口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型定型诊断胶体金免疫层析方法的建立

【目的】建立一种从田间样品中快速、灵敏、简便检测O、A、Asia I型口蹄疫病毒抗原的胶体金免疫层析方法（GICA）。【方法】采用柠檬酸三钠还原制备胶体金颗粒,标记纯化的标准株O、A、Asia I型口蹄疫抗体。将纯化的口蹄疫流行株O/China99,A/AF72 and AsiaⅠ/China05抗体和羊抗豚鼠抗体分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带。经试验条件优化,组装形成胶体金定型诊断试剂盒。【结果】本试验研制的口蹄疫定型试剂盒具有良好的灵敏度,可检测到7.8×104 LD50（1﹕128倍稀释乳鼠毒）的病毒量。同时对阳性及阴性样品进行3次重复检测结果完全相同,说明其有较好的重复性;特异性试验证实该方法在检测口蹄疫临床症状相似病原,如猪水疱病抗原（SVD）、水泡性口炎（VS）、水泡性疹（VES）等病毒时无交叉反应;试剂盒对206份已知血清型田间及实验室样品的符合率试验,O、A、AsiaⅠ型和阴性样本的符合率分别为92.45 %、91.66%、92.75%、100%定型准确率94.58%。试剂盒在4℃下可保存6个月。【结论】本试验研发的口蹄疫病毒胶体金定型诊断试剂盒是一种快速、灵敏、特异的FMD抗原检测方法,对基层现场具有广泛应用价值。     

口蹄疫O型、A型和AsiaⅠ型病毒RT-PCR分型方法的建立

该研究旨在建立一种快速、灵敏及准确的口蹄疫病毒(FMDV)鉴定与分型的RT-PCR检测技术平台,为临床中有效准确地检测口蹄疫病毒提供有力的支持。根据NCBI中公布的FMDV序列(GenBank:JF749861.1),设计FMDV通用检测引物FP1/FP2;根据NCBI中公布的FMDV O型、A型和Asia Ⅰ型序列,经过序列分析比对后,分别设计FMDV分型引物FO1/FO2、FA1/FA2和FAS1/FAS2。提取FMDVRNA后,利用随机引物扩增得到FMDV全cDNA,利用设计的引物进行PCR扩增及PCR反应条件的优化。结果表明:该研究建立的RT-PCR检测方法具有很好的特异性、敏感性和可重复性。成功建立了FMDV O型、A型和Asia Ⅰ型检测及分型方法,为口蹄疫疾病的临床检测、流行病学相关调查及针对性的疫苗的制备奠定基础     

口蹄疫病毒O、A、Asia I型定型诊断胶体金免疫层析方法的建立

[目的]建立一种从田问样品中快速、灵敏、简便检测O、A、Asia I型口蹄疫病毒抗原的胶体金免疫层析方法(GICA).[方法]采用柠檬酸三钠还原制备胶体金颗粒,标记纯化的标准株O、A、Asia I型口蹄疫抗体.将纯化的口蹄疫流行株O/China99,A/AF72 and Asia I/China05抗体和羊抗豚鼠抗体分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带.经试验条件优化,组装形成胶体金定型诊断试剂盒.[结果]本试验研制的口蹄疫定型试剂盒具有良好的灵敏度,可检测到7.8×104 LD50(1:128倍稀释乳鼠毒)的病毒量.同时对阳性及阴性样品进行3次重复检测结果完全相同,说明其有较好的重复性;特异性试验证实该方法在检测口蹄疫临床症状相似病原,如猪水疱病抗原(SVD)、水泡性12炎(VS)、水泡性疹(VES)等病毒时无交叉反应;试剂盒对206份已知血清型田间及实验室样品的符合率试验,O、A、Asia I型和阴性样本的符合率分别为92.45%、91.66%、92.75%、100%定型准确率94.58%.试剂盒在4℃下可保存6个月.[结论]本试验研发的12蹄疫病毒胶体金定型诊断试剂盒是一种快速、灵敏、特异的FMD抗原检测方法,对基层现场具有广泛应用价值.     

O型口蹄疫病毒间接免疫荧光检测方法的建立

为建立猪O型口蹄疫病毒(FMDV)间接免疫荧光(IFA)检测方法,以猪抗O型口蹄疫病毒阳性血清为一抗、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的SPA蛋白(葡萄球菌蛋白A)为二抗,通过反应条件的优化,建立检测方法。结果表明,IFA最佳工作条件为,一抗最适稀释度为1∶50,FITC标记的二抗的最适稀释度为1∶800,最适孵育时间均为1h。特异性试验表明,用建立的IFA检测方法只能检测O型FMDV,而A型、AsiaⅠFMDV型和猪水疱病病毒(SVDV)检测结果均为阴性。建立的检测O型FMDV抗原的IFA检测方法具有特异、敏感、简便、快速等优点,可用于FMDV感染的实验室诊断及其在感染机体中的定位和动态分布研究。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒SG株的分离鉴定及全基因组序列测定与分析

自山东寿光地区疑似鸭病毒性肝炎的病鸭肝组织中分离到一株鸭肝炎病毒,命名为SG株DHV-Ⅰ.该病毒能被DHV-Ⅰ标准抗血清中和,该病毒第5代病毒尿囊液对12日龄鸭胚的ELD50为10-5.58/0.2 mL,对7日龄雏鸭的LD50为10-4.68/0.2 mL.全基因组序列比较分析发现,SG株DHV-Ⅰ基因组结构为5' UTR-VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3' UTR,与A型DHV-Ⅰ毒株的核苷酸同源性为94.9%～99.7%,氨基酸同源性为94.5%～99.7%,表明SG株DHV为一株A型DHV-Ⅰ强毒.     

口蹄疫病毒实时TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

基于口蹄疫病毒聚合酶3D蛋白基因的序列分析,设计合成了特异的引物和探针,通过反应条件的优化,建立了实时TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法.试验表明,实时TaqMan荧光定量RT-PCR能特异性检测A、O、Asia Ⅰ 3种血清型的口蹄疫病毒,对猪水泡病、猪瘟、蓝耳病等猪常见病原检测结果均为阴性.对比检测试验表明,实时TaqMan荧光定量RT-PCR的检测敏感性比常规的多重RT-PCR提高达105倍,对口蹄疫病毒细胞增殖病毒液的检测灵敏度可达0.063个TCID50·对临床样品的检测试验证实,该方法可以有效检测临床样品中的猪水泡皮、组织、血清及O-P液中的口蹄疫病毒.     

猪口蹄疫免疫抗体检测及防治措施

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)属于小RNA病毒科,口蹄疫病毒属,该病毒目前有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3(即南非1、2、3型)和Asia1(亚洲1型)7个血清型。各型之间几乎没有免疫保护力,感染了一型口蹄疫的动物仍可感染另一型口蹄疫病毒而发病。我国流行的口蹄疫主要为O、A、C三型及ZB型(云南保山型)。该病是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的以患病动物的口、蹄部出现水疱性病症为特征的传染性疫     

鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒三重RT PCR检测方法的建立

为建立可同时鉴别检测鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的三重RT-PCR方法,根据基因库中鸭Ⅰ型肝炎病毒、番鸭细小病毒和鸭圆环病毒的基因序列,分别设计3对特异性引物,通过三重RT-PCR扩增条件优化、敏感性和特异性试验,建立了鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒三重RT-PCR方法。使用该方法对同一样品中的鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒模板进行扩增,结果均得到与试验设计相符的202bp(鸭Ⅰ型肝炎病毒),351bp(鸭圆环病毒)和474bp(番鸭细小病毒)的特异性扩增条带,对小鸭温病毒、鸭副粘病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等病原体的检测全为阴性。敏感性试验结果表明,该方法最低能检测到1pg的鸭Ⅰ型肝炎病毒RNA、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒DNA。建立的鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒及番鸭细小病毒的三重RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异、定量和重复性好等优点,可用于临床鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒及番鸭细小病毒感染的检测。     

利用Asia1型口蹄疫病毒VP1蛋白的单克隆抗体建立单抗竞争ELISA方法

应用纯化的Asia1型口蹄疫病毒VP1蛋白作为抗原,采用过碘酸钠法标记纯化的单抗,建立了单抗竞争ELISA,检测10份阳性猪口蹄疫血清及200多份阴性血清,试验结果与样品的背景相一致。敏感性试验和重复试验结果表明,该方法具有稳定和敏感等特性,适合Asia1型猪口蹄疫病毒抗体的监测。     

AsiaⅠ型口蹄疫病毒江苏分离株VP1基因的克隆与高效表达

【目的】实现牛口蹄疫病毒AsiaⅠ型江苏分离株VP1基因在大肠杆菌中的表达,为VP1蛋白的深入研究奠定基础。【方法】根据GenBank公布的AsiaⅠ型口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)核苷酸序列(登录号:AF030244),设计并合成1对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出牛AsiaⅠ型FMDV江苏分离株VP1基因,将其连接入pMD18-T载体,测序后克隆入原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核表达载体pET-VP1。阳性重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,收集表达产物并进行SDS-PAGE电泳,利用West-ern-blot分析表达蛋白的抗原性。【结果】牛AisaⅠ型FMDVVP1基因在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物的相对分子质量约为43 ku,并能被牛AsiaⅠ型FMDV阳性血清识别,有一定的生物学活性,表达量约占菌体蛋白总量的37.7%。【结论】牛AsiaⅠ型FMDVVP1基因表达成功,且表达产物具有一定的生物学活性。