猪流行性腹泻病毒野毒株及弱毒疫苗株RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)野毒株及弱毒疫苗株快速鉴别检测方法,根据Gen Bank中公布的PEDV野毒株及弱毒疫苗株的ORF3基因序列,在缺失区的两端设计合成1对特异性扩增引物,用以特异性的扩增PEDV ORF3基因片段,根据目的片段大小判断PEDV的毒株类型;通过退火温度等反应条件优化,建立了区分PEDV野毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR鉴别检测方法。结果显示:所建立的RT-PCR鉴别检测方法能特异性区分PEDV野毒株和弱毒疫苗株;PEDV野毒株扩增出234 bp目的片段,PEDV弱毒疫苗株扩增出185 bp目的片段;与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、A群猪轮状病毒(PRo VA)、猪嵴病毒(PKV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪乙型脑炎病毒(JEV)及猪细小病毒(PPV)均无交叉反应;敏感性试验显示,该方法能检测到病毒滴度为1.3×10~3TCID_(50)/mL。利用该方法对采集自广西部分地区93份临床腹泻样品进行检测,临床腹泻样品中PEDV野毒株阳性率为61.29%(57/93),弱毒株阳性率为5.38%(5/93)。结果表明:该RT-PCR鉴别检测方法特异性强、灵敏度高、操作简便,能快速、准确地区分PEDV自然感染野毒株和弱毒疫苗毒株,为猪流行性腹泻的快速诊断及病原分子鉴别检测研究提供了可供借鉴的技术手段。     

猪流行性腹泻病毒野毒株/疫苗株RT-PCR鉴别诊断方法的建立

开放阅读框3(Open reading frame 3,ORF3)是猪流行性腹泻病毒(PEDV)基因组中的惟一辅助基因。前期研究表明,PEDV疫苗株的ORF3在245²93位缺失49个核苷酸。在ORF3缺失区域两端设计合成引物建立反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)可以对PEDV野毒株和疫苗株进行鉴别诊断,野毒株扩增产物为319 bp,疫苗株扩增产物为270 bp。用该鉴别诊断方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒和猪繁殖和呼吸综合征病毒的cDNA进行扩增均无特异性条带,说明该方法特异性强。现地病料的检测结果表明,该鉴别诊断方法能够区分PEDV野毒和疫苗株,而且可以排除其他病毒的影响,有助于减少免疫猪被淘汰的可能,降低经济损失。     

猪流行性腹泻病毒疫苗株与野毒株RT-PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中猪流行性腹泻(PED)疫苗株与野毒株ORF3的特点设计特异性引物,建立能够快速区分PEDV疫苗株与野毒株的RT-PCR检测方法。建立的RT-PCR检测方法能够对PEDV疫苗株与野毒株扩增出特异性片段,其大小分别为278 bp和327 bp。该方法具有快速、特异、通用等特点,可用于实验室快速诊断、野毒株的区分,为该病的诊断及免疫防控提供参考依据。     

鉴别猪流行性腹泻病毒野毒株与疫苗株双重RT-PCR检测方法的建立

为建立鉴别猪流行性腹泻病毒野毒株与疫苗株的检测方法,本研究根据GenBank中登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)M、ORF3基因序列,设计合成了2对特异性引物,通过PCR扩增条件的优化,建立了鉴别PEDV野毒株和疫苗株的双重RT-PCR检测方法。特异性试验显示,该检测方法对猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、Salmonella及E.coli等结果均为阴性;敏感性试验显示,所建立的双重PCR检测方法对M基因和ORF3基因的最低有效检测量分别为44.5拷贝/μL和481拷贝/μL。本研究建立的双重RT-PCR检测方法可实现对PEDV野毒和疫苗毒的快速检测,适合于现地猪流行性腹泻的鉴别诊断。     

猪流行性腹泻病毒变异毒株与传统毒株RT-PCR鉴别诊断方法的建立

为建立猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)变异毒株和传统毒株RT-PCR鉴别诊断方法,本研究根据GenBank中PEDV变异毒株(JN381492.1)和传统毒株(JN599150.1)S基因序列,设计两对特异性引物,进行反应条件优化。结果显示:建立的RT-PCR鉴别诊断方法能够特异性区分PEDV变异毒株和传统毒株,能扩增出变异毒株442 bp的目的片段,而传统毒株是270 bp的目的片段,并且与猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪呼肠孤病毒、猪瘟病毒、猪脑心肌炎病毒、轮状病毒均无交叉反应;敏感性结果表明该方法能检测出变异毒株和传统毒株的底限均为4×104 copies;利用该方法对42份临床腹泻样品进行检测,PEDV阳性率为69%(29/42),变异毒株占总PEDV毒株的93.1%(27/29),传统毒株占总PEDV毒株的6.9%(2/29)。该RT-PCR方法为PEDV的病原鉴别诊断和流行病学调查提供了技术手段。     

鉴别猪流行性腹泻疫苗毒株与野毒株巢式PCR检测方法的建立及初步应用

根据Gen Bank中猪流行性腹泻病毒(PEDV)的基因序列分别设计两对引物,在完成最佳条件筛选、特异性、敏感性试验的基础上,建立一种快速区分PEDV疫苗毒株与野毒株的巢式PCR检测方法。建立的PCR快速检测方法能分别对PEDV疫苗毒株和野毒株扩增出特异性片段,片段大小分别为774 bp、150bp。该方法对传染性胃肠炎病毒(TGEV)、轮状病毒(Po RV)、猪瘟病毒(HCV)、伪狂犬病病毒(PRV)则不能扩增出特异性片段。该方法具有快速、灵敏、特异、通用等特点,可用于实验室的快速诊断、分子流行病学的调查和野毒株的分离鉴定。     

猪流行性腹泻病毒YT1401株分离鉴定及分子进化分析

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是一种引起猪腹泻的病原体,但由于引发该病的病原体众多、病因复杂,仅通过临床症状和病理组织学变化并不能对PEDV确诊,本研究参考40株PEDV基因设计了1对能高效扩增该N基因片段的引物,建立了PEDV分子诊断方法。并采用该方法从山东烟台某猪场的腹泻样本中检测获得了1株PEDV,采用分段重叠策略扩增获得了该毒株全基因序列,并在此基础上分析了该毒株全基因序列以及S基因的遗传进化关系。所有分析结果均表明,本研究分离获得的PEDV毒株与经典毒株比较发生了重大变化,为新的变异株。该结果提示我们,采用PEDV经典毒株或是早年分离的毒株制作的疫苗并不能有效防控当前流行的PED,研制以当前流行毒株为背景研制新型PEDV疫苗势在必行。     

PEDV、TGEV、RV多重RT-PCR检测方法的建立与应用

为了快速准确诊断猪流行性腹泻病毒 (PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)、猪轮状病毒(RV)引起的猪腹泻病,通过设计三对引物,建立了扩增PEDV、TGEV、RV的多重RT-PCR方法,用于临床上大量腹泻病料的鉴定。该方法特异敏感,能同时检测PEDV、TGEV、RV,而对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型病毒、乙型脑炎病毒、猪细小病毒等无扩增,检测的抗原稀释极限为107。用于35个猪场120份临床样品的检测,PEDV阳性率占37.5%,TGEV阳性率占0.75%,RV阳性率占1.25%。PEDV阳性病料测序结果分析表明,与近几年分离毒株亲缘关系较近,与经典毒株和疫苗株亲缘关系较远。结果表明建立的多重PCR方法特异性强、敏感度高,能用于临床诊断及流行病学调查。     

猪伪狂犬病病毒疫苗株与野毒株鉴别PCR检测方法的建立及初步应用

本试验根据疫苗株缺失gE基因、野毒株和疫苗株均有gB基因的特点,设计两对引物,建立了PCR方法,使用该方法分别对PRV、PCV2、PPV、CSFV、PRRSV进行PCR检测,结果只能从PRV Fa野毒株DNA提取物中扩增出354、237 bp的核苷酸片段,从PRV Bartha-K61疫苗株扩增出237 bp的片段,其他病毒均未扩出条带,达到了区分疫苗株与野毒株的目的。同时,应用该方法对吉林省各大猪场进行了临床病料检测,结果表明,在采集的205份病料中有32份检测为猪伪狂犬病病毒野毒感染,阳性率为15.6%。     

基于SYBR Ⅰ实时荧光定量PCR对猪流行性腹泻病毒野毒和疫苗弱毒鉴别诊断方法的建立

本研究参考GenBank中登录的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)野毒株和弱毒疫苗株(CV777弱毒疫苗株)在高度保守ORF3基因核苷酸序列的差异,设计一对特异性荧光定量引物,分别建立基于SYBRⅠ实时荧光定量RT-PCR方法。结合熔解曲线分析可见,其野毒株和弱毒疫苗株熔解温度(Tm)分别为(81.84±0.17)℃和(83.16±0.14)℃,扩增产物的熔解曲线分析均只出现1个单特异峰,对传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒均检测不到荧光信号。结合熔解曲线可直接鉴别猪群中PEDV的感染情况和程度,可对免疫猪群PEDV野毒感染和疫苗免疫做出快速准确的鉴别诊断,尤其是对PEDV弱毒疫苗免疫后仍爆发PEDV野毒感染的研究更有临床意义。     

丰一、薪杭等蚕品种复壮后其杂交种比较试验

对夏秋蚕品种薪杭,白云,丰一,五四等进行充血复壮改良后,其复壮系的杂交一代与现行生产系杂交一代生产性能比较试验结果表明：复壮后的2对杂交种与原来的杂交种比较,在龄期发育经过、虫蛹率等性状基本持平,产量和茧丝质方面的各项性状基本相近或有所提高。     

鸡柔嫩艾美耳球虫敏感株与马杜拉霉素耐药株EST-SSR信息分析

从NCBI公共数据库获得2806条柔嫩艾美耳球虫敏感株与马杜拉霉素耐药株表达序列标签(EST),通过前处理得到全长为421.186kb的无冗余EST共1519条。在这些序列中搜索出202个简单重复序列(SSR),分布于1519条EST中,出现频率是17.45%。三核苷酸重复和四核苷酸重复是主要的类型,其中三核苷酸占67.92%,四核苷酸占25.28%,占总SSR的近93.20%。AAG/CTT和ACGT/ATGC是三、四核苷酸中的优势重复类型,分别占三、四核苷酸重复的62.72%和56.76%。     

2株海洋红酵母的复合诱变及其高产类胡萝卜素菌株的选育

选用从雷州半岛近岸海域分离鉴定的2株海洋红酵母（胶红酵母J6和黏红酵母J2）作为出发菌株,进行亚硝基胍（NTG）和紫外线（UV）复合诱变,以期筛选出高产类胡萝卜素的突变株。先用NTG处理出发菌株的菌悬液60 min,再用UV照射120 s,且要连续诱变3次;每次复合诱变后的菌悬液经短时间的液体培养后涂布于红酵母琼脂平板培养,从中筛选出一定数量的第1、2和3代突变菌株;将突变菌株接种于红酵母发酵培养基,经培养、离心和烘干,制备出干菌体细胞;用分光光度计法测定干菌体细胞中的类胡萝卜素含量,筛选出高产类胡萝卜素的突变株,并进行遗传稳定性试验。结果表明,胶红酵母J6的正向突变率为56.57%（56/99）,6株高产类胡萝卜素的突变株中,第3代3株,第2代2株,第1代1株,类胡萝卜素含量最高的突变株是胶红酵母J6-82,比出发菌株提高了99.56%;黏红酵母J2的正向突变率为53.01%（44/83）,6株高产类胡萝卜素的突变株中,第3代4株,第2代2株,类胡萝卜素含量最高的突变株是黏红酵母J2-75,比出发菌株提高了93.64%。本试验采用的NTG和UV 3次复合诱变的方法有利于海洋红酵母的变异及其类胡萝卜素含量的提升,且突变菌株有良好的遗传稳定性。     

干酪生产用菌种的筛选

采用从新疆民族乳制品中分离的菌株，研究了三种单一菌株（L1乳酸乳球菌、L2瑞士乳杆菌、L3干酪乳杆菌）和四种混合菌株（L4乳酸乳球菌：瑞士乳杆菌（1：1）、L5乳酸乳球菌：干酪乳杆菌（1：1）、L6瑞士乳杆菌：干酪乳杆菌（1：1）、L7嗜热链球菌：保加利亚乳杆菌（1：1））的发酵性能和生化特性，确定了适于干酪加工的菌种为L1、L5、L6。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌参考株抗血清的制备及野毒株血清型鉴定

将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌全部12个血清型的国际参考菌株接种于培养基大量培养。回收菌体、甲醛灭活后，加入蜂胶佐剂制成疫苗。分别免疫健康的试验用白兔。获得针对该菌单一血清型的抗血清。虽然不同血清型间有一定的交叉反应，但对同源菌株的菌体抗原的凝集效价最高。分别可达6～8个log2。用该套血清对2003年从山东省各地分离到的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌野毒株11株进行了血清型鉴定。分别为3型（2株）、4型（1株）、5型（4株）和7型（4株）。     

Studies on Aspergillus Fumigatus; Toxin Production Ry Different Strains and Serological Comparison of the Strains

Saline extracts of mycelial material from 14 different strains of Aspergillus fumigatus showed haemolytic and toxic activities. These activities were present in filtrates obtained from mycelial material incubated at 20°C for 6, 15 and 30 days and at 37°C for 6 days. The haemolysin and toxin titers decreased with an increase in incubation time and at higher incubation temperatures.The haemolytic and toxic activities could be inactivated by heating the filtrates at 70°C for 10 min.The results of serological tests demonstrated immunological uniformity for the haemolytic and toxic factors.     

区分犬瘟热病毒Asia-Ⅰ型野毒株及疫苗株的AS-PCR方法

犬瘟热是一种接触性传染病,可侵害免疫系统、呼吸系统、消化系统,甚至神经系统,导致全身性的病理变化,对宠物犬、毛皮动物等存在巨大威胁。目前常用的胶体金检测法不能有效区分疫苗免疫与动物自然感染。为建立一种高效准确的鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的检测方法,本试验对从武汉地区收集已确诊犬瘟热的6只犬分离得到的野毒株以及3株广泛使用的CDV疫苗株进行全基因组测序,从氨基酸水平和碱基水平比对分析后,确定H基因为AS-PCR引物设计的靶基因。通过对H基因进行分型,发现武汉地区流行的CDV均为Asia-Ⅰ型,而疫苗株Y2为America-I型,疫苗株Y1和Y3均为America-Ⅱ型。对比179株Asia-Ⅰ型（6株野毒株样品+173株GenBank Asia-Ⅰ型）与3株疫苗株的CDV-H基因序列,采用AS-PCR技术（3'端错配）设计出1对能有效区分犬瘟热Asia-Ⅰ型野毒株和疫苗株的特异性引物,上游引物序列为5'-TTAAATGATAATGACATAGTG-3',下游引物序列为5'-CCTGGCAAGGCAAGA-3'。结果显示该引物有较强的特异性,6株样品野毒株均可扩增出长894 bp的片段,疫苗株不能扩增,且野毒株的H基因上存在9个较为规律的碱基（氨基酸）变异位点,而疫苗株在第277位氨基酸上均为天冬酰胺,这些变异可能导致N-糖基化位点的增加,从而对犬瘟热病毒疫苗株的毒力产生影响。本研究建立的AS-PCR方法能有效区分犬瘟热疫苗和Asia-Ⅰ型野毒株。     

The Establishment of AS-PCR Method to Distinguish Canine Distemper Asia-I Type Wild Strains and Vaccine Strains

Canine distemper (CD) is a contagious disease, which can damage the immune system, respiratory system, digestive system, and even nervous system, leading to systemic pathological changes, and has a huge threat to pet dogs, fur animals, etc. At present, the commonly used colloidal gold test cannot effectively distinguish vaccine immunity from animal natural infection. To establish an efficient and accurate detection method for identifying wild strains and vaccine strains of canine distemper virus(CDV), the whole genome of six canine distemper wild strains isolated from dogs and three widely used CDV vaccine strains collected from Wuhan area were sequenced. After comparing and analyzing the amino acid and the base sequences, the H gene was determined as the target gene for AS-PCR primer design. By genotyping the H gene, it was found that the prevalent CDVs in Wuhan were all Asia-Ⅰ, while the vaccine strain Y2 was America-I, and the vaccine strains Y1 and Y3 were both America-Ⅱ. Comparing the CDV-H gene sequences of 179 Asia-Ⅰtypes (6 wild-type strain samples + 173 GenBank Asia-Ⅰtype stains) and 3 vaccine strains, using AS-PCR technology (3'mismatch) to design a pair of primers. It can effectively distinguish CDV Asia-I wild strain and vaccine strain. The upstream primer sequence is 5'-TTAATATAATAATGACAGTG-3', and the downstream primer sequence is 5'-CCTCAAGGGGCACA-3'. The results showed that the primer had a strong specificity and the wild strains could amplify an 894 bp fragment, while the vaccine strains could not. There are 9 more regular bases (amino acids) variation sites in H gene of wild strain, and the 277th amino acids of all vaccine strains are Asparagine. These mutations may lead to an increase in N-glycosylation sites, which will have an impact on the virulence of canine distemper virus vaccine strains. The AS-PCR method established in this study can effectively distinguish the canine distemper vaccine and Asia-Ⅰwild strains.