水稻耐盐相关基因ZRP4的克隆及其植物表达载体的构建

采用RT-PCR技术克隆了水稻O-甲基转移酶ZRP 4基因的cDNA片段,并进行了序列测定与分析。结果表明,该序列全长1 101 bp,编码366个氨基酸,与G enB ank中水稻ZRP 4基因序列比对,核苷酸同源性为99.8%,氨基酸同源性为99.7%。将克隆片段插入中间载体pBPFΩ7,经H indⅢ酶切回收带有P 35s启动子和nos终止子片段,连接pCAM B IA 1301载体,成功构建ZRP 4基因的植物表达载体。     

籽鹅催乳素基因的克隆及诱导表达条件的优化

运用RT-PCR方法,获得籽鹅脑垂体催乳素（Prolactin,PRL）基因编码区序列cDNA,克隆到pMD18-T载体上。DNA序列分析表明,PRL cDNA全长690 bp,编码230个氨基酸残基,与皖西白鹅的碱基同源性达99.57%,氨基酸同源性达99.56%。将所得序列与表达载体pET-32 a（＋）构建表达质...     

梭梭胆碱单氧化物酶基因(CMO)的cDNA克隆

甜菜碱被认为是在细胞中起着无毒渗透保护作用的细胞相溶性物质,广泛存在于植物、动物细胞中,高等植物中的甜菜碱生物合成是以胆碱为底物催化合成,即:胆碱→甜菜碱醛→甜菜碱,其中第一步是甜菜碱合成的限速反应,由胆碱单氧化物酶(CMO)催化.以梭梭为材料,提取总RNA,用RT-PCR法合成梭梭CMO的cDNA,约为821 bp,测序结果表明,该克隆包含一个完整的开放读码框,编码一个由262个氨基酸构成的多肽,通过BLAST进行同源性比较,发现此基因与菠菜和山菠菜中同源基因CMO的同源性为75%和82%,证明此基因为梭梭的CMO同源基因.     

鳡胰岛素样生长因子1基因的克隆及其组织特异性表达分析

为克隆鳡(Elopichthys bambusa)的胰岛素样生长因子1(IGF1)全长cDNA和启动子序列及明确其组织表达特征,采用反转录PCR(RT-PCR)、cDNA末端快速扩增(RACE)和染色体步移等技术,从鳡肌肉中获得了IGF1基因的全长cDNA(844bp)和上游启动子部分序列(627bp)。结果表明:IGF1基因包含218bp的5′端非翻译区、140bp的3′端非翻译区和486bp的开放性阅读框(ORF),编码161个氨基酸,包含前44个氨基酸残基为信号肽、70个氨基酸残基的4个功能结构域和C端47个氨基酸残基的延伸肽结构域。启动子无TATA框,但含有一成肌分化抗原(Myo D)结合位点。氨基酸同源性和系统发育分析发现,鳡IGF1与鲤形目其他鱼类的同源性较高(94.41%～99.38%),亲缘关系最近。半定量RT-PCR结果显示,IGF1在鳡的肝脏中表达最高,而心脏中未见其明显表达。该研究为明确IGF1参与鳡生长发育的机制研究及其在鳡的繁殖育种中的应用奠定了基础。     

三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶基因克隆及植物表达载体的构建

通过RT PCR技术从盐生植物三角叶滨藜总RNA中,扩增并克隆了BADH68基因。该基因全序列显示,核苷酸序列长1520bp,12～1515bp为1个开放阅读框架,推测的氨基酸序列全长为500个氨基酸残基,其核苷酸序列与菠菜和山菠菜同源性分别为89%和95%。利用BamHI和SacI酶切位点将BADH68基因连接到pCAMBI A2301的多克隆位点,并把35S启动子和nos终止子分别连接到BADH基因的上游和下游的多克隆位点上,获重组植物表达质粒pCAMATBADH682,并转入根癌农杆菌LBA4404中,获LBA4404(pCBAMATBADH682)菌种。     

CBF3基因的克隆、生物信息学分析及植物表达载体的构建

从拟南芥基因组DNA中分别克隆了CBF3基因和逆境诱导型启动子Rd29A,测序结果显示:克降的CBF3基因长776bp.编码216个氨基酸,与GeneBank公布的的序列相比对,核苷酸同源性达到99.2%,并利用生物信息学手段对其氨基酸序列、进化树、理化性质、疏水性/亲水性等进行分析;启动子Rd29A全长为956 bp,与已报道的该启动子序列比较,其核苷酸同源性为99.5%.以双元载体pCAMBIAl301为基础,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1301一Rd29A-CBF3,为利用CBF2基因提高植物的耐寒性创造了条件.     

野生罂粟BBE基因克隆及RNAi载体构建

以野生罂粟(Papaver somniferum)试管苗幼叶为材料,用Trizol试剂盆提取总RNA,通过RT-PCR法获得BBE基因的cDNA片段,序列分析表明,所获得的cDNA序列全长1 608 bp,具有完整的开放阅读框(ORF),编码536个氨基酸,经blast检索该片段与GenBank中的小檗碱桥酶基因BBE(AF025430)同源性为94.84%.以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体pART27为基础,构建了CaMV-35S启动子驱动的含小檗碱桥酶基因片段反向重复序列的RNAi双元表达载体pARB,为培育低吗啡,高蒂巴因的罂粟新品系奠定了基础.     

青花菜β-1,3葡聚糖酶基因的克隆、表达分析及其植物表达载体的构建

根据其他植物的β-1,3-葡聚糖酶基因保守域序列设计简并引物,扩增出青花菜β-1,3-葡聚糖酶基因的中心区段,结合5′RACE和3′RACE技术获得该基因的5′端序列和3′端序列,经序列拼接获得1个1 277 bp 的cDNA,在GenBank 中登录号为EF484879,定名为BObg.序列分析结果表明,该cDNA 包含1个1 056 bp的开放阅读框,编码352个氨基酸,其理论上的等电点PI=7.314,相对分子质量为3.892×104,聚类分析显示该序列与已报道的其他植物的β-1,3-葡聚糖酶基因具有较高氨基酸序列同源性.利用未接种和接种霜霉病后不同时期的青花菜植株细胞进行半定量RT-PCR分析,结果表明,该基因在霜霉病接种后48 h优势转录表达,未接种和接种后其他时期都呈低水平转录表达.利用pBI121质粒构建含35S启动子的正义表达载体,酶切图谱和PCR分析结果证明该表达载体构建成功.     

黄瓜磷脂酶D基因片段克隆及其反义表达载体的构建

采用RT-PCR方法,从新泰密刺黄瓜的幼叶中得到长为1018 bp的cDNA片段,编码339个氨基酸,与GenBank中甜瓜磷脂酶D基因相比核苷酸同源性为96%,氨基酸同源性为97%.克隆片段经双酶切消化,反向插入到植物表达载体pBI121的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,构成磷脂酶D基因的反义表达载体.     

万寿菊番茄红素β-环化酶基因及其启动子克隆和功能分析

【目的】克隆万寿菊番茄红素β-环化酶基因和其启动子,进行生物学信息分析,并预测启动子功能,为万寿菊类胡萝卜素的代谢机制和叶黄素含量的调控提供参考依据。【方法】通过RT-PCR技术从万寿菊总RNA中克隆得到TeLCYb的cDNA序列;应用生物学方法分析其DNA序列及其编码蛋白质序列特征,使用DNAMAN和在线软件Box Shade对其氨基酸序列同源性比对分析,并利用MEGA6.0构建进化树,分析其亲缘关系;根据其cDNA序列利用FPNI-PCR法克隆其启动子序列,利用Plant Care在线数据库分析万寿菊TeLCYb启动子调控元件,构建启动子缺失表达载体pTeLCYb(-1969)∷GUS和pTeLCYb(-1140)∷GUS,利用农杆菌介导法侵染烟草,以GUS为报告基因研究不同调控元件的活性。【结果】从万寿菊中成功克隆TeLCYb,生物信息学分析发现,其全长共1 865 bp,开放阅读框为1 527 bp,编码508个氨基酸,氨基酸序列同源比对结果表明其与西洋蒲公英和菊花的同源性最高,且具有LCYb蛋白质特有的保守功能位点和特征多肽序列,在进化上与菊科单独聚为一枝。在已知基因序列的基础上获得长度为1 806 bp的TeLCYb启动子序列,生物学信息分析表明:该启动子除包含核心启动子元件TATA-box、CAAT-box外,还含有多种光应答元件和激素响应元件,其中光响应元件有13个,激素响应元件有5个,此外还具有MYBHv1结合位点元件、耐热响应元件、生理调控作用元件等顺式调控元件。GUS化学组织染色结果显示不同长度启动子均能够驱动GUS在茎、叶、花药及柱头中表达,但不同组织GUS染色蓝色斑点深度不同,其中花器官中花药和柱头中GUS酶活性最强;相对于启动子pTeLCYb(-1969),pTeLCYb(-1140)启动子还能够驱动GUS在根、叶和花萼中特异性表达,且各组织中GUS酶活性明显强于启动子pTeLCYb(-1969)的GUS化学组织染色结果。【结论】不同长度TeLCYb启动子均能驱动下游GUS的表达,但启动子的作用部位和作用强度存在差异,推测在ATG上游1 140 bp和164 bp区间的光响应元件可能具有增强子的功能,而全长启动子特有的激素响应元件和热响应元件可能具有抑制或降低启动子功能的作用。     

甘蔗可溶性酸性转化酶（SoSAI1）基因的克隆及表达分析

【目的】克隆甘蔗可溶性酸性转化酶基因（SoSAI1）全长cDNA序列和5?侧翼启动子序列,并分析其序列特征和基因表达模式。【方法】利用RACE技术克隆SoSAI1的全长cDNA序列,应用生物信息学软件分析SoSAI1预期编码蛋白特征;采用Genome Walking技术克隆SoSAI1的启动子序列;采用实时荧光定量PCR分析不同生长期SoSAI1在甘蔗叶和茎中的表达,以及PEG 6000、100 mmol•L-1 NaCl和6℃胁迫下,SoSAI1在甘蔗苗期根和叶中表达模式。【结果】SoSAI1的cDNA序列全长为2 387 bp,ORF长2 058 bp,编码685个氨基酸,预测其分子量和等电点分别为74.44 kD和5.6,GenBank登录号为JQ406875。5?侧翼启动子序列长417 bp,含有胚乳特异表达顺式作用元件和参与干旱诱导的MYB结合位点,GenBank登录号为KC862314。SoSAI1表达在生理成熟期的花序和花序轴中较高,而在成熟茎和老茎中较低。15%PEG和6℃能诱导叶中SoSAI1表达,而15%PEG和NaCl能诱导根中SoSAI1表达。【结论】获得SoSAI1全长cDNA序列和部分启动子序列,SoSAI1在甘蔗生长发育和蔗糖积累,并在应对环境胁迫中发挥作用。     

鸭CD8α基因启动子的分析及其转录活性

【目的】对鸭CD8α基因启动子活性区域进行分析,为鸭CD8α基因功能和表达调控机理研究提供依据。【方法】利用前期基因组步移技术获得的鸭CD8α基因的启动子区序列,制备一系列启动子缺失突变体（-625/-1 bp,-1 110/-1 bp,-1 413/-1 bp,-2 151/-1 bp）,定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic 中,构建荧光素酶报告基因重组载体,采用 Lipofectamine 2000 将重组质粒瞬时转染DT40细胞,分析CD8α基因启动子系列缺失突变体在细胞内的转录活性。【结果】鸭CD8α基因 5′侧翼区长片段具有较强的启动子活性,-1110--625启动子活性最强,且-625--1和-625--1 110 bp区域均存在正调控元件。【结论】成功构建了荧光素酶报告基因真核表达载体,确定了鸭CD8α基因调控区,为进一步研究其转录调控机制奠定了基础。     

一个新的枳NAC基因cDNA全长的克隆及其亚细胞定位分析

以拟南芥的NAC1 cDNA序列作为模板,对柑橘EST数据库进行同源检索筛选,利用生物信息学方法克隆了柑橘NAC1基因的cDNA序列。以枳(Poncirus trifoliata)花的cDNA为模板,根据以上cDNA序列设计特异性引物,利用5'RACE和3'RACE技术,分别获得了NAC1基因的5'和3'末端,序列拼接后获得枳的NAC1 cDNA全长,命名为Pt-NAC1。Pt-NAC1全长为1351 bp,含有1个1047 bp完整的开放读码框(ORF),5'末端起始密码子ATG起始于25 bp,3'末端非翻译区为280 bp。该cDNA推导编码348个氨基酸,与苹果、拟南芥、杨树中相应序列的同源性分别为64.8%、57.0%、61.3%。生物信息学分析结果表明:Pt-NAC1 cDNA序列中有miRNA164的识别位点,还有高度保守的NAC结构域。构建Pt-NAC1亚细胞定位载体35S-GW-GFP-FJ619349,用基因枪转化洋葱表皮细胞,亚细胞定位结果表明:Pt-NAC1均定位于细胞膜中。     

超级稻DAD1基因的cDNA克隆及其正反义表达载体的构建

采用RT-PCR方法从超级稻幼苗中扩增DAD1基因的cDNA,并克隆测序,核酸序列表明该基因编码区为342bp,编码114个氨基酸残基.与GenBank发表的序列(XM_472334)相比,有3处碱基不同,分别为105bp处的C(GenBank的为T),148bp处的A(G),149bp处的C(T).将该基因分别正向和反向插入CaMV35S启动子后,构建了基因在植物中的正义、反义表达载体.     

君子兰八氢番茄红素合成酶基因的克隆与序列分析

根据GenBank上登陆的黄水仙八氢番茄红素合成酶基因(登录号:X78814.1)设计特异引物,通过PCR扩增从君子兰cDNA中克隆出一个1.4 kb的片段。序列分析表明,这个序列全长1 395 bp,包含一个1 272 bp的开放阅读框,并且编码423个氨基酸。与水仙(DQ984674)、文心兰(FJ859988)和茶花(EF545005)相比,此cDNA序列显示出98%~76%的同源性,并且与水仙、猕猴桃、番茄和柿相比,其氨基酸序列显示出达到了99%~80%的同源性。由此可知,研究所克隆的序列为君子兰的PSY全长基因,该PSY基因已登陆GenBank(登录号:JF499694)。     

甘蔗B家族蔗糖磷酸合成酶基因SotSPSB的克隆及原核表达

【目的】克隆甘蔗B家族s0心PsB基因并进行原核表达,为进一步研究甘蔗SPS酶学特性及SPS活性调控机制奠定基础。【方法】在进化分析的基础上,通过同源克隆获得甘蔗SofSPSB基因部分序列,再结合RACE技术获得全长cDNA序列。扩增SofSPSB基因ORF并连到原核表达载体pETBlue－2上导入大肠杆菌BL21（DE3）中表达。【结果】通过比对B家族中进化关系很近的玉米（Zeamays）ZmSPS1和水稻（Oryzasativa）OsSPS1基因序列,并在保守区设计一对引物扩增获得甘蔗B家族SPS基因（SolSPSB）2330bp序列。结合5’－RACE和3’－RACE技术获得3481 bp SofSPSB基因全长cDNA序列,该序列包含一个3225bp的开放阅读框（0I江）;起始密码子（ATG）位于转录起始位点后56bp处,终止密码子（TGA）后有一段201bp的非编码序列,并带有真核生物典型的polyA尾巴;编码1074个氨基酸,SofSPSB与Zm—SPS1、OsSPS1的核苷酸序列同源性分别为94．7％和81．3％,氨基酸序列同源性分别为96．0％和83．9％;其理论分子量Mw=118．96kDa,等电点pI=6．30。经原核表达后纯化获得带6xHis标签的融合蛋白。【结论】克隆获得甘蔗B家族Sol-SPSB基因全长cDNA序列,成功构建了SoPSPSB基因原核表达载体,使其在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。     

斑鳜胃蛋白酶原C及其5'侧翼区的克隆及序列特征分析

采用RT—PCR和RACE等技术克隆了斑鳜（Sinipercascherzeri）胃蛋白酶原C（pepsinogenC,PGC）的cDNA全长和部分DNA序列,结果表明：PGCcDNA序列全长1505bp,5’端非翻译区37bp,3’端非翻译区304bp,开放阅读框架（ORF）1164bp,共编码含有387个氨基酸的蛋白质,包括由16个氨基酸组成的信号肽、39个氨基酸的激活肽和332个氨基酸的成熟肽。斑鳜PGC氨基酸序列与斜带石斑鱼、伯氏豚虾虎鱼、狼鲈、美洲红点鲑4种鱼的相似度分别为92．0％、91．5％、90．2％、89．1％,与非洲爪蟾、鸡、人、兔、褐家鼠的序列相似度分别为76．8％、72．8％、72．5％、69．9％、67．3％,表明PGC基因在长期的进化中较为保守。PGC基因由9个外显子和8个内含子组成,内含子剪切位点符合GT—AG规则,在第7含子中发现（GACA）6、（CA）6类型的微卫星序列,第8内含子中发现（TG）,类型的微卫星序列。采用锚定PCR方法获得了PGC5’侧翼区长1924bp的序列,启动子区域位于-40～＋10bp,包含TATA盒以及GATA-1、CdxA、Hand1／E47、AP-1、Nkx-2、S8、FOX J2等转录因子的结合位点。结果为进一步研究该基因的表达、功能及其转录调控特征奠定了分子基础。     

番茄γ-生育酚甲基转移酶基因的克隆与分析

[目的]为进一步研究γ-生育酚甲基转移酶(TMT)基因的功能奠定基础。[方法]以拟南芥γ-TMT cDNA为信息探针,在GenBankdbEST数据库中搜索与其高度同源的番茄EST序列,通过人工序列拼接得到番茄γ-TMT的cDNA序列。据此拼接序列设计1对特异引物,以番茄叶片cDNA第1链产物为模板进行RT-PCR,回收目的片段,转化到大肠杆菌DH5α进行TA克隆。最后对获得的阳性克隆进行测序,分析测序结果与其他物种中该基因之间的同源性,进行氨基酸序列比对及系统进化分析。[结果]经RT-PCR扩增出1300bp左右的片段,成功克隆了番茄γ-TMT基因。克隆片段全长1354bp,包含1个1089bp的完整开放读码框,与拼接序列完全一致。番茄γ-TMT基因编码的氨基酸序列与马铃薯、小麦、玉米和拟南芥的γ-TMT基因的同源性分别达89%、75%、75%和70%。系统进化分析表明,番茄与马铃薯的γ-TMT基因有较近的亲缘关系。[结论]该试验中克隆的番茄γ-TMT基因编码的蛋白质分子量为39.8kD,等电点为8.28。     

红海榄液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆与分析

根据液泡膜Na+/H+反转运蛋白基因(fHXl)的保守序列设计引物,通过RT-PCR扩增得到红海榄Na+/H+反转运蛋白基因的cDNA片段,然后采用cDNA末端快速扩增法(RACE)得到RsHX1基因的全长cDNA序列,GenBank登录号为FJ627273,被命名为RsNHXl.该基因序列的长度为2 094 bp,包...