩刺山羊草(AegilopstriuncialisL,2n=4x=28,CCUU)PI483029总DNA进行PCR扩增,得到长度为900和1065bp的DNA片段,克隆测序后获得2个LMW-GS基因,GenBank登录号分别为AY841016和AY841017。它们具有小麦LMW-GS基因的典型结构特征。其中,AY841017具有完整编码区,长度为1065bp,可编码322个氨基酸残基的成熟蛋白,第一个半胱氨酸残基出现在重复区第13位。在重复区,AY841017的两个疏水单元为PIIIL和PVIIL,重复区中还存在一个连续13个Q(谷氨酰胺)组成的短肽。AY841016由于编码区内存在提前终止密码子,为假基因。氨基酸序列比较发现,AY841017与普通小麦(IriticumaestivumL.)Glu-D3位点编码的LMW-GS基因有很高的一致性。     

普通白菜PGIP基因BcPGIP分子特征研究

根据甘蓝型油菜多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因PGIP3的全长序列设计引物,从普通白菜核隐性不育两用系‘Bajh97-01A/B'可育株中成功克隆了多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因BcPGIP,对其DNA和cDNA全长序列进行分析,结果表明,该基因包含2个外显子和1个内含子,最大开放阅读框为996bp,编码331个氨基酸,共有10个LRR(Leucine-rich repeat,高氨酸富集)重复序列。将BcPGIP与其他植物的49个PGIPs蛋白进行同源序列比对后,发现PGIP蛋白特征序列非常保守。由重建的进化树可知,该基因与十字花科芸薹属的甘蓝型油菜的同源性最高。通过实时荧光定量PCR分析发现,BcPGIP基因可能与花粉的发育相关。     

植酸酶根特异表达载体的构建及大豆转化

应用PCR方法分别从胡萝卜基因组中扩增出96bp的外展蛋白信号肽编码序列片段,从拟南芥基因组中扩增出1454bp的pyk10启动子片段,用RT-PCR方法从无花果曲霉（Aspergillus ficuum3.4322）中扩增出phyA基因,长1347bp。然后,分别克隆到pMD18-T载体。应用已设计的限制酶切位点,通...     

草鱼过氧化氢酶全长cDNA的克隆、序列同源分析与组织表达

过氧化氢酶（catalase,CAT）是生物体内抗氧化防御系统的关键酶之一,在清除过氧化氢而避免机体产生氧化应激的过程中起重要作用。本研究从草鱼（Ctenopharyngodon idellus）肝胰脏中克隆了CAT完整编码序列（complete coding sequence,CDS）。该CAT序列（GenBank登陆号：FJ560431）全长2263bp,包括完全开放阅读框（ORF）1575bp、5＇非编码区（UTR）118bp和3＇UTR570bp。其ORF编码525个氨基酸残基,理论分子量为59.59kD,等电点为7.02。在草鱼CAT cDNA的终止密码子附近,其3＇UTR具有长且完整的AC重复序列,与斑马鱼、鲢鱼及啮齿类动物CAT的3＇UTR AC重复序列相似。序列比较表明,草鱼CAT的核苷酸及推测氨基酸序列与其它多种物种的一致性均较高,其一致性分别为93.4%～43.0%和98.1%～63.3%。同时,草鱼CAT cDNA的推测氨基酸序列具有与其它动物高度保守的特征性基序,包括亚铁血红素结合信号序列＂RLFSYPDTH＂、酶活性中心序列＂FDRERIPERVVHAKGA＂及3个催化位点残基His74、Asn147和Tyr357。此外,草鱼CAT还具有保守的亚铁血红素结合口袋与NADPH结合位点。根据草鱼CAT基因的上述特征,推测其属于CAT基因家族中的单功能或典型CAT基因亚群。采用实时荧光定量PCR（Q-PCR）检测草鱼CAT的组织表达特征。结果显示,草鱼CATmRNA在所检测的11种组织器官中均有表达,其中在肝中表达水平量较高,在红肌、白肌和脂肪中表达量较低。本研究结果将有助于进一步探讨鱼类CAT基因的结构与功能,并为研究其抗氧化分子机理奠定基础。     

紫杆柽柳谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆及功能鉴定

根据GenBank已公布的植物谷胱甘肽硫转移酶基因EST序列，设计引物利用3’和5’RACE方法，获得紫杆柽柳GST基因(TaGST)全长cDNA序列，全长为1175 bp，开放读码区672 bp, 编码224个氨基酸。其所编码的蛋白与大豆的GST10同源性最高为48%。利用pET-28a（+）构建了紫杆柽柳GST基因的原核表达载体，转入BL21大肠杆菌进行了原核表达。诱导表达蛋白的SDS-PAGE检测表明, 所表达的蛋白分子量约为26 kD，与预测的分子量大小一致。初步的酶学活性的检测表明所克隆的基因编码的肽段具有催化GST蛋白通用底物CDNB和GSH反应的活性。     

棉花肉桂醇脱氢酶基因GhCAD3的克隆及原核表达

肉桂醇脱氢酶(CAD)是木质素生物合成过程中的一个关键酶类。本研究从棉花中克隆了一个CAD基因,命名为GhCAD3(GenBank登录号为FJ376601)。GhCAD3全长1573 bp,具有1个1080 bp的开放阅读框,5′非编码区为35 bp,3′非编码区为458 bp,编码359个氨基酸,预测分子量约为39.116kD,等电点为7.48。氨基酸同源性分析发现,GhCAD3与其他CAD一致性为64.13%。为了进一步研究GhCAD3基因的功能,构建了该基因的原核表达载体pET-28a-CAD3,经酶切鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE电泳分析表明,最佳诱导表达条件为0.5 mmol/L IPTG在37℃下诱导7 h。     

GDA2基因的克隆、原核表达与融合蛋白的纯化

摘要：GDA2（G2 pea dark accumulated gene）是与G2豌豆（Pisum sativum L.）短日照条件下不衰老现象紧密相关的基因之一。实验用cDNA差示分析法（representational difference analysis, RDA）得到一个短日照下特异表达的G2豌豆cDNA，并命名为 GDA2。核酸序列分析表明，该cDNA全长1 120 bp，最大的开放阅读框为642 bp，编码一个由213个氨基酸构成的分子量约为24 kD的蛋白质，与GDA1的同源性为36%。在GDA2的cDNA两端分别引入Bgl Ⅱ与XhoⅠ的酶切位点，用PCR方法将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中，经过酶切筛选和测序鉴定，得到所需的表达载体pGEX-GDA2。将pGEX-GDA2导入E.coli BL21菌株，经IPTG诱导，得到分子量约51 kD的 GST-GDA2融合蛋白，并利用Glutathione Sepharose 4B亲和柱对该融合蛋白加以纯化。GDA2-GST融合蛋白的表达和纯化工作，为深入研究GDA2蛋白的结构与功能以及该基因同衰老的关系打下良好的基础。     

黑曲霉木聚糖酶基因（xynB）的克隆及真核分泌表达

通过RT-PCR方法,以黑曲霉(Aspergillus niger)GIM3.452总RNA为模板,克隆出木聚糖酶B(xy-lanase B,xynB)基因的成熟肽编码序列(567 bp),编码188个氨基酸.将其与猪腮腺分泌蛋白(parotid secretoryprotein,PSP)基因的信号肽序列通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)得到拼接片段PSxynB,并将其克隆到真核表达载体pcDNA6/HisTMA中,得到重组质粒pcDNA-PSxynB,重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且构建正确.在脂质体介导下将重组质粒pcDNA-PSxynB转染猪肾细胞(PK15),通过RT-PCR证实其在PK15细胞中表达,并在细胞培养液中测到了木聚糖酶活最高达36.4 IU/mL.     

家蚕多聚泛素基因的电子克隆、序列分析及表达谱预测

具选择性蛋白质降解功能的泛素在昆虫生长发育过程中起着重要的调控作用。本研究采用电子克隆的方法钓取家蚕基因组中多聚泛素基因序列,命名为Bm-polyUB（GenBank登录号：AADK01019318）,并进行序列分析和电子表达谱预测。序列分析表明,该编码区长3426bp,编码1141个氨基酸残基的15聚体,预测分子量和等电点分别为127.97kD和7.33,二级结构中α-螺旋、延伸带、β-转角和无规则卷曲各占17.09%、32.78%、14.37%和35.76%,亚细胞定位于细胞质、细胞核和线粒体各占43.5%、34.8%和21.7%,无前导肽、信号肽和跨膜区;多重序列比对显示,15个泛素单体基因序列间同源性和遗传距离分别介于89.0%～100.0%和0.000～0.120,其中Bm-UB3与Bm-UB10、Bm-UB5与Bm-UB7及Bm-UB10与Bm-UB14的序列相同;遗传多样性分析可见,共检出33个多态性位点,共生成12个单倍型,单倍型多样性（Hd=0.962）、平均核苷酸差异数（K=7.495）、核苷酸多样性（Pi=0.03287）、密码子有效值（ENC=41.623〈61）、偏爱指标（CBI=0.496〉0）和χ2检验计算（χ2=0.713）显示泛素单体间遗传多样性较丰富且呈现较强的密码子偏爱性;电子表达谱预测结果表明Bm-polyUB基因在家蚕中高表达的组织和发育阶段所占比例显著高于低表达。本文的研究结果可为进一步开展该基因进化机制、表达特性和生理功能等方面的实验研究提供基础资料。