草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建

以据草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP6蛋白的全基因序列(GeneBank AF403394)为模板,采用RT-PCR构建了草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建。结果显示:实验构建的pCR 2.1-VP6重组质粒含有NcoⅠ和BglⅡ酶切位点;pCR 2.1-VP6重组质粒经PCR扩增和测序显示含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因读码框片段。将目的片段VP6酶切、克隆到携带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物表达载体pCAMBIA1302中,再经酶切、PCR扩增和序列测定显示,pCAMBIA1302-VP6含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因片段,说明已插入植物表达载体pCAMBIA1302绿色荧光蛋白基因前,成功构建了融合表达草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白和绿色荧光蛋白的植物表达载体pCAMBIA1302-VP6。     

全预混冻干PCR试剂检测草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型的研究

草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型是导致草鱼出血病的主要病原体之一,目前在我国广泛流行。本研究根据GenBank中草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型基因序列,设计了草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型特异性探针和PCR引物,通过优化反应条件,建立了草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型一步法TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。试验对反转录和PCR反应体系进行摸索,通过优化的冻干工艺制备出草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型全预混RT-PCR试剂,在荧光定量PCR中,冻干试剂的检测灵敏度可达10个模板,是普通PCR的100倍。批次间变异系数小于4%。特异性试验结果表明,该方法可特异性地检出草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型,而对鲤春病毒血症病毒、传染性造血器官坏死症病毒无检测信号。该冻干试剂4℃保存12个月,室温25℃保存3个月,37℃保存15d,敏感性仍为10个,与第1d相同;利用手持单通道荧光PCR仪,可在42min内完成核酸诊断。本试验基于荧光定量PCR检测方法,结合核酸扩增体系冻干工艺制备的全预混草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型RT-PCR试剂具有耐保存便于运输、准确性高、仪器拓展性好的特点,对草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型快速诊断有重要意义。     

草鱼呼肠孤病毒HZ08株FQ-PCR检测方法的建立及应用

草鱼出血病是危害中国淡水养殖最为重要的病害之一,其病原为草鱼呼肠孤病毒(grass carp hemorrhagevirus,GCRV),其中,HZ08株是当前引起草鱼出血病的主要流行毒株。为建立一种快速、灵敏、特异的草鱼呼肠孤病毒主要流行株检测方法,本研究利用草鱼呼肠孤病毒HZ08株S7基因保守区,设计了一对能特异性扩增154 bp片段的引物和TaqMan探针,用含有S7基因全长的重组质粒PAVX1-S7作为标准品,构建质粒拷贝数与CT值的标准曲线,并对该方法的特异性、可重复性、敏感度进行评价。结果显示:标准曲线在6.0×1010～6.0拷贝数之间有很好的线性关系(r=0.999);实时荧光定量PCR最少可检测到6个阳性质粒,有较高的敏感性;试验内及试验间变异系数分别为0.82%与0.41%～0.52%,重复性强;对水生动物其他病毒均无扩增反应,具有很好的特异性。应用该方法对采集的32份草鱼出血病样品进行检测,其中28份为阳性,而以常规RT-PCR检测同样的样品,仅23份为阳性。本研究建立的草鱼呼肠孤病毒流行株实时荧光定量PCR检测方法在特异性、灵敏度、重复性方面具有较好的测试结果,在GCRV的快速检测和病毒初步定量中应用前景乐观。     

草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法的建立

根据草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)衣壳蛋白VP6编码基因的序列设计特异性引物,以病毒全基因组RNA为模板,通过对反应条件进行优化,建立了GCRV的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。检测结果表明,本方法可在63℃下1 h内实现靶片段的大量扩增,扩增产物经凝胶电泳呈现梯型条带,反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色阳性结果明显区别于橙色阴性结果。该检测体系针对草鱼呼肠孤病毒的检测灵敏度高,其最低检测限为33 pg,与常规RT-PCR方法相比较,灵敏度高10倍,且与斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(CCRV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、大鲵虹彩病毒(GSIV)等无交叉反应。该方法灵敏度及特异性高,且不需昂贵仪器设备,为快速检测草鱼呼肠孤病毒与诊断草鱼出血病提供了简捷快速的技术手段。     

基于toxR基因的轮虫弧菌荧光定量微流控快速检测技术的建立

以轮虫弧菌的单拷贝基因toxR基因的高保守区域为目的片段,设计特异性引物,构建重组质粒标准品,建立针对该菌的荧光定量PCR检测方法。以此为基础,实验选用UF-150 Genechecker微流控荧光定量PCR仪,通过优化反应体系和反应条件,建立了轮虫弧菌的微流控荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法能特异性扩增toxR基因目的片段,对轮虫弧菌纯培养物检测下限为1.34×10⁰ 拷贝/μL。在人工感染样品中的应用结果显示,对鱼体组织中轮虫弧菌的检测下限为1.34×10³ CFU/g,检测结果可以目视判读,检测时间缩短至42 min以内。研究表明,该检测方法具有特异性强、敏感度高、场地要求低等突出优势,适于开发水产病原实用性的现场快速检测技术。     

溶藻弧菌外膜蛋白OmpK基因表达和间接ELISA检测方法的初步建立

溶藻弧菌是中国南部水产养殖业中弧菌病的最主要病原菌,数量居海洋类弧菌之首,其快速检测具有重要意义。以溶藻弧菌国内标准株ATCC17749基因组DNA为模板,PCR扩增出外膜蛋白OmpK基因,将其克隆入表达载体pET-28a中,获得重组质粒pET-28a-OmpK,限制性内切酶结合琼脂糖凝胶电泳分析和序列测定结果表明,该序列开放读码框正确且与已发表的OmpK结构编码序列完全一致。将重组质粒pET-28a-OmpK转化大肠杆菌BL21 pLys E,高效表达重组蛋白,将其纯化后免疫小鼠所得的高免血清能外膜蛋白OmpK特异性结合,表明体外表达的重组蛋白OmpK具有良好的免疫原性和反应原性。利用该抗溶藻弧菌外膜蛋白OmpK的抗血清建立了间接ELISA检测方法,检测灵敏度为10⁴ CFU/mL,能特异性检测出溶藻弧菌,与其他菌株无交叉反应。     

草鱼体外培养细胞中β-萘黄酮对CYP1A基因表达的诱导

为了建立以CYP1A cDNA为探针的水环境毒理学细胞模型,以β-萘黄酮(BNF)作为诱导剂,通过半定量PCR技术研究CYP1A在草鱼不同细胞系及其对应组织中的诱导表达情况。在半定量PCR反应参数研究中,对关键的退火温度和循环次数进行了优化,结果显示退火温度为57 ℃,循环次数为30次较为合适,该条件下Gauss迹量的CYP1A/ACT比值能更准确的反映CYP1A的表达水平。对照组和诱导组草鱼细胞中ACT和CYP1A cDNA扩增结果表明,细胞中CYP1A的基础表达量较低,而BNF诱导使GCL、CIK和CO细胞中CYP1A的表达水平得到显著的提高。GCL、CIK和CO细胞三者之间诱导后CYP1A的表达水平有显著差异(P<0.05),诱导表达量大小顺序为GCL>CIK>CO。草鱼细胞系的相应组织中ACT和CYP1A cDNA扩增以及电泳的结果与细胞中较为相似,组织中CYP1A诱导表达量大小顺序也与相应的细胞相同:肝>肾>卵巢。比较分析的结果表明,CYP1A在体内与体外的诱导表达水平具有一定的相关性。     

草鱼呼肠孤病毒VP7基因核酸疫苗的构建及免疫效果

将草鱼呼肠孤病毒( GCRV)外衣壳蛋白VP7双基因(约0.9 kb)及团头鲂的β-肌动蛋白启动子(约0.56 kp)经扩增并鉴定正确后,克隆至基因转移载体pFastBacTM Dual中,获得重组质粒pFastBac-β-VP71 -VP72,以此研究草鱼免疫实验及免疫效果.重组质粒按10、30、60μg分为3组,同时设30 μg空载体组及对照组.于免疫后第14、21、28、49天通过RT-PCR检测VP7的转录水平、间接凝集反应测定抗体水平及攻毒试验检测免疫保护效果.结果显示,pFastBac-β-VP71 -VP72导入鱼体后,VP7基因在β-肌动蛋白启动子的驱动下持续表达,至第49天仍能检测到目的基因的转录;各免疫组均有抗体产生,抗体效价在免疫后第21天达到最高,攻毒后10、30、60 μg核酸疫苗免疫组死亡率分别为0％、0％、5％,而空载体组和对照组分别为30％和100％,表明pFastBac-β-VP71-VP72作为核酸疫苗对草鱼病毒性出血病有较好的免疫保护效果.研究结果为草鱼呼肠孤病毒核酸疫苗的研发与生产应用奠定了基础.     

基因Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒TaqMan Real-Time PCR检测方法的建立及应用

为了建立和应用可检测基因Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的荧光定量检测方法,实验根据基因Ⅰ型GCRV的S6保守序列,分别设计扩增目的条带661 bp普通引物(P1、P2)、扩增目的条带159 bp荧光定量引物(F1、F2)和一条探针;同时构建含有目的片段的PVAX1-S6作为标准质粒,10倍梯度稀释构建质粒拷贝数与Ct值的标准曲线(Y=-3.389X+38.076)。结果表明,此方法在3.9×107~3.9×101拷贝/μL之间相关性较好,R2为0.992,最小检测量为4拷贝/μL;且与基因Ⅱ型、Ⅲ型GCRV以及其他病原核酸无交叉反应。运用该方法检测16份草鱼出血病疑似样品,阳性结果为4份;而普通PCR检测仅2份显示阳性。本研究建立了针对基因Ⅰ型GCRV的荧光定量检测方法,具有高效、特异、灵敏、可重复性强的优点,适合于目前基因Ⅰ型GCRV的临床快速检测和病毒定量分析。     

草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗体制备及其特异性分析

为了制备高效的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗体并对其特异性进行鉴定,实验以草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型HZ08株为模板,采用PCR方法扩增S9基因,将该S9基因与p ET-32a(+)载体连接构建p ET-32a-S9原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)后用IPTG诱导表达;纯化后的重组VP6蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,使用间接ELISA方法测定抗体效价,Western blot和IFA试验鉴定抗VP6蛋白多克隆抗体特异性。结果显示草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型的S9基因在原核表达载体中能够正确地表达VP6蛋白,纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备的抗VP6多克隆抗体,经间接ELISA方法测定其效价约为1∶105,Western blot和IFA试验结果显示制备的多克隆抗体能特异性识别GCRVⅡ型毒株,而不能识别GCRV I型、Ⅲ型以及其它病毒,表明该多克隆抗体具有较高的特异性。研究表明制备的抗VP6蛋白多克隆抗体能够特异性识别GCRVⅡ型病毒,为GCRVⅡ型病原学研究及草鱼出血病临床诊断奠定基础。