动物体细胞克隆机理的几个关键问题

克隆即clone的音译,来源于希腊文,表示用离体的细枝或小树枝增殖。动物克隆即动物的无性繁殖,就是将供体细胞核移人去核的卵母细胞中,使后者不经精子穿透等有性过程即可被激活、分裂并发育成个体,使得核供体的基因得到完全复制,也称为动物体细胞克隆。1997年2月,英国罗斯林研究所的Wilmut等人利用绵羊乳腺细胞进行核移植试验,获得了世界上第一头体细胞克隆绵羊-多利(Dolly),这一成果开创了哺乳动物核移植的新的里程碑。1998年,美国夏威夷大学等率先在小鼠上进行了成年体细胞的克隆。1998年,(Science)杂志报道了美国科学家用培养的携带外源基因的胎牛成纤维细胞作为供核获得4头转基因克隆牛。     

供体细胞对绵羊转基因体细胞克隆胚胎体外发育影响的研究

研究比较了转入不同外源基因、转同一基因的不同细胞克隆、供体细胞的培养代数及冷冻对转基因体细胞克隆羊重构胚体外发育的影响,旨在为进一步探寻建立供体细胞个性化准备方案,为提高动物克隆效率提供参考。结果表明,转不同外源基因的供体细胞对转基因体细胞克隆羊重构胚体外发育无影响;转同一基因的不同细胞克隆对转基因体细胞克隆羊重构胚体外发育有一定影响,且转TERT基因的不同克隆间的重构胚的融合率及囊胚率差异显著(P0.05)。随着供体细胞培养代数的增加,重构胚体外发育的桑葚胚率及囊胚率无显著影响,但融合率随着培养代数的增加有上升趋势,且差异显著(P0.05);供体细胞冷冻可促进其融合率、桑葚胚率及囊胚率。研究结果表明,供体细胞的不同克隆、培养代数、冷冻等因素对转基因效率有一定的影响。     

TSA处理供体细胞对组蛋白乙酰化和核重编程效果的影响

克隆胚胎基因组的不完全重编程是克隆动物成功率低的主要原因.试验中以第5代牛胎儿成纤维细胞作为供体核,以牛卵母细胞作为受体胞质进行体细胞核移植,用75 nmol·L-1曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)分别处理供体细胞6、12和24 h,通过核移植检测克隆胚胎发育率,并应用激光共聚焦显微镜技术和流式细胞术检测处理细胞和克隆囊胚组蛋白H3K18乙酰化水平和细胞周期.结果显示:随着TSA处理时间的延长,供体细胞组蛋白H3K18乙酰化水平不断提高;以75 nmot·L-1TSA处理供体细胞12 h的克隆胚的囊胚发育率显著高于未处理组(23.5%vs 15.7 %,P<0.05);供体细胞经TSA处理的克隆囊胚组蛋白H3K18乙酰化水平与未处理组相比差异不显著(P>0.5);处理组和对照组细胞G0/G1期和S期比例间存在显著差异(P<0.05).结论:TSA对核供体细胞的处理存在时间效应,75 nmol·L-1TSA处理12 h的牛胎儿成纤维细胞更易被卵母细胞重编程,显著提高了克隆胚的体外发育能力,初步证实TSA是通过提高供体细胞组蛋白乙酰化水平来促进供体细胞重编程的.     

体细胞克隆山羊"元元"肺的形态学观察

动物体细胞克隆是指由一个体细胞产生一个和亲代遗传基因一致、形态非常相像的动物。体细胞克隆已相继在牛、小鼠、山羊、猪、野牛、马、猫、大鼠等动物上取得成功。2000年6月中旬,西北农林科技大学生物工程研究所利用成年山羊耳部皮肤成纤维细胞作为核供体,获得两只体细胞克隆山羊——“元元”和“阳阳”。“元元”因呼吸衰竭仅存活36．05h。为了了解“元元”肺的发育情况,作者对“元元”的肺进行了肉眼、光镜和透射电镜观察。     

动物克隆技术研究的历史、现状与展望

动物克隆技术对于优良种畜的复制、减少实验用动物数目、动物遗传多样性保存及濒危动物挽救、转基因动物培育以及人类疾病的治疗都具有重要的意义。尽管早在1938年HansSpemann就已提出了胚胎细胞核移植的设想,但直到20世纪50和60年代才在两栖类和鱼类获得成功。而哺乳动物的胚胎细胞核移植起步更晚,直到20世纪80年代才开始有成功的报道。自1997年Wilmut等人培育出体细胞克隆绵羊Dolly以来,哺乳动物克隆技术有了迅速发展;先后获得了体细胞克隆小鼠、牛、山羊、猪、猫和兔,供核细胞的种类也在不断拓宽。然而,目前体细胞克隆的成功率还很低,一般只有1%～3%。一般认为,造成克隆成功率低的原因主要是供体核后成性基因程序再编不当。尽管最近的实验证明,端粒长度和X-染色体灭活等程序再编正常,但于配子发生期间形成的后成性信息(如配子基因印迹)在核移植之后并不能恢复。     

种公牛耳组织成纤维细胞的分离与培养

哺乳动物细胞培养始于20世纪50年代,发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法.近年来,体细胞克隆技术得到迅速发展,不同细胞类型供体的克隆动物相继产生.     

哺乳动物体细胞核移植的DNA甲基化重编程研究进展

DNA甲基化是基因组主要的表观遗传修饰方式之一.核移植重构胚在对供体细胞基因组进行甲基化重编程过程中会出现异常的甲基化模式,而异常的甲基化重编程是导致克隆胚早期死亡及克隆动物发育畸形的主要原因.论文针对体细胞克隆动物基因组DNA的甲基化模式、造成克隆胚胎甲基化异常的原因及异常甲基化对重构胚胎发育的影响等进行了综述.深入研究核移植重构胚甲基化重编程的机制,有助于完善核移植技术,提高克隆效率,使其更好地应用于基础研究和生产实践.     

DNA甲基化酶抑制剂对体细胞染色体的影响

在动物的体细胞克隆过程中,供体细胞的细胞核要由高度甲基化状态转变为胚胎细胞的非甲基化状态,从而实现全能性的重新获得。试验利用DNA甲基化酶（5-aza-dc）抑制剂处理供体细胞,尝试建立一种既不影响染色体结构和数目,又能降低供体细胞细胞核的甲基化状态的最适浓度和方法,从而提供一种提高体细胞克隆动物效率的方法。在试验中,用不同浓度的甲基化酶抑制剂（5-aza-dc）处理奶牛成纤维细胞72 h,通过常规染色体核型分析方法制备染色体分裂相,检测其染色体数目、结构等的改变,结果显示,低浓度的甲基化酶抑制剂（0.005和0.01 μmol/L）处理,染色体没有发生明显的畸变（P＞0.05）,染色体能够保持正常的形态,高浓度（0.03与0.05 μmol/L）处理导致染色体畸变率显著增加（P＜0.05）,而0.1 μmol/L的5-aza-dc处理后染色体畸形率增加更为明显（P＜0.01）。总之,此试验的结果说明在对供体细胞做甲基化处理时用0.005和0.01 μmol/L的5-aza-dc处理不会影响细胞染色体结构和数目,但是高浓度处理则会导致染色体畸变率显著增加,不能用于体细胞克隆动物生产。     

动物体细胞克隆研究概况

介绍了动物体细胞克隆技术的方法、研究现状，指出体细胞克隆动物虽然存在成功率低、死亡率高、生长发育不正常等缺陷，但在快速扩繁优良种畜和转基因动物、保护动物遗传资源、生产用于器官移植的克隆器官等方面有很大的应用潜力。     

体细胞克隆中核的重编程

尽管体细胞克隆在绵羊、牛、小鼠、猪、山羊、兔、猫、大鼠和骡子等物种中都获得了成功，但却未能得到狗和猕猴的克隆个体，而且克隆效率非常低，克隆效率低使体细胞克隆技术在科研和生物技术等方面的应用受到限制．供体核移入去核的卵细胞后，必须经过表观遗传修饰的重编程，回到胚胎开始发育的全能状态。目前认为：供体核的不完全重编程是导致克隆效率低的主要原因。本文从DNA甲基化、组蛋白乙酰化、X染色体失活、端粒、印记基因以及其他发育相关基因的表达几个方面来探讨影响克隆效率的因素。     

动物精原干细胞移植研究概况

精原干细胞移植技术是一种新兴的动物繁殖技术,可以提高雄性动物的生殖能力.该技术是从适龄雄性供体动物采集精原干细胞,注射入适龄受体动物的生精小管中使其产生精子的技术.精原干细胞移植首先在小鼠试验中获得成功,接着人们将这项技术应用到家畜等大中型动物中并获得成功.随着这项技术的不断深入研究,精原干细胞不但可以在同种间进行移植,而且在异种间的移植也获得成功.通过对培养体系的不断完善,筛选、移植方法的不断改进,可以获得更高的移植成功率.精原干细胞移植为提高优良品种家畜的生产效率、保护野生动物资源、转基因动物的生产及不育症的治疗提供了一种新的方法.     

Male Germ Cell Transplantation

Transplantation of male germ line stem cells from a donor animal to the testes of an infertile recipient was first described in 1994. Donor germ cells colonize the recipient's testis and produce donor-derived sperm, such that the recipient male can distribute the genetic material of the germ cell donor. Germ cell transplantation represents a functional reconstitution assay for male germ line stem cells and as such has vastly increased our ability to study the biology of stem cells in the testis and define phenotypes of infertility. First developed in rodents, the technique has now been used in a number of animal species, including domestic mammals, chicken and fish. There are three major applications for this technology in animals: first, to study fundamental aspects of male germ line stem cell biology and male fertility; second, to preserve the reproductive potential of genetically valuable individuals by male germ cell transplantation within or between species; third, to produce transgenic sperm by genetic manipulation of isolated germ line stem cells and subsequent transplantation. Transgenesis through the male germ line has tremendous potential in species in which embryonic stem cells are not available and somatic cell nuclear transfer has limited success. Therefore, transplantation of male germ cells is a uniquely valuable approach for the study, preservation and manipulation of male fertility in animals.     

精原干细胞移植在家畜生产中的应用

本文阐述了精原干细胞的分离纯化、冷冻保存、移植等一系列相关研究技术 ,同时围绕国内外最新研究进展展望了精原干细胞在家畜生产上的潜在应用     

羔羊超数排卵与胚胎体外生产技术研究进展

自从幼畜体外胚胎移植(JIVET)技术问世以来,因其在优秀种畜快繁、育种世代间隔缩短、遗传资源保护等方面具有广阔的应用前景,引起了很多科研机构的关注.为提高JIVET的生产效率,研究人员对该技术的多个环节进行了探索,但总体效率还不是很高.论文就羔羊超数排卵与胚胎体外生产技术实施中的关键环节,即羔羊超排供体的年龄、超排季...     

转基因动物研究进展

转基因动物技术始于 2 0世纪 80年代 ,近 3 0年来 ,随着研究的深入 ,转基因动物的制作技术得到了突破性的发展。最初的原核注射法是应用最普遍、最可靠、效果最稳定的一种方法。但该方法存在价格昂贵 ,整合率低及不能定点整合的问题 ,所以近几年来转基因动物技术已出现了胚胎干细胞法 ,精子载体法 ,体细胞核移植法和人工酵母染色体法等一系列新方法。随着这些技术的不断发展 ,转基因动物技术应用正以其突出的优越性指导着多个领域的工作。目前 ,它的应用已渗透到基础理论、疾病动物模型、人异种器官移植、制药、畜牧兽医等领域。转基因动物应用正走向产业化的道路 ,具有十分广阔的前景。但作为一个新兴的技术 ,转基因动物研究还面临着一些急需解决的问题     

The possibilities of practical application of transgenic mammalian species generated by somatic cell cloning in pharmacology, veterinary medicine and xenotransplantology

Cloning of genetically-modified mammals to produce: 1) novel animal bioreactors expressing human genes in rens, urinary bladder and the male accessory sex glands, as well as 2) porcine organs suitable in pig-to-human xenotransplantology, could offer new advantages for biomedical purposes. So too does the generation and/or multiplication of genetically-engineered cloned animals in order to produce: 3) physiologically-relevant animal models of serious monogenic human diseases and 4) prion disease-resistant small as well as large animals (i.e., rodents, ruminants). The basic purpose of this paper is to overview current knowledge deciphering the possibilities of using transgenic specimens created by somatic cell nuclear transfer in medical pharmacology, veterinary medicine, agriculture, transplantational medicine and immunology.     

养殖水体中氧化应激产生机理的研究进展

活性氧自由基是需氧生物不可避免的,过多自由基的积累会导致水产动物细胞损伤,甚至引起疾病。作者从水产动物活性氧自由基产生和消除的机制及水环境温度、溶氧、盐度、过渡金属离子浓度和农药导致水产动物氧化应激的机理2方面进行综述,为中国集约化水产养殖准确控制水环境变化及有效抵抗氧化应激方面工作提供参考。     

Development of New Stem Cell-based Technologies for Carnivore Reproduction Research

New reproductive technologies based on stem cells offer several potential benefits to carnivore species. For example, development of lines of embryonic stem cells in cats and dogs would allow for the generation of transgenic animal models, which could be used to advance both veterinary and human health. Techniques such as spermatogonial stem cell transplantation (SSCT) and testis xenografting offer new approaches to propagate genetically valuable individual males, even if they should die before producing sperm. These techniques might therefore have application to the conservation of endangered species of carnivores, as well as to biomedical research. Recently, our laboratory has successfully performed SSCT in the dog, with a recipient dog producing sperm of donor genetic origin. Testis xenografting has been used to produce sperm from pre-pubertal testis tissue from both cats and ferrets. These early steps reinforce the need not only for research on stem cell technologies, but also for additional research into complementary technologies of assisted reproduction in carnivores, so that the widest array of research and clinical benefits can be realized.     

Client donation program for acquiring dogs and cats to teach veterinary gross anatomy

A donor program for procuring dogs and cats to meet the needs of anatomical instruction was initiated six years ago at Tufts University School of Veterinary Medicine. The program was initiated in order to comply with state regulations that preclude the use of shelter animals and to satisfy ethical objections of students and faculty. The donor program has successfully met the animal needs for teaching gross anatomy and, in addition, provides opportunities to integrate clinical perspectives and ethics beginning from the first year of veterinary education.