转基因玉米MIR162转化事件特异性检测方法及其标准化

转基因玉米MIR162是美国先正达公司开发出来的新型抗鳞翅目昆虫的转基因玉米品种。本研究目的在于建立该品系转化事件特异性定性、定量检测方法并形成定性检测国家标准。定性PCR体系经实验室内部比对及实验室间循环验证结果表明,该体系特异性强,灵敏度较高(0.1%),具有良好的重复性、再现性。Taqman探针实时荧光PCR检测结果表明,所设计的探针特异性强,检测低限(LOD)在0.01%以下;定量标准曲线R²均为0.999,扩增效率为98.622%和99.602%,SD范围为0.014~0.209,RSD的范围为0.049%~0.879%,稳定性好;对转基因含量为1.0%、0.5%、0.1%的样品定量结果相对偏差在8%以内,结果较为准确。本研究建立的方法完全可用于含转基因玉米MIR162成分样品的检测。     

转基因玉米MIR162转化事件特异性检测方法及其标准化

转基因玉米MIR162是美国先正达公司开发出来的新型抗鳞翅目昆虫的转基因玉米品种。本研究目的在于建立该品系转化事件特异性定性、定量检测方法并形成定性检测国家标准。定性PCR体系经实验室内部比对及实验室间循环验证结果表明,该体系特异性强,灵敏度较高(0.1%),具有良好的重复性、再现性。Taqman探针实时荧光PCR检测结果表明,所设计的探针特异性强,检测低限(LOD)在0.01%以下;定量标准曲线R²均为0.999,扩增效率为98.622%和99.602%,SD范围为0.014~0.209,RSD的范围为0.049%~0.879%,稳定性好;对转基因含量为1.0%、0.5%、0.1%的样品定量结果相对偏差在8%以内,结果较为准确。本研究建立的方法完全可用于含转基因玉米MIR162成分样品的检测。     

转基因玉米ND207转化事件特异性定性PCR检测方法及其标准化

转基因玉米ND207是中国农业大学研发的转mCry1Ab和mCry2Ab基因的抗虫玉米,本研究的目的是建立ND207转化事件特异性定性PCR检测方法。根据研发者提供的引物进行PCR扩增,PCR产物测序分析,获得了5’端旁侧序列262 bp,包括109 bp的载体序列和153 bp的玉米基因组序列, 3’端旁侧序列316 bp,包括76 bp的载体序列和240bp的玉米基因组序列。针对两端旁侧序列设计14条引物,组成25对引物组合进行引物筛选,选中3’端一对最佳引物优化PCR反应体系及反应条件,建立ND207的转化事件特异性定性PCR检测方法, PCR产物片段大小为166 bp。经过测试,该方法的检出限为0.1%,相当于20个拷贝的ND207特异分子片段。国内8家转基因生物安全检测机构对本方法进行了特异性测试、检出限测试和再现性测试,循环验证报告显示:该方法符合国家标准方法的各项要求,可在检测行业推广应用。ND207转化事件特异性定性PCR检测方法的建立,为我国ND207及其衍生品系的安全监管提供技术支撑。     

转基因玉米LAMP检测体系的建立及应用

以转基因抗虫和耐除草剂玉米Bt11为研究材料,建立Bt11环状等温扩增快速检测技术方法.利用一种具有链置换活性的Bst DNA聚合酶,针对Bt11中玉米基因组与外源基因结合处序列,设计4条特异引物,并对反应温度、时间、灵敏度、结果判断方法等参数进行初步探索.结果显示,LAMP检测方法最适反应温度及反应时间分别为65℃和60 min,其灵敏度为常规定性PCR的20倍.LAMP技术检测转基因玉米品系Bt11具有特异性高、快速、简便等优点,具有广阔的应用前景.     

转基因玉米MON88017旁侧序列分析及定性PCR检测

采用基因组步移法和巢式PCR方法研究转基因玉米MON88017外源基因插入位点旁侧序列特征,获得了外源基因插入位点的左边界旁侧序列504bp,包括336bp的插入载体序列和168bp的玉米基因组序列。根据此旁侧序列,设计MON88017转化事件特异性引物并进行定性PCR扩增,扩增片段为446bp,建立了转基因玉米MON88017转化体特异性检测方法。该方法特异性强、灵敏度高(0.1%),为转基因玉米品种MON88017进出口检测和标识检测提供了技术基础。     

转基因甜菜H7-1实时荧光PCR检测方法

运用实时荧光PCR方法对转基因甜菜H7-1外源基因FMV 35 S启动子、E93’终止子、CP 4-EPSPS外源基因和品系特异性进行了检测.建立了快速、准确的转基因甜菜H7-1转基因成分的PCR检测方法.本研究采用的FMV 35 S启动子、E93’终止子、CP 4-EPSPS和品系特异性检测引物探针能有效检测转基因甜菜H7-1中转基因成分,具有特异性,且灵敏度达到0.01％.     

抗病毒转基因木瓜的分子检测

本研究测定了抗病毒转基因木瓜品系55-1、GM YK和华农1号的结构特征序列,并根据测序结果设计、合成了结构特异性检测引物,建立了55-1、GM YK和华农1号的结构特异性检测方法.为提高检测效率,将结构特异性检测引物和内源基因检测引物置于同一反应体系之中,建立了转基因木瓜品系的两重PCR检测方法.本研究建立的PCR检测体系可用于进口木瓜的检测,从中发现未经我国批准的转基因木瓜品系,为转基因产品的标识管理提供技术支持.     

多重实时荧光PCR TaqMan-MGB杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MIR162

为对转基因玉米MIR162的进口实行监测、规范转基因玉米在国内市场中的流通，建立一种转基因玉米MIR162准确快速的检测方法，通过设计转基因玉米MIR162品系特异性序列的引物和探针，摸索和优化多重荧光PCR体系和参数，开发建立多重实时荧光PCR TaqMan-MGB杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MIR162。结果表明，转基因玉米MIR162品系标准品和平行样品中内标基因和品系特异性基因均出现明显扩增曲线，其他转基因玉米品系标准品仅内标基因有扩增曲线，空白对照无扩增曲线，说明该TaqMan-MGB探针对转基因玉米MIR162品系具有扩增特异性。该方法可作为鉴定筛查转基因玉米MIR162品系及其转化体成分的有效方法，用于规范管理转基因产品在市场上的流通。     

转基因耐除草剂大豆A2704-12定性PCR检测方法研究

本研究建立了转基因耐除草剂大豆A2704-12定性PCR检测方法.根据A2704-12转化体外源插入片段5'端与大豆基因组连接区序列设计特异性引物,以大豆内源基因Lectin为内标,从A2704-12转化体中特异性扩增出239 by大小的特异性目的片段.同时对该方法特异性和灵敏度进行测试,结果显示:该方法能检测出A27...     

植酸酶基因定性PCR检测方法及阳性质粒分子的构建

植酸酶基因在农业生产中具有很高的应用价值,正被广泛用于农作物的基因工程研究。为了满足转植酸酶基因作物安全监管的需要,通过优化PCR检测条件,建立了植酸酶基因特异性定性PCR检测方法。该方法具有良好的扩增特异性和检测灵敏度,可以满足我国植酸酶转基因作物监管需要。此外,我们将6大作物(小麦、水稻、棉花、大豆、玉米和油菜)的内标准基因和植酸酶基因克隆到同一载体上,构建成了阳性质粒分子pBS Endogenous-phytase。该质粒分子适用于这6大作物中植酸酶基因的筛查检测。本研究为转植酸酶基因作物的安全监管提供了阳性材料和检测方法。     

转基因玉米转化体特异性寡核苷酸芯片测试方法的研制

根据7种转基因玉米Bt11、Bt176、Mon810、Mon863、TC1507、GA21和NK603的重组DNA结构,利用Primer premier 5.0引物设计软件分别设计转化体特异性引物,优化PCR反应条件,对引物特异性及灵敏度进行验证。结果表明,所设计引物特异性强,灵敏度达0.1%。在植物基因组与外源基因的连接区域,利用Primer premier 5.0和Oligo 6.0软件分别设计和筛选7种转基因玉米40mer oligo转化体特异性探针,制备转基因玉米的寡核苷酸芯片,并对芯片检测的特异性、重复性及检测灵敏度进行检验。证明所设计探针特异性强,灵敏度达0.01%。与PCR检测方法相比,基因芯片检测法灵敏度高、特异性强,可有效检测及鉴定多种转基因玉米,大大提高检测的准确率和效率。     

利用微滴式数字PCR技术分析转基因玉米抗除草剂标记基因EPSP拷贝数

基于微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)平台,以转基因玉米为例,建立了转基因作物(Genetically modified crops,GM crops)外源基因拷贝数分析方法,对待测样品进行了快速鉴定,并从T_0转基因玉米株系中鉴定出多个单拷贝单株。对该方法与实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)方法在分析结果的准确性方面进行了比较,从试验数据可以看出,2种检测方法的结果比较一致,单拷贝检测结果高度一致;但是ddPCR试验操作更加简便,试验结果可重复性强,试验数据更加准确可靠。研究表明,ddPCR方法是一种更加便捷、快速和准确的外源基因拷贝数分析新方法,基于其在准确性和灵敏度方面的显著优势,将会在转基因作物的外源基因拷贝数分析中得到广泛的应用。     

转G2-EPSPS基因玉米D-3侧翼序列分析与转化体特异性检测方法

通过一次3'端高效热不对称交互PCR（hiTAIL-PCR）和一次长链PCR扩增方法获得了转抗草甘膦基因（G2-EPSPS）玉米品系D-3的外源DNA插入片段的全DNA序列（T-DNA）及两端侧翼序列,并建立了转化体特异性PCR检测方法。结果显示：T-DNA插入片段全长4 318bp,由一个G2-EPSPS基因的表达盒构成。根据T-DNA 5'、3'端侧翼序列设计引物,建立了转化体特异性检测方法,并分析了该方法的灵敏度以及检出限,研究结果表明,3'端定性PCR检测方法特异性强,灵敏度高,检出极限为每100ng模板量的0.05%。本研究结果对转抗草甘膦外源基因检测和生物安全评价及监管具有重要意义。     

转植酸酶基因玉米phyA2基因标准质粒分子构建及其检测应用

质粒分子以其良好的适应性被较多地用作转基因标准材料的替代品。本文根据转植酸酶基因玉米phyA2基因设计引物与探针,并构建了一种包含phyA2基因片段(243 bp)和内标基因片段(178 bp)的质粒分子pPZ。选取不同转基因模板DNA作用于phyA2特异性引物,PCR结果显示只有转植酸酶基因玉米出现131 bp的目的条带;选取不同转基因作物检测体系作用于质粒分子pPZ,只有以pPZ DNA为模板时出现目的条带(131 bp和88 bp)。同时采用pPZ质粒分子和转基因玉米阳性基因组DNA为标准对4个转植酸酶基因玉米混合样品(3.0%、1.0%、0.5%和0.1%)进行定量检测,t检验表明,2种标准产生的斜率、线性相关系数和定值结果没有显著差异。这些结果表明,pPZ质粒分子可以作为转植酸酶基因玉米替代品用于定性和定量检测。     

玉米预防转基因漂移试纸条快速检测方法

本研究旨在使用试纸条检测方法在玉米苗期从常规玉米育种材料中发现转基因植株,以预防非预期的转基因漂移。以转基因和非转基因玉米为材料,以笔者过去开展转基因玉米材料筛选的经验总结为基础,开发出试纸条快速检测方法。本研究介绍了检测所需用品和取样方法,并且详细讨论了样品数量、操作步骤及注意事项等。还具体演示分析了2个典型检测案例的过程和结果。本方法的操作步骤简便易学,适合专业和非专业育种者或检测人员对田间材料在自查或检验中使用。熟练掌握试纸条快速检测法,能有效筛查和预防由于花粉或种子非预期混杂造成的转基因漂移。     

转基因玉米MIR604基体标准物质研制

转基因生物安全监管是生物技术产业健康发展的保障,而转基因检测标准物质是进行转基因监管检测的物质基础,缺少标准物质就难以保证检测数据的准确性、可靠性和可比性。转基因玉米MIR604是我国批准进口用作加工原料的转基因品种,对其安全监管亟须制备标准物质。本项目通过对转基因玉米MIR604种子进行原材料鉴定、研磨、过筛、含水量测定等步骤,制备出转基因玉米MIR604纯品基体标准物质。均匀性检验和稳定性检验结果表明,本批标准物质在瓶内和瓶间均具有良好的均匀性,可在常温下运输1个月,长期稳定性达到6个月,量值稳定。本批标准物质的特性量值为转基因DNA与总DNA的拷贝数比值,由9家实验室采用MIR604/Adh1二重数字PCR联合定值,量值为0.50。充分评估了标准物质定值结果的各个不确定度分量,合成扩展不确定度为0.06 (copy/copy)。本批标准物质规格为1 g瓶–1,使用时最小取样量为100 mg,可用于转基因玉米MIR604的安全监管和定量标识、以及实验室质量控制等领域。     

一种快速高效检测转基因玉米方法的建立

建立高效的目的基因检测方法是保障生物育种研发和产业化进程的重要技术支撑。应用常规PCR法、TaqMan探针实时荧光PCR法及叶片直接PCR法对转基因玉米叶片进行CaMV35S启动子和NOS终止子2个转基因元件的检测。结果表明,叶片直接PCR法分别较常规PCR方法和TaqMan探针实时荧光PCR法节约62%、48%的时间和25%、43%的成本,而且扩增出的目的条带清晰可见,符合目的片段大小,结果真实可靠,适用于大量转基因玉米植株叶片的快速筛选和鉴定。