多年生簇毛麦α-醇溶蛋白基因的分离与序列分析

以多年生簇毛麦（Dasypyrum breviaristatum）基因组DNA为模板,用小麦种子醇溶蛋白保守引物进行PCR扩增。扩增产物经克隆测序,获得999-1018bp的7个序列（GenBank登录号为EU186102-EU186108）,分别编码283-290个氨基酸。序列比对结果表明,它们具有α-醇溶蛋白基因的保守特征,是α-醇溶蛋白基因家系成员。该7个序列与乳糜泻（celiac disease）病人毒性抗原相关序列的比对结果表明,有5个序列在C末端具有Glia-α-2型抗原序列的特征。根据α-醇溶蛋白基因的编码氨基酸建立系统树,发现来自多年生簇毛麦的α-醇溶蛋白基因序列单独聚为一类,不能与普通小麦A、B或D染色体组的相关序列聚在一起。在序列分析的基础上设计了簇毛麦基因组α-醇溶蛋白基因的特异引物AS-V-gli-F和AS-V-gli-R,通过特异PCR扩增,AS-V-gli-F和AS-V-gli-R仅能对多年生簇毛麦、小麦-多年生簇毛麦部分双二倍体进行特异性扩增,而不能对小麦和其他小麦族物种进行扩增。因此,AS-V-gli-F和AS-V-gli-R可作为检测多年生簇毛麦α-醇溶蛋白基因向栽培小麦转移的分子标记。     

农作物Pht1家族磷转运体蛋白的生物信息学分析

以AtPT1所编码的氨基酸序列做为检索序列,通过对GenBank NR数据库以及EMBI、DDBJ、PDB数据库进行检索,发现小麦、大麦、玉米、水稻和番茄等植物中具全长cDNA的33个Pht1家族磷转运体基因,包括马铃薯1个,苜蓿5个,辣椒3个,茄子2个,烟草2个,番茄2个,菜豆1个,玉米4个,大麦2个,小麦1个,水稻7个,大豆2个和木薯1个。利用生物信息学分析,首次将Pht1家族磷转运体基因保守特征序列确定为GGDYPLSATIMSE。对检索到的33个Pht1家族磷转运体蛋白进化关系分析表明,与AtPT1亲缘关系较近的双子叶植物磷转运体蛋白是木薯MePT1和GmPT2,关系较近的单子叶植物磷转运体蛋白是OsPHT8和OsPHT12。     

籼稻低亲和阳离子转运蛋白基因OsLCT2的克隆与生物信息学分析

OsLCT1是目前在水稻中唯一鉴定出来的参与韧皮部镉离子运输的关键转运蛋白,与水稻籽粒镉积累密切相关。本研究根据Gene Bank已发表的小麦Ta LCT1基因序列信息设计引物,利用RT-PCR方法从籼稻93-11和华占中克隆了低亲和阳离子转运蛋白基因(LCT),并命名为OsLCT2。生物信息学分析结果表明,该基因定位在5号染色体上,全长2 699 bp,包含3个外显子和2个内含子,其CDS全长1 437 bp,编码478个氨基酸,包含2个PEST序列和11个跨膜结构域。OsLCT2蛋白二级结构预测显示,α-螺旋占57.11%、β-折叠占7.74%,无规则卷曲占35.15%。序列比对和系统进化树分析结果表明,OsLCT2与小麦的亲缘关系最近达65%,其次为高粱64%,而与水稻OsLCT1的同源性并不高,推测OsLCT2的功能可能与Ta LCT1相类似。     

小麦Cyp450基因的电子克隆与生物信息学分析

为获得对小麦Cyp450基因及其编码蛋白质的理化性质与结构特性等,利用电子克隆方法克隆了一个新的小麦Cyp450基因,并对其编码的蛋白质进行了生物信息学分析。结果表明,该基因全长2155 bp,编码511个氨基酸;该蛋白序列的N端存在一个显著信号肽序列,属于CypX超家族,该蛋白定位于细胞质中,属于分泌途径中的信号肽蛋白,含有多个不同的磷酸化位点;二级结构以α螺旋（占48.14%）和无规则卷曲为主（占33.86%）,存在5个不稳定区,在85-511位处形成一个较大的球形蛋白域。该蛋白与大麦、二穗短柄草、水稻和高粱的同源Cyp450蛋白相似性较高,进化距离较近。获得了一个新的小麦细胞色素P450基因,并分析了其编码蛋白质的序列特性,为进一步实验克隆和研究其功能提供了理论基础。     

水稻干尖线虫氨基肽酶基因克隆及功能初步分析

为防治水稻干尖线虫病提供理论支持,研究了水稻干尖线虫氨基肽酶基因特征,并对其编码蛋白结构与功能进行分析。基于水稻干尖线虫转录组测序,并通过RACE技术,从水稻干尖线虫中克隆得到了一氨基肽酶基因AbAmpep。生物信息学进行基因分析,原位杂交实验进行表达定位分析。该基因CDS序列全长为2 787 bp,含有2个开放阅读框(ORF)。最长开放阅读框(ORF)大小2 661 bp,可编码886个氨基酸,蛋白分子量为101.74 k Da,理论等电点(PI)为5.78。编码蛋白氨基酸序列中具有2个Zn2+结合位点和1个Pep N保守结构域,有特征信号序列TISHELAHFW,属于谷氨酸锌蛋白(Glu Zincin)超家族。Ab-Ampep氨基酸序列同挑选的其他9种动物的氨基肽酶氨基酸序列进行多重序列分析,发现功能区域的氨基酸序列较为保守,Ab-Ampep与猪蛔虫(Ascaris suum)的氨基肽酶P(ERG83308.1)蛋白相似度最高为50%。系统进化树分析表明,Ab-Ampep与猪蛔虫(A.suum)的氨基肽酶P(ERG83308.1)蛋白在同一分支上,亲缘关系最近。蛋白质结构分析显示,α-螺旋为Ab-Ampep主要结构元件,能够形成金属离子Zn2+结合位点。原位杂交实验显示,经反义链探针处理的线虫在其生殖部位有颜色加深的杂交信号,该基因的表达位置主要在水稻干尖线虫的生殖部位。通过对水稻干尖线虫氨基肽酶基因研究,利用分子技术改造氨基肽酶或寻找氨基肽酶抑制剂,抑制氨基肽酶的表达,影响线虫生长发育,为防治水稻干尖线虫病提供新思路。     

小麦TaCRF2基因的克隆及其在烟草中的初步功能验证

通过RT-PCR从小麦cDNA中扩增获得一个锌指蛋白基因TaCRF2, 该基因的cDNA长度为847 bp, 序列分析表明它编码一个含有280个氨基酸的蛋白质。在线软件预测该蛋白质的相对分子质量为30.97 kD, 等电点为7.03, 且在C-末端含有一个典型的RING-H2型锌指蛋白结构域, 在N-末端含有两个跨膜结构域。氨基酸序列比对发现, TaCRF2与水稻中的一个RING型锌指蛋白(ABF95226)的相似度为82%。亚细胞定位分析显示, 该蛋白分布在细胞核和细胞膜上。Real-time PCR表达特性分析显示, TaCRF2基因的表达受干旱、盐和ABA的强烈诱导, 低温对该基因的表达量影响不明显。初步功能验证发现过表达TaCRF2基因增强了转基因烟草对干旱和盐胁迫的耐性。     

小麦谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆及原核表达

为了进一步研究小麦谷胱甘肽-S-转移酶基因(TaGST)的功能,采用RT-PCR方法分离了小麦谷胱甘肽-S-转移酶基因(TaGST)的ORF全长c DNA,并进行了生物信息学分析。结果表明:小麦TaGST基因的ORF全长690 bp,编码229个氨基酸;TaGST蛋白分子质量为25.81 k Da,p I为5.29。系统进化分析表明,该基因编码蛋白与水稻OsGST蛋白的氨基酸同源性最高,与已知植物GST家族成员的氨基酸序列聚类分析将TaGST聚为Phi类GST。构建原核表达载体p ET32-TaGST,对TaGST基因进行原核表达,SDS-PAGE结果表明,其所表达蛋白与预期蛋白大小一致。为进一步研究该基因的特性和功能奠定了理论基础。     

小麦和水稻auxin基因家族的生物信息学比较分析

根据测序获得的1条260 bp cDNA片段,通过预测发现其包含小麦植物生长素(AUXIN)基因的部分编码序列,通过电子延伸、设计引物,从小麦Mardler/7*百农3217的cDNA中扩增获得一条608 bp的cDNA片段,该基因序列数据库(GenBank)登录号为AY902381(基因)和(蛋白).编码202个氨基酸,预计蛋白的分子量为23.0 kDa,等电点为9.93.利用已经分离的小麦生长素(AUXIN)基因的保守序列为检索序列,对小麦和水稻中的AUXIN基因家族成员进行分析,利用这些基因编码蛋白序列构建系统发生树,查找在GenBank的EST数据库中查找这些基因的ESTs表达序列,分析了这些基因在细胞中的定位情况和蛋白结构的相似性,根据已知相似基因的功能,分析该基因有进一步深入研究的必要.     

白羊草BiCDPK基因保守区的克隆及序列分析

为了研究CDPK基因的结构和功能,利用RT-PCR方法从白羊草中克隆得到BiCDPK基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明：该BiCDPK基因cDNA长1048 bp,包含387 bp的开放阅读框,编码128个氨基酸。蛋白表现为弱酸性,且稳定、亲水,二级结构中以无规则卷曲和α-螺旋为主。亚细胞定位于细胞质中,无跨膜结构域,无信号肽。蛋白序列中存在1个丝氨酸磷酸化位点和3个苏氨酸磷酸化位点。进化分析结果表明,克隆的BiCDPK基因与玉米、小麦和水稻具有较高同源性,相似度分别是97%、86%、86%。为进一步研究BiCDPK基因的功能奠定了基础。     

青天葵NfD53基因的克隆及生物信息学分析

本研究克隆青天葵NfD53基因并分析其序列特征,可为今后深入研究NfD53蛋白功能及独脚金内酯(SLs)对植物侧枝生长发育的影响提供参考依据.以濒危药用植物青天葵叶片为实验材料,利用RT-PCR及RACE技术克隆获得2条NfD53基因,分别命名为NfD53-1和NfD53-2,应用生物信息学软件分析其序列并进行功能预测.结果 显示:NfD53-1基因全长3523 bp,编码974个氨基酸;NfD53-2全长3916 bp,编码1190个氨基酸.两者等电点分别为:8.34、6.33;亲水性平均数为:-0.250、-0.263;均为不稳定的亲水性蛋白,无信号肽及切割位点,定位于叶绿体.两蛋白都具有ClpA超家族核心序列,而NfD53-1蛋白还具有ClpC超家族核心序列,并含有3个非特异性位点(ClpA,ClpC和AAA_2),NfD53-2蛋白含有1个ClpA非特异性位点.蛋白的二级结构中均以无规则卷曲占比最高,分别占47.16％和51.21％;其次是α-螺旋,占38.70％和31.69％.系统进化分析表明,NfD53-1与番茄等聚为一支,但氨基酸相似度较低(20.27％),NfD53-2与铁皮石斛聚为一支,同源性较高(66.49％).本研究为后续进一步探讨该基因的功能及SLs在植物生长发育中的作用提供数据参考.     

玉米热激蛋白基因ZmHSP90-1的克隆及表达分析

HSP90是普遍存在于原核和真核细胞中的一种高度保守的分子伴侣。本研究从玉米中克隆了一个HSP90同源基因, 命名为ZmHSP90-1基因, 并对其进行了初步的序列分析。该基因cDNA序列全长2 371 bp, 开放阅读框2 094 bp, 编码697个氨基酸, 蛋白质分子量约79.98 kD。蛋白结构预测及同源比对分析表明, ZmHSP90-1基因编码蛋白含ATPase位点和HSP90保守结构域, 并与拟南芥、水稻等多种物种的热激蛋白高度同源; 进化树分析表明ZmHSP90-1与拟南芥AtHSP90.1基因关系较近, 蛋白序列相似性达88.3%。目的蛋白亚细胞定位显示, ZmHSP90-1蛋白在细胞质中表达。实时荧光定量PCR分析表明, ZmHSP90-1对非生物胁迫高温、高盐、ABA、低温、干旱均具有明显的应答反应。推测ZmHSP90-1是玉米的一个胁迫相关基因。     

小麦TaWRKY71a基因克隆、生物信息学及表达分析

WRKY蛋白是主要存在于植物体内一类转录因子家族,在植物的生长发育和逆境应答中发挥重要作用。为了揭示小麦WRKY基因功能,从普通小麦中克隆出Ta WRKY71a基因后进行氨基酸序列分析,并对Ta WRKY71a基因在不同组织及不同胁迫条件下的表达模式进行分析。结果表明,Ta WRKY71a基因编码一个含有355个氨基酸的蛋白质。氨基酸序列分析显示,Ta WRKY71a蛋白含有1个WRKY结构域及1个C2H2锌指结构。预测分析表明,Ta WRKY71a蛋白定位在细胞核;其二级结构包含28.17%的α-螺旋、16.34%的延伸链、4.79%的β-转角和50.70%的无规则卷曲。不同物种间WRKY蛋白的同源性分析比较表明,Ta WRKY71a与粗山羊草WRKY71、水稻WRKY71、高粱WRKY71和拟南芥WRKY40的氨基酸序列之间具有高度的保守性。q RT-PCR分析表明,Ta WRKY71a在叶、根、茎、花和种子中均有不同程度表达,并受ABA、Na Cl和PEG诱导表达,推测该基因可能参与小麦逆境胁迫应答。研究结果为进一步研究Ta WRKY71a的生物学功能奠定了基础。     

毛偃麦草Na~+/H~+逆向转运蛋白的分子克隆及生物信息学分析

根据小麦和长穗偃麦草的液泡膜Na+/H+逆转运蛋白基因(TaNHX1、TeNHX1)全长序列设计引物,通过RT.PCR直接扩增的方法从毛偃麦草(Elytrigia trichophora L.)中克隆到了Na+/H+逆转运蛋白基因,命名为EtNHX1 (Accession numeber:EU876834).EtNHX1最大开放阅读框为1 641 bp,编码含有546个氨基酸残基、分子量为59.8 kD的蛋白,预测等电点8.0.EtNHX1含有39个碱性氨基酸,37个酸性氨基酸,256个疏水氨基酸及128个极性氨基酸.二级结构预测表明该蛋白含约47%的α-螺旋、20%的延伸链、4.5%的β-转角和28%的不规则卷曲.亲疏水性分析显示,EtNHXl含有12个连续的疏水片断,其中10个可能构成跨膜螺旋.序列分析显示,EtNHX1与小麦(Triticum aestivum L.)、中间偃麦草(Thinopyrum intermedium L.)、长穗偃麦草(Elytrigia elongate L.)、水稻(Oryza sativa L.)、角果碱蓬(Suaeaa corniculata L.)、小盐芥(Thellungiella halophila L.)等植物的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白高度同源,序列相似性分别为98%、98%、96%、85%、68%和67%.序比对结果以及进化树分析均表明EtNHX1应为定位于毛偃麦草液胞膜上的Na+/H+逆向转运蛋白.     

条锈菌诱导的小麦bZIP转录因子基因的克隆及表达分析

采用电子克隆和RT-PCR方法,从条锈菌诱导的小麦品种水源11的cDNA中分离到一个编码bZIP转录因子基因的cDNA序列,暂被命名为TabZIP。TabZIP包含一个完整的1 071 bp的开放阅读框,编码356个氨基酸,具有典型的bZIP保守结构域;与水稻、玉米、拟南芥等植物bZIP蛋白的氨基酸序列相似性较高;TabZIP基因在小麦根中的表达量丰富,而在茎和叶中表达量很小;在小麦与条锈菌非亲和组合中,TabZIP基因高水平表达,而在亲和组合中没有明显的变化;防卫相关激素乙烯、茉莉酸也可诱导该基因的快速上调表达,表明TabZIP可能通过乙烯、茉莉酸信号途径介导小麦对条锈病的防御反应。     

谷子3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆与结构分析

3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)在谷子盐旱胁迫早期高频率表达,为研究该基因在胁迫反应及其他代谢中的详细功能,本研究利用RACE技术克隆了谷子的GAPDH基因.该基因cDNA全长1328 bp,包括1008bp的开放阅读框,共编码338个氨基酸,肽段的分子量为35911.03Da,极性氨基酸占29.12%.序列比较分析发现,谷子的GAPDH同玉米的同源序列表现了最高的相似性,同水稻和小麦同源序列的相似性次之,同双子叶植物的同源序列则相差较远.     

玉米光周期敏感类Hd6基因的克隆和实时定量表达分析

水稻Hd6基因在调节水稻光周期敏感中起重要作用。本研究以热带玉米自交系CML288为材料, 利用同源基因克隆法结合3¢RACE技术克隆了与水稻Hd6基因同源的玉米类Hd6基因。该基因序列中999 bp的开放阅读框可编码332个氨基酸。BLAST分析发现, 该基因与玉米中编码蛋白激酶CK2的一个基因高度同源, 所推测的氨基酸序列包含2个CK2活性区域, 1个N末端区域, 1个ATP结合位点和1个丝氨酸/ 苏氨酸蛋白质激酶活性位点,与玉米、小麦、水稻和拟南芥的CK2氨基酸序列也有较高的同源性。建立了SYBR GREEN法实时荧光定量RT-PCR表达分析系统, 研究了不同光周期处理下类Hd6基因在光周期敏感自交系CML288茎尖和叶片中的表达。结果发现, 该基因在茎尖和叶片中均有表达。在短日条件下, 该基因在6~8叶期茎尖中的表达量存在明显差异, 在光周期敏感的7叶期出现表达高峰, 在叶片中的表达量均低于茎尖。在长日条件下, 该基因在茎尖中6叶期表达量较低, 在光周期敏感的9叶期在叶片中高量表达。由此可推测, 该基因与玉米光周期敏感密切相关, 可能在光周期敏感调节过程中发挥一定的作用。     

水稻谷蛋白的一个新基因克隆及表达分析

与其他禾本科作物以醇溶蛋白为主不同，水稻种子含有醇溶蛋白和谷蛋白两种主要蛋白质贮藏形式。其中，谷蛋白约占胚乳蛋白总量的70%~80%。水稻谷蛋白是由多基因家族编码合成的，到目前为止至少已克隆获得了9个全长cDNA，根据这些cDNA编码的氨基酸序列同源性可将谷蛋白分为A、B两个亚家族。B亚族谷蛋白成员富含赖氨酸等人体必需氨基酸，与稻米的营养品质直接相关，因此挖掘、利用B亚族基因成员对于改良稻米蛋白品质性状至关重要。本文报道了以32P标记的谷蛋白基因GluB-2 cDNA片段为探针筛选水稻胚乳cDNA文库获得1个新的水稻谷蛋白基因全长cDNA。序列分析显示该基因核苷酸序列共1588 bp，含有1个由495个氨基酸残基组成的开放阅读框，编码蛋白分子量约为56 kD。推导的氨基酸序列与其他已知谷蛋白基因家族成员间序列相似性介于57.8%~97.8%之间，并与B亚族谷蛋白基因的同源性更高，因此命名为GluB-7（GenBank注册号AY987390）。Northern杂交显示，GluB-7具有高度的胚乳表达特性。     

家蚕糖转运蛋曰BmST1基因的克隆与序列分析

糖转运蛋白运输葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖等透过细胞膜为机体提供能量.根据GenBank已登陆的其他物种的糖转运蛋白序列与家蚕基因组框架图和EST序列获得家蚕同源糖转运蛋白基因BmST1.基因编码区长1 392 bp(GenBank登录号:FJ373021),编码463个氨基酸,预测蛋白分子质量为51.635 kDa.序列分析显示基因有2个外显子,含有11个跨膜结构域.RT-PCR表明该基因仅在此文所检测的家蚕丝腺中表达.     

玉米寡肽转运蛋白基因(ZmOPT0212)的克隆及其生物信息学分析

根据玉米B73和水稻的寡肽转运蛋白全长序列设计引物,通过RT-PCR直接扩增的方法从玉米自交系478中克隆到了寡肽转运蛋白基因,命名为ZmOPT0212(Accession number:HM021150).ZmOPT0212开放阅读框为2 151 bp,编码716个氨基酸残基,等电点8.87,相对分子质量为77.4 ...     

华山新麦草籽粒硬度吲哚蛋白基因的分离与序列分析

采用AS-PCR技术,从华山新麦草基因组DNA中分离获得了其籽粒硬度吲哚蛋白Pina(HM 448475)和Pin b(HM448476)的基因序列.DNA序列分析显示,这2条序列相似性仅为69.25％,它们与小麦、山羊草、黑麦、燕麦和大麦亲缘种属植物等的Pin a和Pin b基因序列具有93％以上的一致性;推导的氨基酸序列分析显示,序列HM 448475(Pin a)和HM 448476(Pin b)都具有籽粒硬度吲哚蛋白基因的19个氨基酸残基组成的信号肽,与脂类易于结合的色氨酸结构域WRWWKWWK( Pin a)或WPTKWWK( Pin b),以及位置固定的10个半胱氨酸残基等典型结构特征,同时,这2条序列与小麦、山羊草等亲缘植物的Pin a和Pin b基因氨基酸相比,分别有15个和8个主要位点的差异;系统进化树分析显示,序列( HM 448475)可能为Pin a基因家族中的一个新类型,而序列(HM 448476)与智利大麦的Hordoindoline b基因具有相对较近的亲缘关系.研究表明,华山新麦草含有与麦类作物差异较大的控制籽粒硬度的等位基因.该研究对保护利用华山新麦草、丰富小麦籽粒硬度基因资源具有一定的理论意义和应用价值.