蛋白激酶TaPiPK1在小麦抗条锈病反应中的功能分析

由条形柄锈菌小麦专化型Puccinia striiformis f. sp.tritici(Pst)引起的条锈病,长期严重威胁小麦安全生产。Pst通过毒性变异产生新毒性小种或致病类型,能克服生产上已应用的抗病基因,导致抗病品种感病。因此,挖掘抗条锈病基因资源对小麦抗病遗传改良和加快抗病新品种培育具有重要意义。蛋白激酶在应答病原菌侵染,传递植物免疫信号中发挥重要作用。本研究通过小麦转录组数据分析,筛选到参与应答Pst、小麦白粉菌Blumeria graminis f. sp.tritici和赤霉病菌Fusarium graminearum侵染的蛋白激酶基因TaPiPK1。该蛋白激酶基因编码551个氨基酸,C末端含有一个STK激酶结构域。利用RT-qPCR检测发现,TaPiPK1在小麦与条锈菌非亲和互作的前期上调表达;TaPiPK1主要定位于细胞质与细胞膜。利用大麦条纹花叶病毒介导的基因沉默技术(BSMV-VIGS)瞬时沉默TaPiPK1,显著降低小麦‘水源11’对条锈菌非亲和小种CYR23的抗性,表明TaPiPK1参与小麦抗条锈病反应并发挥重要作用。因此,TaPiPK1有可能作为潜在的基...     

小麦-条锈菌互作过程中TaRLK3D.2功能初步研究

小麦条锈病是由小麦条锈菌引起的气传性真菌病害,在全球小麦种植区广泛发生,严重威胁小麦的安全生产。充分利用寄主抗病性是防治条锈病最经济的方法。富含亮氨酸重复类受体蛋白激酶(leucine-rich repeat receptor-like protein kinase, LRR-RLK)作为RLK家族最大分支的模式识别受体,在防御病菌入侵方面发挥重要作用。本研究系统鉴定了小麦LRR-RLKs家族成员,从小麦与条锈菌互作的转录组数据库中筛选出了43个显著差异表达的LRR-RLKs,最后选取了在亲和与非亲和互作过程中都显著上调表达的TaRLK3D.2为对象,利用实时定量PCR、亚细胞定位及大麦条纹花叶病毒介导的基因沉默初步研究了该基因在小麦与条锈菌互作过程中的功能。结果表明TaRLK3D.2定位于植物细胞膜,瞬时沉默TaRLK3.2后,条锈菌侵染严重度显著下降,生长发育变慢。作为典型的LRR-RLKs家族成员,TaRLK3D.2在小麦条锈菌侵染过程中可能行使感病功能。本研究初步明确了该基因的功能,以该基因为靶标通过基因编辑或诱变获取稳定的功能缺失突变体可创制持久抗条锈病材料,为生产服务。     

小麦丙氨酸氨基转移酶基因TaAlaAT1的克隆及表达特征分析

 在已构建的受条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)诱导的小麦非亲和抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)文库中,筛选到1个与水稻丙氨酸氨基转移酶基因高度相似的表达序列标签(expressed sequence tag,EST),利用电子克隆与RT-PCR相结合的方法,从小麦中获得1个1563bp的cDNA序列,命名为TaAlaAT1。序列分析表明,TaAlaAT1包含1个完整的开放阅读框,长1440bp,推测编码479个氨基酸。该氨基酸序列具有氨基转移酶的保守特征,与水稻、葡萄、大豆、拟南芥、苜蓿等多种植物的丙氨酸氨基转移酶高度相似,其中与水稻的亲缘关系最近。半定量RT-PCR与实时定量PCR结果显示,TaAlaAT1在小麦与条锈菌互作的非亲和组合中总体呈上调表达,在亲和组合中呈下调表达,且在2个组合中的表达差异显著。推测TaAlaAT1参与了小麦对条锈菌的防御反应。     

小檗NPR1在小麦条锈菌侵染过程中的表达特征

小檗是小麦条锈菌的转主寄主,自然条件下在小檗上进行有性生殖不仅是条锈菌毒性变异的重要途径,也为病害的流行提供了初侵染源。目前条锈菌与小麦互作已经有较为细致深入的研究,而条锈菌与小檗分子互作的研究未见报道。NPR1是植物调控防卫反应的一个关键基因,本研究克隆得到小檗NPR1基因(BhNPR1),并对BhNPR1及其下游病程相关基因的表达模式进行了分析。与小麦NPR1基因受条锈菌夏孢子侵染诱导不同,BhNPR1的表达水平在条锈菌担孢子侵染小檗过程中保持稳定。另外,条锈菌侵染小檗过程中NPR1下游的病程相关基因BhPR5和BvPDF1.2a的表达量变化也不明显,而BhPR1和BhPR2则显著上调表达。这些结果表明BhNPR1及多个病程相关基因不参与对条锈菌的防卫反应,这可能是导致小檗先天免疫缺陷而成为多种锈菌共同的转主寄主。     

小檗公式在小麦条锈菌侵染过程中的表达特征

 小檗是小麦条锈菌的转主寄主,自然条件下在小檗上进行有性生殖不仅是条锈菌毒性变异的重要途径,也为病害的流行提供了初侵染源。目前条锈菌与小麦互作已经有较为细致深入的研究,而条锈菌与小檗分子互作的研究未见报道。NPR1是植物调控防卫反应的一个关键基因,本研究克隆得到小檗NPR1基因(BhNPR1),并对BhNPR1及其下游病程相关基因的表达模式进行了分析。与小麦NPR1基因受条锈菌夏孢子侵染诱导不同,BhNPR1的表达水平在条锈菌担孢子侵染小檗过程中保持稳定。另外,条锈菌侵染小檗过程中NPR1下游的病程相关基因BhPR5和BvPDF1.2a的表达量变化也不明显,而BhPR1和BhPR2则显著上调表达。这些结果表明BhNPR1及多个病程相关基因不参与对条锈菌的防卫反应,这可能是导致小檗先天免疫缺陷而成为多种锈菌共同的转主寄主。     

PstVosA1转录因子基因在调控小麦条锈菌耐高温反应中的生物学功能分析

 小麦条锈病是典型的冷凉生态区气传真菌病害,病原菌在越夏易变区(即秋季菌源基地)的越夏情况决定了冬季繁殖区条锈菌的初侵染菌源。小麦条锈病的发生流行极易受到温湿度关键气象因子的影响。近年来的调查研究发现,我国小麦条锈菌越夏海拔下限逐年下降,且越夏区范围进一步扩大,说明条锈菌耐高温胁迫能力增强,给未来小麦条锈病流行规律研究及制定防治策略带来了全新挑战。真菌特有的Velvet转录因子家族中VosA基因参与了真菌生长发育和次生代谢的调控,但关于该转录因子在条锈菌耐高温性中的作用却知之甚少。实时荧光定量PCR分析发现,温度敏感菌系蓬9和耐高温菌系A4在侵染寄主过程中PstVosA1基因均受高温胁迫诱导表达,但耐高温菌系PstVosA1相对表达水平明显高于温度敏感菌系蓬9。利用寄主诱导的基因沉默技术(HIGS)沉默小麦条锈菌耐高温菌系A4中的PstVosA1基因能显著降低在高温(21℃)接种条件下的平均发病严重度、孢子堆密度和生物量。研究结果说明PstVosA1基因正调控小麦条锈菌耐高温胁迫反应过程,增加该基因的表达水平,有利于增强小麦条锈菌耐高温性。     

利用BSMV Agro/LIC进行小麦条锈菌耐高温 相关基因功能分析的互作体系构建

为利用HIGS技术研究条锈菌耐高温胁迫相关基因的功能,需要构建小麦品种与条锈菌及大麦条纹花叶病毒Barley stripe mosaic virus(BSMV)亲和互作体系。本研究选用20个常温下(10℃)高感条锈病的小麦品种和22个耐高温条锈菌菌株,进行高温(21℃)条件下接种亲和性分析,发现11个品种高感条锈病、3个菌株耐高温性稳定且毒性谱较宽。在此基础上,利用含有小麦TaPDS基因片段的重组BSMV侵染上述候选小麦品种,确定‘Local Red'等6个品种与BSMV亲和程度符合试验要求。筛选出小麦品种‘Local Red'与菌株15335-2、15323-4等组成的最佳互作组合,适合利用BSMV Agro/LIC方法开展小麦条锈菌耐高温相关基因功能的研究。     

小麦锈菌蛋白激酶基因家族的鉴定与生物信息学分析

为深入分析锈菌结构基因组,阐明锈菌毒性变异的分子机制,本研究通过生物信息分析方法,对3种小麦锈菌蛋白激酶(protein kinases,PKs)超家族预测基因进行了系统分析,利用COG(clusters of orthologous groups of proteins)、KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)、GO(gene ontology)和PHI(pathogen-host interactions)数据库进行注释分析,并对小麦锈菌MAPK基因的蛋白质互作网络进行预测。结果表明,条锈菌Puccinia striiformis、叶锈菌P.triticina和秆锈菌P.graminis的PKs基因数量分别为221、159和159个,不同PKs基因家族类型在3种锈菌中的数量分布上表现出很高的保守性。注释分析表明,PKs家族预测功能涉及病原菌生长发育中的调控作用和病原菌-寄主互作机制,包括信号传导和致病因子等。PKs家族核心基因数目在蛋白激酶基因中占比大于1/3。MAPK基因的催化结构域序列呈现高度相似性。以STRING数据库的酿酒酵母蛋白质互作网络信息为参考,对小麦锈菌MAPK基因的蛋白质互作网络进行预测,共鉴定出25个互作关系,包含29个MAPK基因。研究表明这3种锈菌之间MAPK互作蛋白质分布不均衡,这可能反映了锈菌基因组进化的特殊复杂性。     

小麦叶锈菌与近等基因系TcLr41互作的组织病理学变化

为探讨小麦抗叶锈病机制,以小麦抗叶锈病近等基因系TcLr41和感病对照Thatcher为材料,利用荧光显微技术研究小麦叶锈菌与寄主互作的组织病理学变化.结果表明,在接菌24 h内亲和与非亲和反应过程之间差异不大,但在接种后36h仅在非亲和反应中出现早期的过敏性坏死反应,在接种后48h非亲和反应中进一步出现大量过敏性坏死反应,抑制了菌丝的生长,而在亲和互作的过程中始终未发现有过敏性坏死反应产生.     

外源茉莉酸甲酯诱导小麦抗条锈病的研究

 本文探讨了不同浓度茉莉酸甲酯(MeJA)对小麦抗病性的诱导作用,同时电镜观察了不同浓度MeJA对小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp. tritici)与寄主细胞超微结构的影响。结果表明,2.00 mmol·L^-1 MeJA对小麦条锈病的诱导抗性效果最好,可达到35.87%,而0.50 mmol·L^-1 MeJA在小麦条锈菌夏孢子开始萌发4 h时呈显著抑制作用。经外源MeJA处理后,条锈菌的胞间菌丝、吸器母细胞和吸器的发育明显受到抑制,其中侵染位点的叶肉细胞呈抗性症状。因此,MeJA可使小麦幼苗产生诱导抗性从而提高其抗病性。     

小麦条锈菌效应蛋白HASP2抑制寄主免疫反应

 由小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp. tritici,Pst)引起的小麦条锈病是小麦上的重要病害。研究小麦条锈菌在致病过程中分泌的毒性效应蛋白分子的功能,对揭示小麦条锈菌致病机理,进而研发病害防治新方法具有重要意义。前期在小麦条锈菌吸器转录组中筛选到一个高丰度表达的分泌蛋白基因HASP2。HASP2基因全长240 bp,其编码的蛋白质N端包含22_aa的信号肽,无跨膜区,无结构域。qRT-PCR显示HASP2在条锈菌CYR32侵染早期上调表达;农杆菌介导的烟草瞬时表达实验表明HASP2能够抑制由小鼠凋亡蛋白BAX诱导的烟草细胞坏死;利用细菌三型分泌系统(T3SS)将 HASP2在小麦中过表达,发现其可以抑制寄主PTI(PAMP-triggered immunity)相关胼胝质积累;同时对HASP2过表达的小麦接种无毒性菌系CYR23后,发现HASP2可以抑制寄主ETI(Effector-triggered immunity)相关活性氧积累和减少细胞坏死面积,但HASP2过表达对条锈菌的生长发育没有显著影响。     

条锈菌效应子Pst30抑制植物的胼胝质和活性氧积累

 条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f. sp. tritici,Pst)导致的小麦条锈病严重威胁着我国的小麦生产安全。解析病菌的致病机理,对开发病害防控技术与策略具有重要的指导意义。研究发现效应子是病菌重要的致病因子,揭示效应子调控寄主免疫机制可加深对病菌的认知。本课题组前期在全基因组筛选条锈菌效应子中获得了一个候选效应子基因Pst30,该基因所编码的蛋白N-端含有分泌肽,无明显功能结构域。qRT-PCR分析显示Pst30在条锈菌侵染小麦后12 h诱导表达,72 h诱导表达至高峰。利用农杆菌侵染在烟草中瞬时表达Pst30^ΔSP-GFP融合蛋白,发现Pst30^ΔSP定位在细胞质。在烟草中瞬时表达该效应子能够显著抑制Bax诱导的细胞坏死。利用细菌的Ⅲ型分泌系统在小麦中瞬时表达Pst30,能够抑制荧光假单胞杆菌引起的胼胝质积累,导致由无毒性条锈菌小种CYR23引起的小麦过敏性坏死面积和活性氧积累减少,菌丝面积和长度增加。推测小麦条锈菌效应子Pst30可抑制寄主植物的PTI(PAMP-triggered immunity, PTI)和ETI(Effectors-triggered immunity, ETI),促进自身的侵染。     

甘肃陇南感病小檗在小麦条锈病发生中起提供(初始)菌源作用的直接证据

 陇南是中国小麦条锈菌易变区、小麦条锈病的常发流行区和防治的关键地区。明确陇南小麦条锈菌转主寄主小檗在小麦条锈病发生中的作用,对阐释该地区小麦条锈菌新小种产生的来源和指导小麦条锈病的综合防控具有重要意义。本研究从陇南春季自然受锈菌侵染的堆花小檗及其邻近的小麦上分离获得小麦条锈菌菌系,19个来自发病小檗的单夏孢子堆菌系在中国小麦条锈菌鉴别寄主上产生5个不同毒力类型VP1~VP5,均为新小种;在近等基因系和载体品种组成的鉴别寄主上产生17个不同毒力类型。29个来自邻近发病小檗的小麦上条锈菌菌系在中国小麦条锈菌鉴别寄主上产生了10个不同的毒力类型VP1~VP10,均为新小种;在近等基因系和载体品种组成的鉴别寄主上产生了24个不同的毒力类型。两个小麦条锈菌群体享有共同的毒力类型VP1~VP5,同时来自发病小檗上菌系的一些毒力类型不同于小麦上的毒力类型。主坐标分析(PCoA)和毒性表型聚类分析表明来自于自然受锈菌侵染小檗及其邻近小麦上的小麦条锈菌存在菌源交流。综合研究表明在自然条件下,陇南小麦条锈菌在野生感病小檗上进行有性生殖是常年发生的,感病小檗在新小种产生和在陇南小麦条锈病的发生中起提供菌源的作用。因此,在陇南小麦条锈病的综合治理策略上加强对小檗的处理,降低新小种产生速率和品种抗性丧失速率,从而延长品种使用年限,同时减少新小种向东部广大麦区传播,保障小麦生产安全。     

陕西省115个小麦品种(系)抗条锈病基因的分子检测

 为掌握陕西省主栽与后备小麦品种对我国条锈菌的抗性水平,明确其抗锈基因分布,本研究选用条锈菌流行小种CYR32和新毒性小种V26对115份陕西省主栽和后备小麦品种(系)进行苗期抗病性鉴定,并分别利用抗条锈病基因Yr5、Yr9(1B/1R)、Yr10、Yr18和Yr26的紧密连锁分子标记对这115份材料进行了分子检测。结果表明,供试小麦品种(系)中,抗CYR32的有61份,占53.04%;抗V26的有84份,占73.04%;对2个小种均抗病的有50份,占43.48%。分子检测发现115份材料均不含有Yr10;可能携带Yr9基因的有41份,占35.65%;可能含有Yr5、Yr18和Yr26的材料分别为3份、3份和2份,占2.61%、2.61%和1.74%。因此,当前陕西省主栽与后备小麦品种(系)对CYR32和V26的抗性整体水平还有待进一步提高,Yr9分布频率较高,而Yr5、Yr10、Yr18和Yr26分布频率较低,建议在以后小麦育种中减少Yr9的使用,加强利用Yr5和Yr18与其他有效基因聚合培育持久抗条锈病品种。     

普通小麦-华山新麦草易位系H9015-17抗条锈病基因的标记定位

 采用我国当前流行的小麦条锈菌小种和重要致病类型, 在常温条件下对普通小麦-华山新麦草易位系H9015-17进行苗期抗条锈性鉴定, 并用当前主要流行小种CYR32对H9015-17与铭贤169的杂交后代及其双亲进行抗条锈性遗传分析, 以揭示H9015-17抗条锈性遗传基础。结果显示, H9015-17对小麦条锈菌小种CYR31、CYR32、CYR33和致病类型Su11-4、Su11-7、V26、Su11-11均有良好的抗病性, 对当前主要流行小种CYR32的抗病性由1对显性基因控制, 暂命名为YrHua1。 采用分子标记定位技术,筛选到5个与抗病基因YrHua1连锁的RGAP标记(M1、M2、M3、M4和M5)和1个SSR标记(Xgwm292),这些标记与抗病基因YrHua1的遗传距离分别为17.3、15.7、13.1、3.3、2.9和11.2,并将基因YrHua1定位在小麦染色体5DL上。研究结果将为分子标记辅助选择改良小麦抗条锈性提供宝贵的种质材料,建议在抗病育种加以利用。     

源自陕、甘野生小檗的小麦条锈菌有性生殖后代的毒性分析

 小麦条锈病是我国最具毁灭性的小麦病害之一,其流行常常造成小麦严重减产。种植抗病品种是防治该病害最经济、有效和环保的措施。但是,由于新毒性菌系的出现,抗病品种在种植短短数年内便“丧失”其抗病性。研究证实病原菌毒性变异产生新菌系是导致小麦品种抗病性“丧失”的根本原因。近年来,随着小麦条锈菌转主寄主小檗的确定,发现自然条件下我国小麦条锈菌在野生小檗上可以完成有性生殖。本研究通过对2015年自然发病小檗小麦条锈菌的分离及其单夏孢子堆纯化,利用中国鉴别寄主进行了毒性测定分析。从陕西、甘肃两省的3种感病小檗共分离获得小麦条锈菌菌系8个,其中有1个菌系与已知小种Su11-126的毒性完全匹配,其余7个为新菌系;93个单夏孢子堆群体可分为47个不同的致病类型,包括14个已知小种类型,33个新小种类型;有56个菌系与已知小种的毒性完全匹配,37个为新小种。本研究再次获得了条锈菌自然条件下存在有性生殖并因此导致新菌系产生的证据,证实了野生小檗在我国小麦条锈菌的生活史和病害循环中具有作用。     

林芝地区小麦条锈菌转主寄主小檗的鉴定与分布

西藏自治区是我国小麦条锈病发生与流行相对独立的一个区系,小麦条锈病是严重影响西藏小麦安全生产的重要病害之一,林芝地区是西藏自治区小麦条锈病重要的常发区和流行区。已有研究证实,小檗是小麦条锈菌的转主寄主之一,并在我国小麦条锈菌致病性变异产生新菌系和小麦条锈病的发生过程中起作用。林芝地区小檗种类较多,但目前对林芝地区小檗是否能作为小麦条锈菌的转主寄主缺乏相关的研究和报道。本文针对小麦条锈病常发区的西藏林芝地区小檗资源进行了调查,对小檗能否作为小麦条锈菌转主寄主进行了鉴定。结果表明6种小檗在林芝地区常见且分布广泛,均是小麦条锈菌的转主寄主。这对进一步研究西藏小麦条锈病的发生、流行与病原菌致变性变异起着重要作用。     

2002—2014年陕西省小麦条锈菌生理小种变化动态和小麦品种(系)的抗病性

为明确陕西省小麦条锈菌的群体结构、变异动态和新育成小麦品种(系)的抗病性,为病害流行预测、防治以及抗病育种提供依据,本研究于2002—2014年从陕西省8个市(区)的28个县(区)和毗邻的甘肃省、四川省和湖北省部分地区共采集鉴定小麦条锈菌标样2 779份,监测到条锈菌生理小种和致病类型45个,其中,CYR33和CYR32为目前陕西省小麦条锈菌主要流行小种,新致病类型G22-9和G22-14虽然目前出现频率不高,但对贵农系列、92R系列以及Moro均有毒性,且出现频率呈上升趋势。目前小麦条锈菌群体中Hybrid46致病类群和水源11致病类群占绝对优势,这与我国小麦品种抗病基因单一化有较大关系,应加强开发和利用新的、多元化的抗源材料。对2 952份陕西省新育成小麦品种(系)抗病性测试结果表明,其整体抗性水平呈上升趋势。综合条锈菌生理小种监测和抗病性分析结果,目前小麦抗条锈病育种应以抗CYR33和CYR32为主,同时注意对G22-9和G22-14的抗病性研究。