固氮粪产碱菌nifH∷gusA融合基因的构建及在根际联合体系中…

采用ＰＣＲ技术，获得含粪产碱菌ｎｉｆＨ基因启动子的０．６ｋｂＨｉｎｄ－Ⅲ－ＢａｍＨＩ的扩增片段，核苷酸序列分析结果表明，该ＰＣＲ产物的序列与已报道的模板ｎｉｆＨ启动子序列完全一致。通过两轮基因连接、转化和筛选，获得ｎｉｆＨ启动子与ｇｕｓＡ正向连接的融合基因表达载体ｐＴＧＹ７。经三亲结合将ｐＴＧＹ７导入粪产碱菌中，证明该融合基因能在结合子中正常表达。采用融合基因表达的组织化学定位方法，研究粪产碱菌在     

牛分支杆菌CFP-10的原核表达及其在牛结核病诊断中的应用

低分子质量的蛋白抗原CFP-10是一种重要的牛分支杆菌早期分泌蛋白.为了检测该蛋白和其他几种抗原在牛结核病诊断中的临床应用,对CFP-10的基因进行克隆,鉴定,并在原核系统中表达.PCR法扩增cfp-10基因片段,连接到pET-22b( )原核表达载体中,再转入表达宿主E.coli BL21(DE3)PlysS菌株内,用IPTG诱导,进行蛋白表达、纯化.分别以CFP-10、ESAT-6、MPT83、MPT70、牛PPD、CFP-10与ESAT-6混合蛋白,MPT83与MPT70混合蛋白为抗原,用间接ELISA法诊断牛结核病.结果表明,以CFP-10与ESAT-6混合蛋白作为抗原检测牛结核病的特异性和敏感性分别达到了100%和63.6%,均超过了其他单抗原或抗原组合,为以筛选合适抗原为基础的血清学诊断技术提供了有力的支持并创造了良好的应用前景.     

cDNA芯片检测棉花纤维发育相关基因的表达

利用cDNA芯片技术分析E6、Lipid transfer protein(LTP)、Proline-rich protein(PRP）、Expansin、Tubulin、Annexin等家族的63个棉花纤维发育相关基因,在陆地棉徐州-142开花后10d纤维组织及其无长绒无短绒突变体开花后10d胚珠中的表达差异,发现属于E6、LTP、PRP、Expansin家族的基因在两种组织中存在显著的表达差异,符合前人的报道。其中E6、LTP家族的基因在两种组织中的表达差异最大,个别基因表达差异甚至达到15倍之多。而Tubulin家族的基因在两种组织中的表达差异不大,检测的24个Tubulin家族基因中,仅2个基因在纤维组织和胚珠中存在显著表达差异。cDNA芯片技术可以高通量鉴定棉花纤维相关基因以及研究棉花发育相关基因的表达谱。     

结核分支杆菌HSP65 DNA疫苗的制备和重组蛋白的原核表达

结核分支杆菌分子量为65ku的热应激蛋白(HSP65)是一种非常重要的抗原，为了研制结核病核酸疫苗，构建编码HSP65DNA，并将其分别克隆到原核和真核载体中进行了表达。以标准结核分支杆菌H37Rv基因组DNA为模板，用PCR法扩增出HSP65基因，经限制性内切酶消化后，插入真核表达栽体pJW4303中，获得重组质粒pJW-HSP65。同时将HSP65基因插入原核表达栽体pET-22b( )，获得重组质粒pET22b-HSP65。将pET22b-HSP65重组质粒转化大肠杆菌蛋白酶缺陷型菌株BL21(DE3)／PolysS，用IPTG诱导，进行蛋白表达。结果表明，经酶切鉴定和序列测定证实插入片断为目的基因HSP65，构建成功了真核重组质粒pJW-HSP65即可作为结核病DNA疫苗。经SDS-PAGE检验证明可以在大肠杆菌细胞中高效表达，将表达蛋白进行纯化，作为保护性结核杆菌抗原以便检测HSP65DNA疫苗的免疫效果。     

植物衰老的研究进展及其在分子育种中的应用

植物衰老是植物生命科学研究领域的核心问题之一。无论是在器官水平上还是在个体水平上，衰老都是一个高度有序的被调控的过程。近年来，已发现大批衰老相关基因以及突变体，初步阐明了叶片衰老的分子机制。而在个体水平，G2豌豆以其在短日条件下无限生长的独特发育模式，提供了很好的实验材料。PPFl(Pisum sativum post—floral genel)是首次在短日条件下G2豌豆中分离出来的与衰老相关的基因，过表达PPFl基因可以显著延迟转基因拟南芥的开花时间。最新的研究表明，它可能编码一个定位于叶绿体膜上的钙离子泵，通过调节细胞质中钙离子浓度来影响植物的生长发育。PPFl还可能通过调控LFY(LEAFY)等一系列开花途径调节基因的表达水平来影响植株的整体衰老进程。关于植物衰老的研究，不仅具有理论上的重大意义，并且在分子育种中具有潜在的价值。     

拟南芥花组织高表达TCP家族转录因子At1g30210的克隆与转录激活活性鉴定

本文从拟南芥中克隆到基因At1g30210的全长读码框。多序列比对结果表明,在推导的氨基酸水平上,该基因编码的蛋白含有特征性的TCP保守结构域,与已知的玉米、金鱼草和水稻的TCP家族基因中都存在显著性的保守性。另外通过酵母单杂交实验证明该基因编码的蛋白在酵母体内具有转录激活功能。同时RT-PCR实验结果表明,该基因在拟南芥花组织中表达量相对较高,具有明显的组织表达特异性。花器官高表达转录因子的克隆将为研究TCP基因调控植物花发育和花形态建成提供新的物质基础。     

GDA2基因的克隆、原核表达与融合蛋白的纯化

摘要：GDA2（G2 pea dark accumulated gene）是与G2豌豆（Pisum sativum L.）短日照条件下不衰老现象紧密相关的基因之一。实验用cDNA差示分析法（representational difference analysis, RDA）得到一个短日照下特异表达的G2豌豆cDNA，并命名为 GDA2。核酸序列分析表明，该cDNA全长1 120 bp，最大的开放阅读框为642 bp，编码一个由213个氨基酸构成的分子量约为24 kD的蛋白质，与GDA1的同源性为36%。在GDA2的cDNA两端分别引入Bgl Ⅱ与XhoⅠ的酶切位点，用PCR方法将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中，经过酶切筛选和测序鉴定，得到所需的表达载体pGEX-GDA2。将pGEX-GDA2导入E.coli BL21菌株，经IPTG诱导，得到分子量约51 kD的 GST-GDA2融合蛋白，并利用Glutathione Sepharose 4B亲和柱对该融合蛋白加以纯化。GDA2-GST融合蛋白的表达和纯化工作，为深入研究GDA2蛋白的结构与功能以及该基因同衰老的关系打下良好的基础。     

采用限制性酶切片段长度多态性和PCR指印技术对牛结核分枝杆菌分型研究

5株牛结核分枝杆菌DNA经PvuⅡ消化后，用来自IS1081中的248bp荧光探针杂后后进行限制性酶切片长度多态性（RFLP）分型，5株牛分离株中4株具有相同杂交带型，剩余的1株在3．6kb处多了1条带。将248bp探针对北京牛结核分枝杆菌分离株的RFLP分型法结果与直接反向PCR分型法对上述分离株分型结果比较发现：5株牛结核分枝杆菌分离株中有2株具有相同的PCR指印带型，剩余3株牛结核分枝相杆菌分离株则PCR指印带各不相同，上述结果显示出，直接反向PCR分型法较标准的RFLP分型法分型能力强。直接PCR法对新疆牛结核分枝杆菌分离株的分型结果显示出，PCR指印带型中带数较少，且与北京牛结核分枝杆菌分离株的PCR指印带型截然不同。     

结核分枝杆菌ESAT-6 DNA疫苗的细胞和体液应答及保护效率研究

构建了含分枝杆菌抗原ESAT_6( 6kDa)分泌蛋白 (结构基因 )的真核表达载体pJW43 0 3 ,进行了酶切鉴定和序列分析 ,确定含有正确的读码框。用脂质体介导法将重组表达质粒导入COS7细胞内并瞬时表达 ,收集表达细胞或浓缩上清液 ,进行SDS_PAGE电泳 ,用结核杆菌特异性抗体进行免疫印迹检测 ,证明上述重组质粒能在哺乳动物细胞中表达出特异蛋白。重组表达质粒肌注免疫小鼠 ,首免后 2 1d,未检测到特异性抗体 ,二免和三免 2 1d后ESAT_6的特异性抗体平均效价分别为 1∶40 0和 1∶80 0。三免后 2 1dESAT_6的特异性细胞因子γ_干扰素的浓度为 1 2 .8± 0 .4ng/mL,而阴性对照空载体DNA组三免后只诱导产生 <0 .1ng/mL的γ_干扰素。三免后经静脉强毒攻击 ,免疫组小鼠肺脏的细菌数比对照空载体组减少了 90 %以上。本研究表明 ,该核酸疫苗能同时诱导机体产生细胞和体液免疫应答并获得较高的保护效率。