转基因抗虫棉外源DNA插入整合结构分析和转化事件特异性检测方法的建立

通过3’端2次高效热不对称交互PCR(hiTAIL-PCR)和5’端4次hiTAIL-PCR及1次长链PCR获得了转基因抗虫棉材料06N-119的外源DNA插入片段的全序列。外源DNA插入片段全长11578bp,由NptⅡ基因和Bt基因两个表达盒串联构成。插入位点处缺失75个碱基,未发生基因重组现象。根据3’端旁侧序列设计引物,特异性和灵敏度检测结果表明,建立的3’端定性PCR检测方法特异性强,灵敏度高,最低检测限为每100ng模板量的0.05%,相当于11个靶标序列拷贝。本研究结果对转基因抗虫棉外源基因检测和生物安全评价具有重要意义。     

转GbVe1基因在棉花基因组中的整合与定位分析

【目的】明确转GbVe1基因棉花的插入位点序列特征。【方法】Southern杂交筛选低拷贝基因插入的转基因棉花株系,以hiTAIL-PCR(Polymerase chain reaction)获取其T-DNA侧翼序列,然后根据获得的T-DNA侧翼序列设计特异PCR引物,验证插入位点的准确性。【结果】Southern杂交候选了T-DNA低拷贝插入的3个转基因棉花株系,hiTAIL-PCR分离到RB端侧翼序列(119~1 018 bp)、LB端侧翼序列(243~516 bp);侧翼序列的AT碱基含量在63%以上。转基因株系7/100826-152和12/100826-393插入位点都位于Gohir.D01G157600.1内含子上。转基因株系1/w-ch14插入位点分别位于Gohir.D01G157600.1内含子和A12染色体的基因间隔区中。T-DNA在Gohir.D01G157600.1内含子的插入事件造成了21 bp碱基的基因组序列缺失。T-DNA到侧翼序列的PCR产物证明Gohir.D01G157600.1上的插入位点真实可靠。【结论】hiTAIL-PCR获取了转GbVe1基因棉花的T-DNA侧翼序列,提供了T-DNA插入位点位于Gohir.D01G157600.1基因内含子的特异性检测引物。     

基于重测序鉴定SbHKT基因在陆地棉基因组中的插入位点

【目的】明确SbHKT基因棉花HKT-1株系的插入位点序列特征。【方法】对HKT-1株系重测序,本地BlastN比对获得插入位点处的侧翼序列,设计聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)特异引物验证插入位点的准确性。【结果】获得SbHKT基因插入位点处107 bp的左边界(Left border,LB)端侧翼序列HKT1_LSEQ,122 bp的右边界(Right border,RB)端侧翼序列HKT1_RSEQ;锚定基因组后显示SbHKT基因的插入引发了陆地棉染色体结构变异。分别根据LB和RB端侧翼序列设计PCR特异引物扩增HKT-1株系T-DNA全长,目的条带含有完整的T-DNA骨架序列以及Sb HKT基因序列,证实HKT1_LSEQ和HKT1_RSEQ是同一个插入位点的左右侧翼序列。【结论】基于重测序技术获得了Sb HKT基因在陆地棉基因组中的侧翼序列,建立了SbHKT基因转化体特异性检测方法。     

转基因耐除草剂大豆A2704-12定性PCR检测方法研究

本研究建立了转基因耐除草剂大豆A2704-12定性PCR检测方法.根据A2704-12转化体外源插入片段5'端与大豆基因组连接区序列设计特异性引物,以大豆内源基因Lectin为内标,从A2704-12转化体中特异性扩增出239 by大小的特异性目的片段.同时对该方法特异性和灵敏度进行测试,结果显示:该方法能检测出A27...     

转基因水稻BarKasalath-01事件特异性检测

利用hi TAIL-PCR方法研究了转基因水稻Bar Kasalath-01中外源基因在基因组上插入位点的序列特征,获得了外源基因T-DNA右边界旁侧序列511 bp,与水稻基因组数据库比对发现,外源基因插入位点位于水稻基因组第8号染色体的第3 326 720处。根据整合位点水稻基因组序列和外源基因T-DNA左边界序列设计引物,扩增得到了左旁侧序列783 bp。基于左右旁侧序列,建立了转基因水稻Bar Kasalath-01的事件特异性定性PCR检测方法,扩增片段分别为783 bp和411 bp。该方法特异性强、灵敏度高,能够在Bar Kasalath-01基因组DNA含量为0.1%的模板中检测出转基因成份。依据旁侧序列,还建立了快速鉴定转基因后代植株基因型的3引物PCR检测方法。这些方法的建立,实现了对转基因水稻Bar Kasalath-01转化事件的特异性检测。     

转基因玉米MON88017旁侧序列分析及定性PCR检测

采用基因组步移法和巢式PCR方法研究转基因玉米MON88017外源基因插入位点旁侧序列特征,获得了外源基因插入位点的左边界旁侧序列504bp,包括336bp的插入载体序列和168bp的玉米基因组序列。根据此旁侧序列,设计MON88017转化事件特异性引物并进行定性PCR扩增,扩增片段为446bp,建立了转基因玉米MON88017转化体特异性检测方法。该方法特异性强、灵敏度高(0.1%),为转基因玉米品种MON88017进出口检测和标识检测提供了技术基础。     

玉米样品中转基因玉米Bt176含量检测

根据其检测特异性,转基因产品检测技术可分为筛选、基因、构建和转化体特异性检测四类.由于转化体特异性检测方法的具有高度特异性,目前,一些发达国家对于转基因产品检测方法正逐步过渡到转化体特异性序列的检测方法.本研究针对转基因玉米Bt176的外源基因3'端与玉米基因组DNA相接区序列设计具有转化体特异性的引物和荧光探针.利用实时荧光定量PCR,以已知Bt176含量样品为标准样品建立内外源基因标准曲线,利用该标准曲线对多个玉米样品Bt176玉米成分含量进行检测,结果显示该方法检测结果准确,检测特异性强,Bt176玉米检测极限浓度达到0.001 ng/μL.同时该方法操作简单,适合转基因样品大批量检测.     

新型抗广谱性除草剂草甘膦转基因油菜的创制及其鉴定

草甘膦是世界上应用最广泛的广谱性除草剂,目前我国还没有自主知识产权的抗草甘膦油菜品种。本研究利用农杆菌介导的油菜下胚轴遗传转化方法,将新型抗草甘膦基因I.variabilis EPSPS转入甘蓝型油菜品系J9707中,获得了126株阳性转化株,阳性率为97.0%。这些转化单株中的T-DNA插入以单拷贝为主(占44.8%)。通过反向PCR确定了EPS-2、EPS-6和EPS-7等油菜转化体中T-DNA插入位置,并设计转化体特异性引物对它们的T0~T3代材料进行检测,证明了它们的T-DNA在基因组水平上整合的稳定性。RNA和蛋白水平的表达分析证实,I.variabilis EPSPS转基因及其蛋白产物在各转化株系不同世代能够稳定表达。苗期进行不同剂量的除草剂喷施处理发现,EPS-1、EPS-2、EPS-5、EPS-6和EPS-7等株系可耐受4倍田间推荐使用剂量的草甘膦。本研究所创建的新型抗草甘膦油菜种质资源将为我国抗除草剂油菜品种培育奠定了重要基础。     

转cry1Aa基因抗虫棉整合结构解析及转化体特异性检测方法的建立

【目的】cry1Aa基因是2011年本实验室在我国棉花商品种子中发现的1种未经批准的转基因成分,本研究旨在通过整合结构解析,建立特异性检测方法,对市售棉种进行初测,明确该外源基因在我国棉种中的存在情况。【方法】通过Genome walking、长链PCR分离获得了转cry1Aa基因棉花转化体(定名为NN6转化体,简称NN6)的外源基因整合结构,同时基于插入位点基因组及外源DNA连接区,建立了NN6转化体特异性的定性聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)方法和实时荧光定量PCR方法。【结果】NN6整合结构主要包括cry1Aa、aad和Npt II基因,插入棉花基因组7号染色体37 169 450位,产生91 bp基因组缺失;所构建的定性PCR检测方法能特异、快速地对棉花单株和种子单粒中NN6转化体的纯/杂合状态进行鉴定,实时荧光定量PCR检测限为44拷贝,能满足国内外对转基因标识的需要;对含有cry1Aa基因的3个市售棉种进行检测,其纯合度分别为1.51%,5.21%和21.09%。【结论】本研究解析了NN6的整合结构,并建立特异性检测方法,为我国转基因棉花新品种选育及转基因安全管理提供技术手段。     

黑龙江省大豆产区疑似转基因大豆的分子检测

利用表型鉴定和PCR分子检测相结合的方法,对黑龙江省国储库拒收的疑似转基因大豆进行了转基因成分检测.表型鉴定方法为草甘膦叶片涂抹,PCR分子检测对象为CaMV35S启动子、NOS终止子及目的基因CP4-EPSPS.利用大豆自身的凝集素基因作为PCR检测的内标基因,以有效排除DNA质量、实验操作等因素对检测结果的影响.结果表明,所测材料不抗草甘膦除草剂,也不合所检测的外源基因,由此判断该批次材料不是转基因大豆.     

转基因玉米CM8101特异性定性PCR检测方法

旨在为转基因安全监管提供技术支撑,本研究建立了转基因玉米CM8101定性检测方法。根据CM8101转基因玉米插入序列信息,于3′端侧翼序列处设计PCR引物。通过扩增体系优化、特异性测试、灵敏度测试、稳定性测试等技术参数的测试建立了转基因玉米CM8101定性检测方法。结果表明:本特异性检测方法各项参数符合相关转基因分子检测标准的要求,具有良好的品系特异性,方法检测灵敏度可达0.1%。CM8101是中国自主研发的具有产业化应用前景的转基因玉米新品系,本方法为品系和其衍生产品的鉴定提供技术手段。     

基因组测序技术解析耐除草剂转基因水稻G2-7的分子特征

Molecular characterization, such as copy number and flanking sequence of foreign DNA fragment insertion site, is the important identity information, provided during safety assessment of genetic modified crop. In this study, the T-DNA insertion site, copy number and flanking sequences were identified in transgenic glyphosate-tolerant rice G2-7 based on whole genome sequencing in combination bioinformatics analysis method. 47.13 Gb clean sequence data for G2-7 was generated on Illumina NovaSeq 6000 platform. The junction reads mapped to boundaries of T-DNA and flanking sequences in G2-7 were identified by comparing with sequence of transformation vector and rice reference genome. The results showed that exogenous T-DNA fragments was integrated in the position of Chr. 1 36,189,491-36,189,507 with a single copy, 16 bp rice genome sequence was deleted at the insertion site and no insertion of vector backbone. 375 bp and 353 bp flanking host DNA sequence of 5′-end and 3′-end of the insertion DNA fragment were also obtained, respectively. The putative insertion location and flanking sequences were further confirmed by PCR amplification and Sanger sequencing. The results not only provided data support for safety assessment and event specific detection, but also demonstrated that WGS was an effective technique for identifying molecular characterization in rice.     

可去除选择标记的转Bt基因抗虫玉米研究

将组成型表达的玉米泛素启动子与苏云金杆菌杀虫蛋白基因Bt连接，插入根瘤农杆菌双T-DNA质粒，构建一个T-DNA结构域含有抗潮霉素选择标记基因hyg，另一个T-DNA结构域含有抗虫基因的双T-DNA单子叶植物表达载体，用以转化农杆菌菌株，再通过共培养转化玉米胚性愈伤组织。通过潮霉素培养基抗性筛选，用特异PCR扩增和Southern杂交检测，从分化再生的T0代植株中，鉴定出4个转化Bt基因的阳性植株。目前，正结合进行田间分离纯合和DNA分子鉴定，培育去除选择标记基因的转基因抗虫玉米自交系。     

多重实时荧光PCR TaqMan-MGB杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MIR162

为对转基因玉米MIR162的进口实行监测、规范转基因玉米在国内市场中的流通,建立一种转基因玉米MIR162准确快速的检测方法,通过设计转基因玉米MIR162品系特异性序列的引物和探针,摸索和优化多重荧光PCR体系和参数,开发建立多重实时荧光PCR TaqMan-MGB杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MIR162。结果表明,转基因玉米MIR162品系标准品和平行样品中内标基因和品系特异性基因均出现明显扩增曲线,其他转基因玉米品系标准品仅内标基因有扩增曲线,空白对照无扩增曲线,说明该TaqMan-MGB探针对转基因玉米MIR162品系具有扩增特异性。该方法可作为鉴定筛查转基因玉米MIR162品系及其转化体成分的有效方法,用于规范管理转基因产品在市场上的流通。     

转基因玉米MIR162转化事件特异性检测方法及其标准化

转基因玉米MIR162是美国先正达公司开发出来的新型抗鳞翅目昆虫的转基因玉米品种。本研究目的在于建立该品系转化事件特异性定性、定量检测方法并形成定性检测国家标准。定性PCR体系经实验室内部比对及实验室间循环验证结果表明,该体系特异性强,灵敏度较高(0.1%),具有良好的重复性、再现性。Taqman探针实时荧光PCR检测结果表明,所设计的探针特异性强,检测低限(LOD)在0.01%以下;定量标准曲线R²均为0.999,扩增效率为98.622%和99.602%,SD范围为0.014~0.209,RSD的范围为0.049%~0.879%,稳定性好;对转基因含量为1.0%、0.5%、0.1%的样品定量结果相对偏差在8%以内,结果较为准确。本研究建立的方法完全可用于含转基因玉米MIR162成分样品的检测。     

以实时荧光定量PCR技术检测转基因玉米MON88017

根据转基因玉米MON88017的左侧侧翼序列和玉米内标基因(zSSIIb)分别设计特异性引物及Taqman探针,通过实时荧光PCR技术建立MON88017的定量特异性检测方法。利用含有内标基因和侧翼序列的标准质粒分子,建立了玉米内标基因和侧翼序列的标准曲线。检测了5个已知MON88017含量(0.01%、0.05%、0.10%、0.50%、1.00%)的混合样品中的转基因含量,结果表明检测底限可以达到19~30个阳性拷贝。该研究建立的实时荧光定量PCR技术灵敏度高、特异性强。     

The integration and insertion site of GbVe1 gene in the genome of transgenic cotton (Gossypium hirsutum)

[Objective] The aim of this study was to obtain the flanking sequences of T-DNA in the transgenic cotton containing a GbVe1 over-expression cassette. [Method] The T-DNA insertion copy number in the transgenic GbVe1 cotton was analyzed by southern blot. Flanking sequences of the transgenic lines with putative single T-DNA insertion copy were obtained using high-efficiency Thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction (hiTAIL-PCR). The T-DNA insertion sites were further confirmed by PCR with specific primers. [Result] RB-flanking sequences (119-1 018 bp) and LB-flanking sequences (243-516 bp) were obtained from three transgenic lines with low copy number of T-DNA insertion. The AT content was more than 63% in these flanking sequences. A same single insertion site in the intron of Gohir.D01G157600.1 was found in the two transgenic lines 7/100826-152 and 12/100826-393, while two separated insertion sites, one also in the intron of Gohir.-D01G157600.1 and the other in the intergenic region of A12 chromosome, were found in the transgenic line 1/w-ch14. A deletion of 21 bp was found in the insertion site in the intron of Gohir.D01G157600.1. The T-DNA insertion in the intron of Gohir.D01G157600.1 was further confirmed by the specific PCR. [Conclusion] The flanking sequences of T-DNA in the transgenic GbVe1 cotton were obtained and the specific transformation event in the intron of Gohir.D01G157600.1 was further confirmed by PCR.     

棉花器官特异病原相关启动子的克隆与分析

通过Tail PCR分离了GHNBS基因的5'侧翼序列,PLACE分析表明其含有CAAT-box、TATA-box及乙烯、茉莉酸甲酯、脱落酸应答元件,病原菌诱发子反应元件W boxes、GT-1、MYB、MYBST1和MYB1LEPR等。同时,在这段序列上还存在一些根特异表达元件。包括2个as-1和1个EECCRCAH1在内的3个增强子元件也存在于这段序列的上游区域,它们可能增强GUS基因在转基因植物中的表达。将GHNBS基因的5′调控序列以不同缺失与GUS基因融合转化拟南芥,发现GUS基因主要在根、茎的韧皮部和叶脉中表达。PGN-1559和PGN-1117表现为器官特异性表达。而PGN-476不能特异表达,同时也不能在根部表达。SA,ABA,MeJA,Eth-ylene,枯萎病菌和细菌DC3000处理后GUS活性均有显著上升,说明GHNBS基因的5′调控序列含有相应的应答反应因子,是一个器官特异以及与病原相关的启动子。