橡胶树α-维管蛋白基因HbTUA1的克隆及表达分析

利用橡胶树胶乳EST文库克隆到一个TUA基因,命名为HbTUA1（GenBank登录号：KC333454）。该基因cDNA全长1 580 bp,其中5′UTR长45 bp,3′UTR长167 bp,编码区长1 368 bp,编码449个氨基酸。HbTUA1蛋白具有TUA类蛋白保守的GTP结合域。荧光定量PCR分析显示,HbTUA1基因在橡胶树胶乳中的表达量最高,其次是树皮和芽,而在种子和叶片中的表达量最低;在胶乳中,HbTUA1基因的表达显著受割胶和伤害诱导,在不同死皮程度的橡胶树中也存在明显差异。初步表明HbTUA1基因可能参与橡胶树胶乳再生与胁迫应答调控。     

巴西橡胶树HbUBC14基因克隆、生物信息学及表达分析

从巴西橡胶树中鉴定出一个泛素结合酶(UBC)基因,该基因长653 bp,最长开放阅读框504 bp,预测编码蛋白包含167个氨基酸;序列比对分析发现,该基因编码的蛋白具有一段保守的UBC结构域,与拟南芥E2成员UBC14(At3g55380)具有较高的相似性,故将该基因命名为HbUBC14。半定量RT-PCR分析结果表明,HbUBC14在巴西橡胶树胶乳中表达最高,在花药中表达最低。与健康橡胶树相比,死皮树胶乳中HbUBC14表达量明显下降。HbUBC14表达还受乙烯和茉莉酸调控。以上结果表明,HbUBC1     

橡胶树胚胎晚期丰富蛋白基因HbLEA1的克隆和表达分析

胚胎晚期丰富蛋白（LEA）是与植物抗逆反应相关的一类重要蛋白。本研究克隆了橡胶树LEA家族一个新基因的全长cDNA序列,命名为HbLEA1。该cDNA全长1 183 bp,其中5'UTR区60 bp,3'UTR区154 bp,CDS区969 bp,共编码322个氨基酸,分子量大小为36 ku,等电点4.84,含有LEA-2和WHy（Water Stress and Hypersensitive response）结构域,属于LEA_2类LEA蛋白。组织表达分析结果表明,HbLEA1在种子中表达量最高,其次是胶乳和稳定叶,在芽中的表达量最低。在未开割树的胶乳中,机械伤害和割胶处理均明显下调HbLEA1表达。在橡胶树幼苗中,低温胁迫处理后该基因在叶片、树皮和根中的表达呈上升趋势,而在高温和干旱胁迫中其表达变化并不明显。结果显示,HbLEA1基因可能参与橡胶树的胁迫应答和胶乳代谢调控。     

巴西橡胶树HbCPT7基因的克隆与表达分析

来自巴西橡胶树的天然橡胶主要成份是顺式聚异戊二烯高分子化合物,顺式异戊二烯转移酶是天然橡胶生物合成中的关键酶之一。利用RT-PCR技术从巴西橡胶树胶乳中克隆出一个新的顺式异戊二烯转移酶基因HbCPT7。生物信息学分析表明该基因编码296个氨基酸,含有顺式异戊烯基转移酶典型的5个高度保守结构域。qRT-PCR分析表明该基因分别受割胶和茉莉酸甲酯上调诱导表达,推测该基因在割胶后胶乳再生中发挥重要的作用,亦可能是茉莉酸信号调控的靶标。SDS-PAGE和western blotting分析表明重组HbCPT7-His蛋白在大肠杆菌中成功由IPTG诱导表达。这些结果为进一步研究HbCPT7基因功能打下良好基础。     

巴西橡胶树蔗糖磷酸合成酶基因的克隆和表达分析

分析橡胶树EST数据库,得到一个注释为SPS(蔗糖磷酸合成酶)的EST序列重叠群(contig).通过PCR扩增和测序技术获得该基因的全长cDNA和基因组序列,命名为HbSPS1.序列分析显示,HbSPS1基因长度为5 298 bp,包含13个外显子和12个内含子.对应的cDNA编码序列(CDS)为3 156 bp,推测编码1 050个氨基酸,分子量大小为118.1 ku,等电点为6.05.采用荧光定量PCR技术分析该基因的表达模式,结果表明,HbSPS1基因主要在胶乳中表达,在乙烯利和机械伤害处理的胶乳中呈下调表达,在割胶影响下略有上调表达趋势,同时该基因在叶片发育过程中呈上调表达.说明HbSPS1基因可能参与胶乳蔗糖代谢和叶片发育调控.     

橡胶树胶乳HbPLDα1基因及其启动子的克隆与生物信息学分析

植物磷脂酶PLDα1与伤害信号转导密切相关,是伤害诱导内源茉莉酸（Jasmonic acid, JA）生物合成的关键酶之一。橡胶树胶乳PLDα1基因（HbPLDα1）表达的研究将有助于揭示橡胶树乳管细胞JA信号转导及其调控橡胶生物合成的机制。在EST序列的基础上,通过RACE和Genome Walking方法分别克隆了橡胶树胶乳的HbPLDα1基因及其启动子序列。HbPLDα1基因的cDNA全长为2 870 bp,包含长度为2 427 bp的完整开放阅读框（ORF）,具有典型的植物PLDα蛋白保守功能域,与同属大戟科的蓖麻和麻风树的PLDα1基因亲缘关系最近。HbPLDα1基因启动子区域长为1 559 bp,除含有TATA box和CAAT box等基本顺式作用元件外,还存在JA和脱落酸等激素响应元件以及干旱胁迫等环境信号响应元件,这表明HbPLDα1基因的表达可能受激素和环境信号的调控,在橡胶树乳管细胞对激素和环境信号的响应过程中发挥重要作用。     

橡胶树5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的克隆及其响应非生物胁迫的表达分析

5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPs)是植物合成芳香族氨基酸的一个重要酶,与许多抗逆相关的次生代谢物的合成有关.本研究利用RACE技术从橡胶树热研7-33-97中获得了全长为2025 bp的HbEPSPS基因cDNA序列,开放阅读框为1572 bp,编码523个氨基酸;使用ProtParam tool预测该基因编码的蛋白质分子量为56.01u,等电点(pI)为7.91.该基因由8个外显子和7个内含子构成,全长4600 bp.实时荧光定量PCR结果表明,HbEPSPS基因在橡胶树叶片、皮、花、胶乳和胚中均表达,其中以叶片中的表达量为最高.激素、干旱、盐和低温等非生物胁迫都能诱导HbEPSPS基因表达量上调,其中茉莉酸甲酯、乙烯和PEG的上调作用最为显著.橡胶树HbEPSPS基因的克隆及其在非生物胁迫下的表达调控研究将为橡胶树抗逆相关的研究提供理论依据.     

巴西橡胶树中2个NADP-苹果酸酶基因的克隆和表达特性分析

从橡胶树中克隆2个NADP-ME(苹果酸酶)基因的全长cDNA,分别命名为HbNADP-ME1和HbNADP-ME2。HbNADP-ME1和HbNADP-ME2 cDNA全长分别为2 428、2 139 bp,分别编码643、593个氨基酸组成的蛋白,二者的氨基酸序列一致性高达87.25%,且分别与蓖麻和杨树的一个NADP-ME序列具有较高的序列一致性。2个HbNADP-ME蛋白都含有典型的植物NADP-ME蛋白的保守结构域,均富含亮氨酸(Leu),同属于非分泌型稳定蛋白。2个HbNADP-ME基因在橡胶树不同组织中的表达存在明显差异,在根中的表达量最高,种子和花中的表达量次之;另外,HbNADP-ME1基因在胶乳中受机械伤害有下调表达趋势,HbNADP-ME2基因在胶乳中受割胶处理也表现出下调表达趋势,而低温胁迫则显著诱导2个基因在叶片和根中的表达。结果说明,HbNADP-ME基因可能参与橡胶树的抗逆应答及代谢调控(包括胶乳代谢调控)。此结果为深入揭示橡胶树中NADP-ME基因的功能奠定了基础。     

橡胶树HbREF3基因的克隆及功能初步分析

橡胶延伸因子（REFs）是橡胶粒子上的一种主要膜蛋白,在橡胶生物合成途径中具有延伸橡胶烃和稳定橡胶粒子等重要作用。对橡胶树不同组织的转录组测序发现,HbREF3在胶乳中具有特异性的高表达,且其在HbREFs基因家族中表达水平也相对较高,仅次于表达丰度最高的HbREF1。HbREF3的开放阅读框为528 bp,编码175个氨基酸,对应的蛋白相对分子质量为19.62 kDa,理论等电点（pI）为5.28。系统进化树分析表明,HbREF3与橡胶树其他HbREFs虽均属于分组Ⅰ,但与HbREF1明显属于不同分支。HbREFs均含有REF保守结构域,但在保守motif的分布上,不同HbREFs蛋白含有保守motif数量不等,HbREF3比HbREF1多了一个motif。生信预测分析表明,该蛋白属于亲水性蛋白,无跨膜结构域,具有14个磷酸化位点。亚细胞定位分析发现HbREF3蛋白定位在内质网上,推测其可能参与橡胶粒子的形成和胶乳的再生。本研究结果为进一步阐明HbREF3基因在橡胶树胶乳再生中的作用机制奠定了基础。     

Cloning and Bioinformatical Analysis of Phospholipase Dα1 Gene and Its Promoter in the Latex of Rubber Tree (Hevea brasiliensis Muell.Arg.)

植物磷脂酶PLDα1与伤害信号转导密切相关,是伤害诱导内源茉莉酸(Jasmonic acid,JA)生物合成的关键酶之一.橡胶树胶乳PLDα1基因(HbPLDα1)表达的研究将有助于揭示橡胶树乳管细胞JA信号转导及其调控橡胶生物合成的机制.在EST序列的基础上,通过RACE和Genome Walking方法分别克隆了橡胶树胶乳的HbPLDα1基因及其启动子序列.HbPLDα1基因的cDNA全长为2 870 bp,包含长度为2427 bp的完整开放阅读框(ORF),具有典型的植物PLDα蛋白保守功能域,与同属大戟科的蓖麻和麻风树的PLDα1基因亲缘关系最近.HbPLDα1基因启动子区域长为1 559 bp,除含有TATA box和CAAT box等基本顺式作用元件外,还存在JA和脱落酸等激素响应元件以及干旱胁迫等环境信号响应元件,这表明HbPLDα1基因的表达可能受激素和环境信号的调控,在橡胶树乳管细胞对激素和环境信号的响应过程中发挥重要作用.     

高效液相色谱法分析巴西橡胶树胶乳再生过程中的ATP、ADP和AMP代谢变化

胶乳再生过程中腺苷水平（ATP、ADP和AMP含量）能够反映橡胶树乳管的生理代谢强度。运用高效液相色谱法,成功建立了一种简单、快速的橡胶树胶乳中ATP、ADP和AMP的定量方法,并采用该方法对胶乳再生中的腺苷水平进行分析。结果表明：胶乳再生过程中,早期（0~12 h）乳管主要利用排胶后剩余的AMP和ADP合成ATP,此后先后恢复AMP和ADP（6 h后）以及ATP（12 h后）的合成能力,并在排胶后12~48 h之间出现一个明显的ATP快速合成期。对排胶影响面的能荷分析表明,排胶造成割线下方2~7 cm区     

巴西橡胶树PPCK基因家族成员的鉴定和表达分析

以已发表的PPCK序列为探针,对橡胶树和其他5种植物(木薯、水稻、杨树、蓖麻和拟南芥)的转录组和基因组进行全面搜索,鉴定得到17个PPCK基因,其中包括3个橡胶树PPCK基因,命名为Hb PPCK1-3。序列分析发现,Hb PPCK1-3和其他植物一样在结构上非常保守,只有一个内含子和一个蛋白激酶结构域,并且相对位置也比较一致。在进化上,橡胶树、木薯和蓖麻3种大戟科植物的PPCK蛋白具有较近的亲缘关系。Hb PPCK3在树皮中表达丰度最高,其次是种子和雄花;Hb PPCK2在胶乳和根中表达丰度相对较高,而Hb PPCK1在各组织中的表达都比较低。另外,大部分家族成员的表达都受到真菌侵染、低温和干旱胁迫处理的诱导,而乙烯利处理却能抑制Hb PPCK2的表达。     

巴西橡胶树中碱性转化酶HbNINa基因的克隆和表达模式分析

检索橡胶树EST和基因组数据库,发现了1个在叶片中高丰度表达的中碱性转化酶基因.采用RT-PCR和RACE技术获得了该基因的cDNA和基因组序列,命名为Hb NINa.序列分析结果显示,HbNINa基因cDNA序列的编码区(CDS)序列长度为1 719 bp,对应的基因组序列为3 696 bp.序列分析表明,该基因编码571个氨基酸多肽,推测其分子量大小为65.7 ku,等电点为6.36.HbNINa蛋白包含植物中碱性转化酶的全部保守结构域.基因组结构分析显示Hb NINa基因包含4个外显子和3个内含子.QPCR分析结果表明,HbNINa基因在在胶乳中表达水平极低,而在其他组织如树皮、树叶和雌花中的表达丰度相对较高.在叶片发育过程中,Hb NINa在叶片发育的初期高丰度表达,推测HbNINa可能参与叶片蔗糖利用,进而在橡胶树叶片发育过程中起重要作用.     

巴西橡胶树胶乳DNA的提取及特性分析

利用改良的SDS-醋酸钾沉淀法可以有效分离纯化胶乳DNA。胶乳经过高速离心后分为3层,上层主要是橡胶粒子,中间层是胶乳的可溶性胞质成分即C-乳清,下层主要是黄色体。分别对这3层组份进行DNA提取分析,结果显示胶乳DNA主要存在于黄色体层。限制性内切酶分析表明所得胶乳DNA是序列不均一的DNA分子。胶乳DNA主要由线粒体DNA和少量细胞核DNA组成。健康树中胶乳DNA含量要大于死皮树胶乳DNA含量。     

橡胶树新种质产排胶特性的初步研究

我国橡胶树新种质创新利用进展缓慢,为了深入全面的鉴定橡胶树新种质,加速其利用进程,笔者采用胶乳诊断方法,测定分析了1986年定植于大田鉴定评价圃的14份橡胶树新种质与产排胶密切相关的干胶含量、干胶产量、排胶初速度、堵塞指数及胶乳硫醇、无机磷、蔗糖及镁离子含量等生理参数.结果表明,种质间存在较大差异,但不能从中直接筛选出可供直接利用的种质材料,参试材料中仅有7和12号2份种质株次干胶产量超过对照,产胶、排胶维持在较平衡的状态.因此,除采用常规的33月龄树皮解剖、试割等方法进行早期选择研究外,有必要探索新的早期预测方法.     

橡胶树胶乳WRKY家族转录因子HbWRKY27基因的克隆与表达分析

从巴西橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳中克隆了1个WRKY转录因子家族成员基因,命名为HbWRKY27,该基因含有1个1 266 bp的开放阅读框(ORF),编码422个氨基酸。生物信息学分析结果表明,HbWRKY27含有1个WRKY保守结构域和1个C2H2锌指结构基序,属于II类WRKY家族成员,与大豆、油棕、麻风树、葡萄和拟南芥的WRKY27蛋白的同源性分别为81%、74%、63%、62%和58%。酵母转化试验表明,HbWRKY27具有转录激活活性。实时荧光定量RT-PCR分析显示,HbWRKY27基因在健康橡胶树树皮组织中表达量最高,但在死皮橡胶树树皮组织中的表达量随着死皮程度的增加而下降,而在死皮橡胶树胶乳中HbWRKY27基因表达量则随着死皮程度的增加而升高;割胶、乙烯利和茉莉酸甲酯刺激都可显著促进胶乳HbWRKY27基因上调表达。转录因子HbWRKY27可能在割胶和乙烯等调控橡胶树胶乳代谢中发挥重要作用,并且还可能与橡胶树死皮病的发生相关。     

巴西橡胶树SnRK1家族基因的克隆与表达分析

蔗糖非酵解型蛋白激酶I(Sn RK1)是植物糖信号途径的关键因子,广泛参与植物生长发育。以蓖麻Sn RK1基因序列为探针,采用同源克隆的方法获得了橡胶树Sn RK1家族2个基因的全长c DNA,分别命名为Hb Sn RK1-1(KX237690.1)和Hb Sn RK1-2(KX237691.1)。2个Hb Sn RK1基因均编码含515个氨基酸且序列高度一致(96.5%)的蛋白质;2个基因均含10个外显子、9个内含子,且外显子大小相近,但基因长度差异明显。在6种橡胶树组织中,2个Hb Sn RK1基因均有表达,但Hb Sn RK1-1在胶乳(产胶细胞乳管的细胞质)中的表达量明显高于Hb Sn RK1-2;在叶片发育不同时期,Hb Sn RK1-1的表达变化不显著,而Hb Sn RK1-2的表达随叶片发育明显下降;在胶乳中,Hb Sn RK1-1的表达显著受乙烯和茉莉酸诱导、受2,4-D抑制,但Hb Sn RK1-2表达受激素处理的影响较小,推测Hb Sn RK1可能参与胶乳再生的激素调控。     

巴西橡胶树一个新的法尼基焦磷酸合酶基因的克隆及表达分析

利用同源克隆的方法在橡胶树中获得一个新的法尼基焦磷酸合酶基因,命名为Hb FPS2。序列分析显示,Hb FPS2基因组序列长4 171 bp,由12个外显子和11个内含子组成,c DNA全长1 288 bp,包含1 029 bp的开放阅读框、105 bp的5′-UTR和154 bp的3′-UTR,编码342个氨基酸,推测分子量为39.6 ku,等电点为5.27。氨基酸序列比对显示,Hb FPS2具有FPS家族保守的5个结构域。进化分析结果表明,Hb FPS2和Hb FPS1亲缘关系最近,与大戟科的蓖麻、大戟、麻风树法尼基焦磷酸合酶聚为一个亚类。定量PCR结果表明,Hb FPS2在橡胶树根、树皮、叶、花和胶乳等组织中均有表达,在花和胶乳中表达量较高,在根中表达量最低;茉莉酸和乙烯处理均能提高Hb FPS2基因的表达量,处理9 h时基因表达量分别提高了36倍和8倍。结果为分析法尼基焦磷酸合酶基因表达特性及其在天然橡胶生物合成途径中的作用机制奠定基础。     

ABC转运蛋白与巴西橡胶树产胶代谢

ABC转运蛋白(ATP Binding Cassette transporter)是目前已知最大、功能最广泛的蛋白家族之一。大多数ABC转运蛋白都能利用水解ATP释放的能量直接转运底物。许多研究结果显示,植物ABC转运蛋白在各种代谢产物的跨膜转运中起着重要作用。橡胶的产胶代谢是一种典型的植物类异戊二烯次生代谢,是影响橡胶产量的首要因素。相关实验结果显示,ABC转运蛋白可能参与橡胶树产胶代谢。本文介绍了模式植物拟南芥中的ABC转运蛋白研究进展,并对ABC转运蛋白与橡胶树产胶代谢的关系进行讨论。