肿节风炭疽病拮抗真菌筛选及作用机理研究

[目的]筛选肿节风炭疽菌(Colletotrichum dematium)拮抗真菌,为肿节风炭疽病的生物防治提供科学依据.[方法]采用平板稀释法和平板对峙法从肿节风主产区广西靖西市和都安县健康肿节风根系土壤中筛选出对肿节风炭疽病菌及14种其他植物病原真菌具有较强抑制作用的真菌,采用ELISA试剂盒测定拮抗真菌无菌发酵液中的蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶含量,综合平板对峙培养、抑菌谱及产酶能力选取综合表现最优的拮抗菌株;基于形态学和分子生物学特征对拮抗菌株进行鉴定.[结果]平板对峙试验结果表明,菌株JT-8、JT-3和DT-5对肿节风炭疽病菌具有较强的拮抗作用,其中拮抗作用最强的菌株是JT-8,对炭疽病菌的抑制率达91.57%.抗菌谱测定结果表明,菌株JT-8、JT-3和DT-5对供试14种病原真菌均有明显的拮抗作用,其中拮抗作用最强的为菌株JT-8,平均抑制率达89.88%,该菌株可产生几丁质酶、纤维素酶和蛋白酶,可抑制炭疽病菌菌丝生长,病原菌菌丝表现为扭曲、断裂、分支缠绕和颜色加深等.通过形态学观察和ITS测序鉴定,确定菌株JT-8为淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum).[结论]淡紫紫孢菌对肿节风炭疽病病原菌具有强拮抗作用,能产生多种抗菌活性物质,且广谱抑菌,具有较好的生防开发潜能.     

溶磷放线菌Micromonospora nigra SY7的溶磷特性与抗病促生活性测定

将溶磷放线菌菌株SY7溶磷条件进行优化,测定其抗病促生活性,以期为开发高效微生物肥料提供优良菌株.从初始pH、培养基、碳源、氮源和磷源5个方面对溶磷条件进行优化;用CAS固体培养基鉴别菌株分泌铁载体能力,对峙培养法检测抗病能力,植物培养试验检测促生能力.结果 表明:菌株SY7在pH为8、葡萄糖为碳源、Ca3(PO4)2为磷源、(NH4)2SO4为氮源时溶磷效果最好;菌株能够分泌促进植物生长的铁载体;能够抑制串珠镰孢病菌(Fusarium moniliforme)、返魂草黑斑病菌(Scenedesmophilus sp.)、禾谷镰孢病菌(Fusari-um graminearum)3种病原菌的生长;能够有效促进玉米生长.高效溶磷放线菌黑色小单孢菌SY7菌株在优化条件下,能将多种难溶性磷转化为植物可利用的有效磷,使土壤中的有效磷含量增加,同时具有很强的抗病促生作用.     

生防细菌TB17的筛选、鉴定及其对苦瓜枯萎病的生防作用

【目的】筛选并鉴定对苦瓜枯萎病具有生防应用潜力的拮抗菌株。【方法】从河南省南阳桐柏山景区采集土壤样品,先通过梯度稀释涂布平板法分离、纯化获得细菌纯培养,再通过平板对峙培养法筛选获得1株对植物病原菌具有稳定抑菌活性的拮抗菌株TB17。【结果】试验分别测定其形态学特征和生理生化特征,并结合16S rRNA基因序列将菌株TB17鉴定为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)。平板对峙试验结果表明,菌株TB17对苦瓜枯萎病菌生长抑菌率为49.03%,其稀释5倍和10倍的无菌发酵滤液对苦瓜枯萎病菌生长抑制率为63.96%和54.95%。拮抗谱测定结果表明,菌株TB17对苦瓜枯萎病菌、玉米大斑病菌、苹果轮纹病菌、小麦全蚀病菌等7株靶标菌都具有一定的拮抗活性。【结论】菌株TB17可以促进苦瓜生长,并对苦瓜枯萎病表现出良好的防治效果,其防效达76.92%。     

一株香蕉枯萎病拮抗菌的筛选、鉴定及生防效果研究

【目的】筛选获得对香蕉枯萎病病原菌具有拮抗作用的菌株,为香蕉枯萎病生物防治提供菌株资源。【方法】以香蕉根际土壤为材料,利用铬天青（Chromeazurol S,CAS）双层平板法和平板对峙法筛选可分泌铁载体且对香蕉枯萎病菌具有拮抗作用的菌株;通过平板对峙法测定拮抗菌株对6种常见植物病原菌的拮抗活性;通过形态学观察、生理生化测定和16S rDNA序列分析明确拮抗菌株的分类地位;通过盆栽试验验证拮抗菌株对香蕉枯萎病的防治效果及对香蕉植株的促生作用。【结果】经CAS培养基初筛,从土壤中分离获得60株可分泌铁载体的菌株,平板对峙法复筛得到5株拮抗作用较强的菌株,其中菌株Gxun-2的抑菌效果最强,平均抑菌率达74.45%,且对供试的其他6种植物病原菌均具有较好的抑制效果,具有广谱抗菌性。结合菌落形态、生理生化及16S rDNA进化树分析结果,菌株Gxun-2鉴定为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。盆栽试验显示,菌株Gxun-2对香蕉枯萎病具有较好的防病作用,防治效果达84.21%,且对香蕉植株具有一定的促生效果,香蕉苗鲜重较对照增加32.96%。【结论】菌株Gxun-2对香蕉枯萎病具有较好的防治作用,且对香蕉植株具有一定的促生效果,可作为研制香蕉枯萎病生防菌剂的候选菌株资源。     

木霉拮抗烟草赤星病菌菌株的筛选及其生防机制

 利用诱捕法从土壤中分离得到18株木霉(Trichoderma spp.)菌株,采用对峙法从中测定、筛选出一株对烟草赤星病菌(Alternaria alternata)具有极强拮抗作用的菌株(Tv－1),光学显微镜及透射电镜观察结果表明,Tv－1菌株的生防机制主要为生长竞争、重寄生作用以及产生生物活性类物质使病菌菌丝消解的直接抗菌作用,表现为Tv－1菌株菌丝生长迅速;能附着、缠绕于病菌菌丝上,并产生吸器侵入菌丝;同时还能分泌使病菌菌丝原生质浓缩、断裂、消解的物质。     

山核桃果皮提取液的抑菌活性研究

[目的]初步研究山核桃果皮提取液的抑菌活性。[方法]通过测定山核桃果皮提取液对供试黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum和番茄灰霉病菌Botrytis cinerea Pers.菌丝生长和分生孢子萌发的抑制作用,初步研究了山核桃果皮提取液的抑菌活性。[结果]核桃果皮提取液除了能抑制供试菌株菌丝生长外,对病原菌孢子萌发和芽管生长也具有显著的抑制作用。培养9h后,与对照相比,对黄瓜枯萎病菌孢子萌发的抑制率为73.9%,芽管长的抑制率为63.5%;对番茄灰霉病菌孢子萌发的抑制率为82.7%,芽管长的抑制率为65.1%。此外,山核桃果皮提取液具有明显的促进黄瓜种子发芽的作用。[结论]该研究为山核桃果皮提取物开发为杀菌剂提供理论依据。     

1株黄瓜枯萎病菌拮抗酵母的分离鉴定 及其拮抗作用初探

采用平板对峙法从葡萄果表分离的酵母菌中筛选出1株对黄瓜枯萎病病菌具有较强拮抗作用的酵母菌菌株1-101。通过形态特征、生理生化特征和26S r DNA D1/D2区分析研究菌株1-101的分类地位;从拮抗酵母菌与病原菌共培养、拮抗酵母菌的挥发性物质对病原菌的影响以及拮抗酵母菌对病原菌的抗生作用研究菌株1-101对黄瓜枯萎病菌的拮抗机理。结果表明,菌株1-101属于葡萄有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum),它在固体培养基上对供试的黄瓜枯萎病病菌具有完全抑制作用,其挥发性物质对病原菌的抑菌率高达52%,在液体中共培养的拮抗酵母菌对病原菌有抗生作用。     

压砂西瓜枯萎病生防木霉菌筛选及其拮抗机制研究

为了获得对压砂西瓜枯萎病具有生防作用的木霉菌株,从中卫香山压砂地不同作物根际土壤分离得到22株木霉,通过与西瓜枯萎病菌对峙培养,筛选出6株具有较强拮抗能力的木霉菌株,并对其发酵液抑菌活性及拮抗机制进行了研究。结果表明,6株木霉菌对枯萎病菌的抑菌率在76.92%以上,其中Ty3菌株的抑菌率最高,为83.29%,该木霉发酵液的抑菌率为84.57%,其产生的挥发性和非挥发性代谢物对病原菌的抑菌率分别为59.83%和90.60%。观察结果表明,木霉菌可通过竞争、重寄生作用及产生抗生物质等方式抑制枯萎病菌菌丝生长与扩展,显微镜下观察到木霉菌丝附着或缠绕病原菌丝上吸取营养,致使病原菌丝变形、断裂、消解。综上所述,Ty3菌株可作为压砂西瓜枯萎病生物防治的拮抗菌加以开发应用。     

烟草赤星病生防芽孢杆菌的筛选鉴定及其生长条件研究

为获得对烟草赤星病有效的生防菌,通过平板对峙培养法和双层平板打孔法从贵州省瓮安县植烟土壤中筛选对烟草赤星病菌有较强拮抗作用的细菌;通过菌株形态、生理生化特征,结合16S r DNA及gyrA联合基因序列分析对筛选出的菌株进行鉴定;采用单因素试验对生防菌株的生长条件进行初步研究。结果表明,筛选出对赤星病菌有较强拮抗作用的生防菌株F11,其无菌发酵上清液对病原菌生长的抑菌带可达23. 5 mm,根据菌株形态、生理生化特性、16S r DNA及gyrA联合基因序列分析,将生防菌F11鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。该菌株在10～45℃、pH值3. 5～10. 0条件下均能生长,对碳源、氮源利用较广泛,最适生长条件为:培养时间18 h,温度35℃,pH值6. 0,葡萄糖作为碳源,蛋白胨作为氮源。菌株F11对烟草赤星病菌抑菌作用较强,具有应用于该病害生物防治的潜力。     

茶园土壤拮抗放线菌的分离和筛选

以辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）为指示菌,采用平板对峙法,从茶园土壤中筛选到9株具有明显拮抗效果的放线菌,菌株抗菌谱较广,对茶白星病菌、烟草黑胫病菌、水稻纹枯病菌、黄瓜腐霉病菌有较好的拮抗作用．其中3株菌株发酵液对烟草黑胫病菌抑制作用较强,其抑制率分别达78．8％、61．2％、56．5％．     

浙江临安山核桃干腐病发生发展规律

山核桃Carya cathayensis干腐病是影响山核桃树体生长发育、造成果实减产的最主要病害,在浙江省临安市山核桃产区发生普遍。为了控制病害的发展,减少因病害造成的损失,对临安市山核桃主产区的山核桃林进行了广泛的调查与定株观察。研究发现:该病每年3月下旬始发,至11月下旬以菌丝体在病组织越冬。山核桃干腐病的发生与树龄、郁闭度、结实情况、立地条件、经营水平等因子有关。10~30年生的树木发病最严重,树木郁闭度高,立地条件好,经营水平高的地方发病较轻。图1表4参10     

山核桃干腐病病原菌的鉴定

葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae真菌是很多木本植物溃疡病和枯梢病的重要病原菌。已有报道认为:山核桃干腐病病原菌为茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea,但对于葡萄座腔菌科其他真菌与山核桃干腐病的关系还没有深入研究。分离得到了山核桃干腐病相关病原菌,通过比较其形态学特征和核糖体DNA内转录间隔区(rDNA ITS)序列特征,将分离得到的供试菌株分为3组。根据形态学特征和基于ITS序列的系统发育分析,3组菌株分别鉴定为Botryosphaeria dothidea,B.fabicercianum和B.obtusa。其中B.dothidea为优势菌株,分离频率为71.42%,B.fabicercianum和B.obtusa分离频率分别为14.28%。经致病性测定,上述分离菌株均能引起健康山核桃Carya cathayensis枝条发病,但致病性存在差异。在山核桃上发现的B.obtusa和B.fabicercianum为首次报道。     

山核桃外果皮提取物抑菌活性的初步研究

采用甲醇溶剂对山核桃Carya cathayensis外果皮进行提取,并用提取物对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea,番茄早疫病菌Alternaria solani,黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporumf.cucumerinum,黄瓜炭疽病菌Colletotrichum lagenarium,棉花枯萎病菌Fusarium oxysporumf.vasinfectum等15种病菌进行抑菌试验。结果表明：在供试质量浓度为干样100 g.L-1时,山核桃外果皮甲醇提取物对黄瓜炭疽病菌、黄瓜菌核病菌、苹果腐烂病菌和辣椒疫病菌等4种病菌的抑制率为100%,除玉米小斑病菌Bipolaris maydis外,对其余的10种病菌抑制率都在69%以上。对其中6种供试病菌菌丝生长的毒力测定试验表明：山核桃外果皮甲醇提取物对水稻纹枯病菌Rhizoctonia solan的菌丝生长抑制作用最好（半数效应质量浓度为29.8 g.L-1）,其次为番茄灰霉病菌（半数效应质量浓度为31.1 g.L-1）,对玉米大斑病菌Exserohilumturcicum作用最差（半数效应质量浓度为46.2 g.L-1）。利用山核桃外果皮开发植物源杀菌剂值得进一步研究。     

喀斯特经济植物山核桃抗旱性对Fe的响应

用称量法、硫代巴比妥酸法、茚三酮比色法分别测定了经不同浓度FeSO4预处理后山核桃在干旱胁迫下的相对含水量、丙二醛含量、脯氨酸含量,并用模糊数学隶属函数法对山核桃抗旱性进行了综合评判。结果表明:适宜浓度的微量元素Fe对山核桃抗旱能力具有较强的促进作用,干旱胁迫15d后,当FeSO4预处理浓度为0.08%时,山核桃叶片相对含水量可达到最大值;当FeSO4预处理浓度为0.12%时,能最大程度抑制山核桃叶片膜脂过氧化作用的最终分解产物丙二醛的产生;当FeSO4预处理浓度为0.09%时,山核桃叶片脯氨酸含量可达最大值。因此,当FeSO4预处理浓度为0.08%~0.12%时,能增强山核桃对干旱的适应性和提高抗旱生产力。     

基于GIS的杭州市山核桃种植生态适宜性评价

根据山核桃生产的实际情况,采用 GIS 技术、模糊数学方法和层次分析法,对杭州市山核桃种植进行生态适宜性评价。首先采用特尔菲法从气候、地形、土壤条件3个方面选取生态因子,建立杭州市山核桃生态适宜性评价指标体系,再根据各生态因子对山核桃生长与品质的影响建立隶属函数,并运用层次分析法计算各指标权重。评价结果表明：杭州市山核桃最适宜栽培面积占评价区域的30.54%,适宜栽培面积占46.52%,不适宜栽培面积占22.94%。该研究运用空间模糊综合评价方法所得出的评价结果与目前杭州市山核桃种植区的分布大体一致,较之传统的评价方法,该方法具有评价周期短、评价结果更加精确、更有利于小区域范围内生态适宜性评价等优点。     

山核桃ISSR反应体系的优化

采用改良的CTAB法提取山核桃基因组DNA,该方法提取的DNA纯度与含量较高。以宁国山核桃居群为试材,用引物UBC810[序列为（GA）8T]研究了PCR反应体系的5种主要组分对山核桃ISSR扩增结果的影响。结果显示：除模板DNA含量外,其它因素均对扩增效果有明显影响。建立的反应体系为：20μL反应体系中DNA模板量30ng、引物浓度0.3μmol/L、dNTPs浓度0.3mmol/L、Mg2＋浓度2.0mmol/L、TaqDNA聚合酶用量1U。     

草酸青霉和棘孢木霉对青枯劳尔氏菌的生防效果

  目的  探究自主筛选获得的2株生防菌棘孢木霉Trichoderma asperellum QZ2与草酸青霉Penicillium oxalicum QZ8对青枯劳尔氏菌Ralstonia solanacearum(简称青枯菌)的生防效果。  方法  以青枯菌作为靶标菌,通过平板培养法、生长曲线法测定2株生防菌及其发酵液对青枯菌生长的抑制作用;通过土培试验、基于稀释涂布法测定生防菌在土壤中对青枯菌的抑制效果。  结果  平板对峙培养试验发现:棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8对青枯菌有显著的抑制作用(P＜0.05),抑制率分别达80.9%和45.9%;棘孢木霉QZ2与草酸青霉QZ8生防菌高温灭菌发酵液对平板培养青枯菌,同样呈显著的抑制作用(P＜0.05),抑制率分别达33.3%和34.8%。无菌滤膜处理的未高温灭菌2株生防菌发酵液的青枯菌液培养结果表明:其D(600)显著小于未添加生防菌发酵液的对照D(600)(P＜0.05),且棘孢青霉QZ8抑制效果好于草酸木霉QZ2。土壤培养结果显示:2株生防菌处理的土壤中青枯菌的活菌数量显著低于未添加生防菌的对照(P＜0.05)。  结论  棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8对青枯菌均有显著的抑制效果,可作为番茄Lycopersicon esculentum青枯病的潜在生防菌。图5表2参32     

山核桃干腐病拮抗细菌的鉴定及其抑菌效果

在山核桃干腐病病原菌的培养过程中,发现1株具有抑菌活性的生防细菌BS111,通过划线培养、形态学及分子生物学的方法进行了山核桃干腐病病原菌拮抗菌的分离纯化及鉴定,并采用平板对峙培养法研究了拮抗菌对山核桃干腐病病原菌的抑菌活性,分别测定了拮抗菌的生长曲线以及无菌滤液不同培养时间不同浓度的抑菌活性,同时对拮抗菌无菌滤液的抑菌活性稳定性进行了研究,并通过光学显微镜研究了其抑菌机理。鉴定结果表明,BS111为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对峙培养结果显示,该拮抗菌菌体对山核桃干腐病病原菌具有明显的抑制作用,抑菌圈直径为18 mm。对拮抗菌生长曲线以及抑菌活性随时间的变化的测定结果显示,拮抗菌BS111在12~24 h为对数期,24 h后进入稳定期,36 h后进入衰亡期,无菌滤液在前12 h抑菌率几乎为0,在24 h时抑菌率迅速增长至70.65%,在60~72 h,抑菌效果有明显提高,最高抑菌率为83.26%。对不同浓度无菌滤液抑菌活性的测定结果表明,抑菌活性随体积分数的降低而下降,EC50值为4.16%。抑菌活性稳定性研究结果表明,无菌滤液对温度不敏感,随p H的升高抑菌活性上升,经紫外光照射后抑菌活性有部分提高。通过光学显微镜观察,无菌滤液能使菌丝变粗,弯曲,有褶皱,部分原生质体消失,菌丝顶端膨大变粗等。