牦牛FSHR基因5′端部分序列克隆及生物信息学分析

利用PCR和T-A克隆技术,测定了麦洼牦牛和杂种犏牛的FSHR基因5′端侧翼区和第1外显子的核苷酸序列,并运用BLAST、DNAMAN、Clustal等生物信息学软件与其他物种的相应序列进行了同源性比对分析,为牦牛FSHR基因结构、犏牛雄性不育、牦牛遗传多样性,以及FSHR基因与牦牛的繁殖、产肉、产奶性状相关分析提供了理论基础。结果表明:牦牛和犏牛FSHR基因5′端侧翼区长度为970bp,普通牛、羊和猪的该序列长度分别为970、973和981bp,序列长度差异较小;序列突变以碱基替换为主,牦牛与犏牛、普通牛、羊及猪的核苷酸序列一致性分别为99.4%、99.3%、98.2%、96.9%,一致性较高,为同源基因。聚类分析中牦牛与犏牛首先相聚,再依次与普通牛、羊、猪聚在一起。根据核苷酸序列推测,氨基酸组成分析显示,牦牛和犏牛的该蛋白疏水性,蛋白的亲水性和稳定性较差,为不稳定的脂溶性蛋白;二级结构主要以α螺旋和随机卷曲为主。     

牦牛及杂种后代犏牛的TSPY基因克隆分析

克隆测序了牦牛、犏牛TSPY基因的编码区全序列,并用生物信息学软件分析了该基因的编码区序列、蛋白结构和进化关系.结果表明,牦牛和犏牛TSPY基因编码区序列长度均为954 bp,编码317个氨基酸,牦牛与普通牛TSPY基因序列的一致性分别为98.95％,犏牛与牦牛、普通牛TSPY基因序列的一致性分别为98.95％、99.79％,杂交后代犏牛与亲本序列差异表现在第113位核酸位点发生了改变(T→T→C),导致第38位氨基酸发生变化(V→V→A).牦牛和犏牛TSPY蛋白含有TSPY家族典型的SET/NAP保守结构域,与人、鼠TSPY蛋白结构域一致,推测牦牛和犏牛TSPY蛋白在雄性减数分裂过程中参与了精原细胞和初级精母细胞的调节.     

牦牛及杂种后代犏牛的TSPY基因克隆分析

 克隆测序了牦牛、犏牛TSPY基因的编码区全序列,并用生物信息学软件分析了该基因的编码区序列、蛋白结构和进化关系。结果表明,牦牛和犏牛TSPY基因编码区序列长度均为954 bp,编码317个氨基酸,牦牛与普通牛TSPY基因序列的一致性分别为98.95%,犏牛与牦牛、普通牛TSPY基因序列的一致性分别为98.95%、99.79%,杂交后代犏牛与亲本序列差异表现在第113位核酸位点发生了改变（T→T→C）,导致第38位氨基酸发生变化（V→V→A）。牦牛和犏牛TSPY蛋白含有TSPY家族典型的SET/NAP保守结构域,与人、鼠TSPY蛋白结构域一致,推测牦牛和犏牛TSPY蛋白在雄性减数分裂过程中参与了精原细胞和初级精母细胞的调节。     

GSTM3基因在牦牛和犏牛睾丸及附睾组织中的表达研究

谷胱甘肽S-转移酶Mu 3(GSTM3）是一种必需的抗氧化酶,其在精子中的存在与精子的耐冷性、质量和生育能力有关。为研究GSTM3的表达与雄性牦牛繁殖功能的关系,本研究对牦牛附睾GSTM3基因进行克隆、生物信息学分析,并应用实时荧光定量PCR分析GSTM3基因在牦牛和犏牛附睾以及睾丸组织中的表达情况。结果表明,牦牛GSTM3基因CDS区序列长度为678 bp,编码225个氨基酸;GSTM3基因编码蛋白为弱酸性且不具有跨膜结构,分子式为C1204H1857N319O340S19,分子量和等电点分别为26.85 ku和7.29;牦牛GSTM3核苷酸序列与普通牛和瘤牛有较高的种间同源性,分别为99.26%和98.53%;GSTM3基因在牦牛和犏牛附睾以及睾丸组织中均有不同程度的表达,牦牛附睾和睾丸的GSTM3表达量显著高于犏牛。     

牦牛、犏牛、藏黄牛和普通牛HIOMT基因CDS序列的比较

褪黑激素（MLT）是调控动物季节性生殖等多种生物节律,具有复杂生理功能的一种吲哚类激素,羟基吲哚-氧-甲基转移酶（hydroxyindole-O-methyltransferase,HIOMT）是决定MLT合成波动模式的重要酶之一。采用RT-PCR法克隆并分析了牦牛、犏牛和藏黄牛HIOMT基因的CDS序列。牦牛该基因序列连续缺失123bp,通过与普通牛基因组序列比对,该缺失片断位于HIOMT基因7个外显子中的第6外显子。由于克隆所得牦牛基因组DNA相应序列未缺失上述片断,推定所获得的牦牛HIOMT基因CDS序列属可变剪接体;克隆犏牛HIOMT基因获得长、短两条件序列,长序列与藏黄牛、普通牛该序列相似,短序列与牦牛相似,但尚不能确定这两条序列各自来自父本还是母本;与普通牛HIOMT基因比较,牦牛、犏牛和藏黄牛分别有11、13（长序列17）和11个变异位点,且位于密码子第1、2位点的变异分别为4、6（7）和4个,均为非同义突变,所有非同义突变只有1处由密码子第3位变异引起,这些突变可能通过影响蛋白结构进而影响其生物学功能。还预测了牦牛、犏牛、藏黄牛和普通牛HIOMT蛋白相对分子量、理论等电点、疏水性、跨膜区等。HIOMT的保守性较强,是系统进化研究较理想的分子标记。     

牦牛和犏牛促卵泡素受体基因5′-侧翼区序列多态性研究

本研究旨在分析牦牛和犏牛促卵泡素受体(follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)基因的多态性,为从遗传角度上解决其繁殖产仔率低的问题提供参考,为筛选繁殖性状分子标记奠定理论基础。研究采用PCRSSCP和直接测序技术,对麦洼牦牛、九龙牦牛、大通牦牛和犏牛共110头个体的FSHR基因5′-侧翼区进行遗传多态性分析,统计基因频率和基因型频率,进行Hardy-Weinberg平衡性检测,计算纯合度、杂合度、多态信息含量和有效等位基因数等遗传多态性指标。结果表明,麦洼牦牛、大通牦牛和九龙牦牛FSHR基因5′-侧翼区核苷酸序列具有多态性,犏牛无多态性;麦洼牦牛存在AA、AB和BB 3种基因型,九龙牦牛和大通牦牛均存在AA、AB 2种基因型,AB基因型在3个牦牛品种中占绝对优势,等位基因A为优势等位基因;麦洼牦牛、九龙牦牛和大通牦牛的多态信息含量分别为0.3693、0.3565、0.3705,均达到了中度多态(0.25PIC0.5),表明各牦牛品种遗传变异较大。     

牦牛谷胱甘肽过氧化酶1基因(GPX1)的克隆及系统发育分析

本研究克隆了牦牛谷胱甘肽过氧化酶1GPX1基因的CDS区序列,分析了其核苷酸序列,并进行了系统发育分析。结果表明,牦牛GPX1基因CDS区全长618 bp,编码205个氨基酸;经与GenBank中其他物种GPX1基因CDS区比对,牦牛GPX1基因CDS区与普通牛和瘤牛完全一致,与水牛、绵羊和猪的序列一致性较高,与其他哺乳动物序列一致性较低。本研究为深入研究牦牛GPX1的生理功能提供了参考资料。     

牦牛心脏脂肪酸结合蛋白基因的分子克隆和进化分析

对牦牛心脏脂肪酸结合蛋白（H-FABP）基因进行了克隆测序，并与GenBank中9个物种相应基因编码区核苷酸序列进行了比对分析，在此基础上采用邻接法、最大简约法和最小进化法构建了牦牛与其它物种间分子系统进化树。结果表明，牦牛H-FABP基因由4个外显子和3个内含子组成，外显子1、外显子2、外显子3和外显子4大小分别为73、173、102和54bp，内含子1、内含子2和内含子3大小分别为3460、1892和1495bp。CDS序列全长为402bp，前体氨基酸数为133个。不同物种间在该基因核苷酸序列上有较高的保守性。牦牛与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼各物种在H-FABP基因编码区核苷酸序列上同源性大小分别为99．8％、97．8％、97．0％、92．8％、88．8％、83．3％、83．1％、76．4％、68．7％。通过邻接法、最大简约法和最小进化法用H-FABP基因编码区核苷酸序列构建的物种间分子系统进化树，结果表明，3种方法构建的物种间分子系统进化树基本一致。系统树总体分为两支，斑马鱼为独立的一支，而牦牛与其它物种为另一大分支。牦牛与普通牛、绵羊与山羊先分别聚在一起，然后再聚为一类；后与猪、人依次聚为一类。小鼠和大鼠先聚为一类，再与人和其它物种聚类，然后再与鸡聚为一类。该系统聚类结果与动物学分类一致，表明H-FABP基因适合于构建不同物种间的系统进化树。     

牦牛DDAH1和DDAH2基因的克隆测序及其在牦牛和犏牛睾丸中的表达差异

为了测定牦牛DDAH1和DDAH2基因序列并比较其在牦牛和雄性不育犏牛睾丸中的表达,以探究该基因与犏牛雄性不育的联系,试验从牦牛睾丸中提取总RNA,采用RT-PCR技术克隆并测序获得牦牛DDAH1和DDAH2基因的c DNA序列;利用实时荧光定量RT-PCR技术检测这两个基因在牦牛与犏牛睾丸中的表达。结果表明:克隆获得的牦牛DDAH1和DDAH2基因序列分别长959 bp及1 091 bp,均包含858 bp的CDS区。DDAH1基因序列与普通牛相比有4个碱基差异,序列同源性为99.58%,而推导的氨基酸序列仅存在1个氨基酸残基差异;DDAH2基因序列与普通牛比较相差1个碱基,序列同源性为99.91%,推导的氨基酸序列存在1个氨基酸残基差异。DDAH1和DDAH2基因在牦牛和犏牛睾丸组织中均有表达,DDAH1基因在犏牛睾丸组织中的表达量显著高于牦牛(P0.05),是牦牛睾丸组织中表达量的1.5倍;DDAH2基因在犏牛睾丸中的表达量与牦牛相比差异不显著。说明DDAH基因表达在犏牛睾丸中上调可能与其雄性不育有关。     

牦牛PRDM9基因的CDS序列及其生物信息学分析

文章通过RT-PCR技术克隆了牦牛PRDM9基因的cDNA序列,利用DNAMAN、MAGA4、ExPASy等多个生物信息学软件进行了分析研究。结果表明:扩增出的牦牛PRDM9基因的编码区长1 533 bp,编码510个氨基酸。与普通牛、人和鼠相应基因核苷酸序列进行比对,其一致性分别为99%、76%和69%。预测的牦牛PRDM9蛋白二级和三级结构显示它是一个具有3种功能结构域的弱碱性螺旋状蛋白。这为今后的进一步研究提供了理论基础。     

牦牛和雄性不育犏牛睾丸FABP5和FABP9基因mRNA水平及能量代谢相关酶活力的比较

本研究旨在测定牦牛表皮细胞型脂肪酸结合蛋白(FABP5)和睾丸型脂肪酸结合蛋白(FABP9)基因序列,比较其在牦牛和雄性不育犏牛睾丸中的表达,并结合睾丸中部分能量代谢相关酶的活力分析,以探索这两个基因及能量代谢与犏牛雄性不育之间的联系。试验从牦牛睾丸中提取总RNA,采用PCR方法获得了牦牛FABP5和FABP9基因的cDNA序列,编码区长度分别为408和399bp,与普通牛相比分别有1个和6个碱基差异,后者导致FABP9基因推导的氨基酸序列存在5个氨基酸差异。实时荧光定量PCR分析显示,FABP5基因在犏牛睾丸中的表达量极显著大于牦牛,而FABP9基因表达量差异不显著。犏牛睾丸中异柠檬酸脱氢酶活力极显著高于牦牛(P0.01),而β-羟脂酰CoA脱氢酶和乳酸脱氢酶活力与牦牛接近。犏牛睾丸中FABP5基因表达上调以及参与三羧酸循环的柠檬酸脱氢酶活力提高,可能提示雄性不育犏牛睾丸组织在脂肪酸氧化供能水平上高于成年牦牛。     

海西州莫河骆驼场犏牛暖棚育肥指导

1现状1.1犏牛的一般生物学特性依托项目发展,2012年莫河骆驼场开始大面积养殖犏牛,犏牛是普通牛与牦牛杂交后产生的后代,普通公牛与母牦牛杂交,其杂种称"真犏牛",公牦牛与普通母牛杂交,其杂种称"假犏牛"。无论"真"、"假"犏牛雄性均不育。犏牛无论     

牦牛IL-4基因的克隆及其遗传演化关系分析

克隆牦牛白细胞介素-4（IL～4）基因,并对其进行遗传演化分析。从刀豆素（ConA）和脂多糖（LPS）联合刺激培养的牦牛外周血淋巴细胞提取总RNA．利用RT—PCR方法扩增牦牛IL-4全长cDNA,将其克隆到pMD18～T载体上,测序后进行序列分析。成功克隆到牦牛IL-4基因全序列,序列分析表明,克隆的牦牛IL-4基因序列与GenBank所登录的牛IL-4核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别这99．8％和100％,与人、猕猴、猪、山羊、马等物种的核苷酸及其推导氨基酸序列的同源性分别在44．4％～96．3％和27．4％～91．1％之间。在国内首次成功地从牦牛外周血淋巴细胞中克隆到IL-4的基因,其ORF为408bp,推导编码135个氨基酸。     

安犏牛线粒体DNA分析及系统进化研究

安格斯牛与牦牛杂交所产F_1犏牛显示出较高的杂交优势,不仅耐高寒、耐粗饲,而且弥补了牦牛生长慢的缺点。为了解安犏牛的线粒体结构特性,从二代测序数据中组装了安犏牛[Angus cattle(Bos taurus;♂)×Gannan yak(Bos grunniens;♀)]完整的线粒体基因组。结果表明:安犏牛基因组大小为16 320 bp,包含13个PCGs、22个tRNAs、2个rRNAs及1个控制区(D-loop);OL长度为31 bp(6 049～6 079),介于tRNA-Asn和tRNA-Cys之间;4种碱基含量分别为33.7%A、25.8%C、13.2%G和27.3%T;此外,发现其基因组序列与前人发表的牦牛线粒体全基因组序列基本一致,系统发育分析表明,安犏牛与雪多牦牛、麦洼牦牛、娘亚牦牛、玉树牦牛及青海高原牦牛关系最为密切。该研究结果可为牦牛杂交改良或犏牛生产提供基础数据和技术参考。     

类乌齐牦牛UCP3基因克隆与序列分析

利用RT-PCR方法成功克隆UCP3基因,对其核苷酸序列及氨基酸序列进行生物学在线分析。结果表明,类乌齐牦牛UCP3基因CDS区序列长为936bp,A、G、C和T平均含量分别为20.83%、28.63%、31.09%和19.44%;与普通牛UCP3基因CDS区序列一致性高达99%;共发现碱基突变位点6个,其中同义突变4个,反义突变2个。UCP3基因共编码311个氨基酸,分子质量为34.18ku,理论等电位点9.53;其主要分布在线粒体内膜上,为非分泌蛋白;具有α-螺旋、无规则卷曲、延伸链、β-转角等结构。由系统进化树可知,类乌齐牦牛与野牦牛最接近,与普通牛次之。     

犏牛的暖棚育肥

1犏牛的生物学特性犏牛是普通牛与牦牛杂交后产生的后代。普通公牛与母牦牛杂交,其后代称“真犏牛”;公牦牛与普通母牛杂交,其后代称“假犏牛”。无论真”“、假”犏牛雄性均不育。犏牛无论公母牛其体尺、体重以及生产性能均比亲代有较大的提高,但犏牛与牦牛的外貌特征、生活习性等基本相似。在我国北方,冬季寒冷而漫长,制约着家畜的正常生长与发育,采用塑膜暖棚综合养殖技术从事牛、羊繁殖与舍饲育肥,可有效地提高家畜的生产能力,是推动畜牧业高产、稳产的一项重要措施。冬春扣棚120￣150天左右,成年牛死亡率降低8.0%,犊牛成活率提高4.7%,…     

牦牛SLC25A31基因的CDS序列及其表达蛋白生物信息学分析

为了研究牦牛ANT4在脑组织中的表达情况,试验通过RT-PCR技术克隆牦牛SLC25A31基因的cDNA序列,并利用DNAMAN、MAGA4、SWISS-MODEL、ExPASy等生物信息学软件系统对其进行分析。结果表明:扩增出的牦牛SLC25A31基因的编码区长972 bp,编码323个氨基酸;与普通牛、鼠和人相应基因核苷酸序列进行比对,序列一致性分别为99.28%、84.88%和89.81%;其编码蛋白分子质量为35.695 ku,含多个修饰位点。说明SLC25A31基因的CDS序列及其表达蛋白的结构在高原牦牛与普通牛间并无明显差异,保守性极强;并且通常在睾丸中表达的ANT4在高原牦牛脑组织中也能表达。     

牦牛肿瘤坏死因子-α基因部分片段的克隆测序

根据普通牛和其他哺乳动物基因的碱基序列和相关文献资料设计引物,用PCR扩增并测定了牦牛肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因的部分序列。结果表明,TNF-α基因片段(1160bp)包括外显子3～4、内含子2～3,3'侧翼区和外显子2的部分序列。通过GenBank中的Blastn序列比较分析,牦牛的TNF-α基因与普通牛种同源性高达98%。这为开展牦牛功能基因组计划和分子育种提供了理论依据。     

牦牛CAPS基因克隆及生物信息学分析

钙磷蛋白(calcyphosine, CAPS)是一种钙结合蛋白,对维护生物体内钙磷平衡起着重要作用。本研究克隆了牦牛CAPS基因的CDS区序列,分析了其核苷酸序列,并进行了生物信息学分析。结果表明,牦牛CAPS基因CDS区全长570 bp,编码189个氨基酸;编码蛋白的分子式为C₉₀₅H₁₄₃₄N₂₆₆O₂₉₇S₈,分子量为21 049.43 Da,理论等电点为4.69,脂溶指数为75.29,不稳定指数为37.52,是疏水性稳定蛋白;系统进化分析表明,牦牛CAPS基因CDS区与普通牛和瘤牛的基本一致,与水牛、绵羊和猪的序列一致性较高。本研究为深入研究牦牛CAPS的生理功能提供了参考资料。     

犏牛雄性不育的DNA甲基化

采用Western blot法检测犏牛、牦牛睾丸组织中DNA甲基转移酶3a(Dnmt3a)蛋白的相对表达量,用甲基化定量试剂盒(荧光法,Epigentek公司)检测其全基因组DNA甲基化的水平,分析犏牛与牦牛在这2个表达量上的差异。结果显示:犏牛、牦牛睾丸组织中Dnmt3a蛋白的相对表达量分别为(0.853±0.015)和(0.651±0.016),犏牛的显著高于牦牛(P<0.05);犏牛、牦牛睾丸组织的全基因组DNA甲基化水平分别为(0.950±0.013)%和(0.808±0.016)%,犏牛的显著高于牦牛(P<0.05)。可见,犏牛睾丸组织中Dnmt3a蛋白表达水平与其全基因组DNA甲基化水平均显著高于牦牛,这可能是犏牛雄性不育的DNA甲基化机制之一,也将为犏牛雄性不育的表观遗传学研究奠定基础。