海桐花苯丙氨酸解氨酶的基因克隆与序列分析

从海桐中克隆得到苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因cDNA片段,并命名为PitPAL,GenBank登录号为AY747678。PitPAL长866个bp,编码289个氨基酸。通过核苷酸和蛋白质序列多重比较发现PitPAL与其他植物的PAL基因高度同源。PitPAL编码的蛋白质序列包含与水稻、玉米PAL蛋白质相同的脱氨基位点和催化活性位点。PAL系统进化树表明PitPAL与乔木类植物(如夹竹桃、山茶)的PAL基因聚类关系最近。PitPAL基因的克隆为利用基因工程技术来调控海桐花青苷的合成代谢、以及海桐花的颜色调控提供了基因资源。     

核桃苯丙氨酸解氨酶的基因克隆与序列分析

利用1对兼并引物,从核桃(Juglans regia)中克隆得到苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因cDNA片段,并命名为JrPAL.GenBank登录号为AY747676.JrPAL长866bp,编码289个氨基酸.通过核苷酸和蛋白质序列多重比较,发现JrPAL与其他植物的PAL基因高度同源.JrPAL编码的蛋白质序列包含与水稻、玉米PAL蛋白质相同的脱氨基位点和催化活性住点.PAL系统进化树表明,JrPAL与乔木类植物的PAL基因聚类关系最近.克隆JrPAL,可为利用基因工程技术调控核桃黄酮化合物的代谢提供基因资源.     

5种植物花瓣ACS基因的克隆与分析

分析已发表的植物1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）合成酶（ACS）基因序列,设计一对简并引物,在随机选择的非洲菊、月季、桂花、茶梅和山茶等5种植物花瓣cDNA中进行PCR扩增．结果表明,在5种植物花瓣中都能扩增出约800bp的特异片段,登录GenBank发现均未被注册,因此将序列提交到GenBank并获得了序列号．在NCBI上进行Blast比对,发现所克隆的5个Acs基因均与其他植物花瓣的ACS基因有一定的序列相似性,最高达94％,最低为80％．将5个ACS基因的片段进行多序列比较分析,发现茶梅ACS基因与山茶ACS基因的序列差异最小,序列相似性达99％．本试验设计的ACS基因简并引物在植物中有一定的通用性,后续可以适当调整引物的简并度,以得到高通用性的简并引物．     

百合查尔酮合成酶(chs)基因的cDNA克隆与分析

根据报道的查尔酮合成酶基因的保守序列,设计了特异简并引物,以东方百合Sorbonne盛开的花瓣总RNA为模板,逆转录合成cDNA第一链,用特异引物对此双链cDNA进行PCR扩增,将扩增后的基因片段回收克隆后,送至上海博亚生物公司测序,目的序列长873bp,与已发表的百合中CHS基因的同源性达到91%,说明克隆的片段属于...     

2种PCR方法扩增大豆rbcS启动子5'侧翼序列比较

比较了扩增已知序列5’侧翼序列的2种PCR方法.方法一是反向PCR (IPCR),以大豆基因组酶切后的DNA片段自身环化产物做模板,用2对特异引物反向扩增大豆rbcS启动子5'侧翼序列.方法二是热不对称交错PCR(rAIL- PCR),以大豆基因组DNA为模板,用3个巢武特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR循环.IPCR和TAIL- PCR 2种试验方法分别扩增获得438 bp和867 bp特异产物.经测序发现:2片段两侧均含有设计的引物,其部分序列均与已知序列相一致,两者也有部分序列完全相同,但TAIL- PCR技术简单,重复性好,能够在短时间内获得目标片段,TAIL-PCR技术在克隆侧翼序列时优于IPCR.     

芒果PAL基因的克隆与序列分析

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase,PAL)是酚类物质合成的第一个酶,是催化苯丙烷类反应的第一酶。根据已经报道的PAL基因的序列设计兼并引物,采用3′RACE和5′RACE方法,克隆得到了芒果果实PAL基因的全长cDNA序列。该基因开放阅读框为2160 bp,编码719个氨基酸,分子重量为79.18 kD。对基因组扩增得到了2200 bp长度的片段分析发现,该基因未含有内含子序列。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与问荆、杉木、银杏等植物具有较近的亲缘关系。对不同芒果品种的PAL基因的表达进行分析发现,红色的贵妃品种中表达量较高,而绿色的桂七品种中表达量较低。     

山葡萄VaCBF1转录因子基因的克隆与表达分析

【目的】克隆山葡萄(Vitis amurensis)CBF1转录因子基因(VaCBF1),为其功能的深入研究及其在植物抗寒基因工程中的应用奠定基础。【方法】根据植物CBF基因AP2/EREBP保守区设计1对简并引物,利用PCR法从山葡萄cDNA中扩增VaCBF1基因的中间片段。再根据中间片段区域设计2对特异引物,采用反向PCR法扩增VaCBF1基因的5′端和3′端序列。将中间片段与5′端和3′端序列拼接后得到山葡萄VaCBF1基因的cDNA全长序列,据此设计1对特异引物,PCR扩增VaCBF1基因编码区的全长序列,并对其进行生物信息学分析。同时,利用荧光定量PCR分析山葡萄VaCBF1基因在不同逆境胁迫(干旱、低温、盐胁迫)下的表达情况。【结果】成功地从山葡萄中克隆得到VaCBF1基因cDNA全长序列,其长度为762bp,编码253个氨基酸,在GenBank注册号为DQ517296。同源性分析证实,VaCBF1属于CBF转录因子家族。荧光定量PCR分析发现,低温胁迫可以诱导山葡萄VaCBF1基因高表达,而该基因的表达不受盐及干旱处理诱导。【结论】首次从山葡萄中克隆了VaCBF1基因,并证实该基因参与了植物对低温胁迫的应答。     

7种植物花瓣ACO基因的克隆与分析

为获得通用的适用于植物花瓣ACO基因克隆与检测的引物,根据Genbank中收录的双子叶木本植物的ACO基因序列,设计1对简并引物,并用其对随机选择的7种植物(紫罗兰、多头菊、冬樱、迎春、云南杜鹃、垂丝海棠、山茶)的花瓣的RNA进行PCR扩增。结果发现：从7种植物花瓣中都能扩增出约800 bp的特异片段,登录Genbank发现均未被注册,将序列提交Genbank数据库,获得7种植物花瓣ACO基因的登录号(JX503067、JX503068、JX503069、JX503070、KC112390、KC112392、KC112393);在NCBI上进行blast比对,发现所克隆的7个ACO基因均与其他植物的ACO基因有一定的序列相似性,其中冬樱ACO基因与千叶桃花ACO基因同源性最高,为98%,迎春ACO基因与中华猕猴桃ACO6基因的同源性最低,为88%,将7个ACO基因的片段进行多序列比较分析,发现两两之间序列平均相似性为77%。     

菠菜性别相关的ISSR标记

菠菜为雌雄异株植物,用CTAB法提取其雌、雄株成株幼嫩叶片DNA,分别构建雌、雄株DNA池,以之为模板,用已优化的ISSR体系扩增,在74条ISSR引物中,I62扩增出一条约1 200bp雌性连锁标记,回收纯化该特异扩增片段,将其连接于pUCm-T载体,转化进大肠杆菌JM109菌株,并检测及测序。回收克隆和测序后发现该片段全长1 176bp,富含AT,AT占57.0%。根据测序结果设计1对25bp的特异引物将这个雌性连锁的ISSR标记转化为稳定性和特异性更好的SCAR标记。该特异引物对随机选取的雌雄菠菜单株进行PCR扩增,在雌株中均有1 176bp的特异条带,而雄株中均无。此特异条带的获得为菠菜性别相关基因的克隆奠定基础。     

小麦抗白粉病基因Pm23分子标记的初步鉴定

根据植物抗病基因的保守结构,合成7对特异引物,用感病品种Chanceller作对照,对12个含不同抗白粉病基因的小麦品系进行PCR分析,结果只有1对引物(3LR 3LF)在Pm23的载体品系中扩增出稳定的多态性片段,对该片段进行回收、克隆、测序,全长为253bp。经同源性分析发现,该特异性片段与大麦Ty3-gypsy类反转录转座子基因部分序列有87%的同源性,属于反转录转座子类标记。     

利用CODEHOP设计简并引物克隆镰刀菌果胶酶基因片段

利用CODEHOP(Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers)设计真菌果胶酶基因片段的简并引物,并对设计的多对引物进行筛选,比较了普通PCR和Touchdown-PCR(TD-PCR)程序的扩增效果,并对产物进行了测序、比对和分析。结果表明:利用CODEHOP设计简并引物可信性强,阳性率高,能够从供试菌株中获得与目的片段大小相近的产物。利用TD-PCR程序扩增比普通PCR扩增效果好。扩增产物序列BLASTX比对和分析结果表明,产物片段编码的氨基酸序列与镰刀菌属来源的果胶酶氨基酸片段相似性均超过90%,说明所扩增的序列即为镰刀菌果胶酶基因片段。     

聚合酶链式反应(PCR)技术检测牛奶中金黄色葡萄球菌

根据金黄色葡萄球菌特异性STAA-Aul基因序列,设计、合成了一对引物,运用聚合酶链式反应(PCR)技术从10头患有奶牛乳房炎的奶牛奶样中扩增得到8个大小为420 bp的DNA产物;阴性样品中未扩增到产物。测定了其中2个DNA片段的核酸序列,确定为金黄色葡萄球菌的STAA-Aul基因。     

大鲵致病性嗜水气单胞菌PCR诊断方法的建立

根据GenBank中致病性嗜水气单胞菌气溶素基因（hlyA）序列,设计1对特异性引物,通过对PCR反应条件进行优化,建立了检测大鲵致病性嗜水气单胞菌的PCR诊断方法。结果表明,扩增的阳性条带约为600 bp,特异性、敏感性结果显示,该PCR方法对致病性嗜水气单胞菌DNA的最低检测量为0.4 ng/L,而非致病性嗜水气单胞菌、大肠杆菌、黄杆菌、弗氏柠檬酸杆菌的扩增结果均为阴性。对123份大鲵病料进行检测,结果建立的PCR方法检测结果与细菌学和生化检验结果符合率为97.6%,表明该PCR方法能够对大鲵致病性嗜水气单胞菌样品进行快捷、灵敏、准确的检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp2基因缺失株RT-PCR检测方法的建立

为了快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) nsp2基因缺失流行株,在对不同PRRSV分离株nsp2基因核苷酸序列分析的基础上,设计了针对nsp2基因的1对兼并PCR引物和1条基因特异性反转录引物.RT-PCR试验结果表明,经典PRRSV S1毒株和高致病性nsp2缺失株SY0608毒株的PCR扩增片段的大小分别为768 bp和678 bp.特异性试验和敏感性试验证明,该检测方法特异性较好,但敏感性相对较低,可用于快速鉴别诊断PRRSV nsp2基因缺失毒株和经典PRRSV毒株.     

甘蔗宿根矮化病菌 ＰＣＲ检测体系的优化与应用

为建立能快速灵敏检测甘蔗宿根矮化病 （ｒａｔｏｏｎｓｔｕｎｉｎｇｄｉｓｅａｓｅ,ＲＳＤ）的 ＰＣＲ检测方法。本文通过改进模板 ＤＮＡ的制备方法,在 ＰＣＲ基本程序的基础上,以甘蔗宿根矮化病菌 （Ｌｅｉｆｓｏｎｉａｘｙｌｉｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｉ,Ｌｘｘ）１６Ｓ-２３ＳｒＤＮＡ基因间隔区特异性引物,调整 ＰＣＲ扩增反应体系各组分的浓度、反应的退火温度、循环参数等主要因子,优化 ＰＣＲ反应体系。此检测体系能从感染 ＲＳＤ的样品中扩增出大小为４３８ｂｐ的特异性片段,而阴性对照和未感染样品则未扩增出任何片断;未优化仅从稀释３０倍的蔗汁总 ＤＮＡ中扩增出 ＲＳＤ的特异性片段,优化后可以从稀释３０００倍的蔗汁总 ＤＮＡ中扩增出 ＲＳＤ的特异性片段。对３１份田间采集样品检测,未优化的阳性检出率为 ３２.２６％;优化后阳性检出率 ７４.１９％,与 Ｉ-ＥＬＩＳＡ检测结果一致。应用此检测方法可稳定、快速地检测出蔗株是否感染 ＲＳＤ,且检测效率高,适合于田间大批量样品快速检测。     

阿拉拉特小麦高分子量谷蛋白新基因1Gy的克隆及序列分析

利用y-型高分子量谷蛋白亚基的特异引物,对阿拉拉特小麦(PI427305)的基因组DNA进行PCR扩增,得到大小为2.2 kb的目的条带,将该条带回收纯化并克隆到pMD18-T载体中,经梯度亚克隆测序拼接,得到编码区的全序列为2 202 bp(GenBank登录号:HM131806),共编码732个氨基酸。它与1Gy7*序列的同源性高达99%,而且氨基酸序列结构与大多数y-型亚基相同,推断该基因为1Gy。1Gy的分子量比1Gy7*稍小,迁移率比1Gy7*慢。与小麦属其他基因组编码的y-型亚基相比,其在靠近C端的重复区多了一个半胱氨酸残基。利用在线PSIPRED对其二级结构预测结果显示,其重复区主要是无规则卷曲结构。这些结构都可能使得1Gy对小麦加工品质产生正面影响。