布鲁氏菌病补体结合酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒敏感性和特异性评价

为评价布鲁氏菌病补体结合酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒（ CF-ELISA试剂盒）的敏感性、特异性及与其他试剂盒的符合率,用CF-ELISA试剂盒对布病感染地区牛、羊血清各200份,布病净化地区牛、羊群血清各100份进行抗体检测,同时与其他商品化检测试剂进行了比较。结果表明,感染地区牛、羊血清抗体的McNemar检验结果表明CF-ELISA试剂盒与间接酶联免疫吸附试验（ iELISA）试剂盒和CGS的敏感性和特异性差异均不显著（ P＞0．05）,Kappa一致性检验分析结果表明,CF-ELISA试剂盒与iELISA试剂盒检测结果有高度的符合性。检测净化地区牛、羊群血清抗体产品间的特异性和符合率均为100％。     

几种布鲁氏菌病血清学诊断方法的比较研究

疑似布病感染的牛场采集牛奶和全血进行细菌分离,采集血清用虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)、iELISA、cELISA进行抗体检测;采集免疫牛场和部分免疫羊场血清430份进行国内4个厂家生产的RBT抗原比对实验,并且选择特异性最高厂家的RBT抗原与SAT、iELISA和cELISA同时进行抗体检测。结果表明4个厂家生产的RBT抗原检测结果的一致性较差,RBT和SAT与加拿大布病参考实验室提供的iELISA和cELISA试剂盒检测结果相比一致率较高,但前两者均有较高的假阳性和假阴性。通过对比试验得出:在布病检疫时可选择特异性好的RBT抗原进行初筛,阳性结果用iELISA或cELISA进行确诊。     

牛羊布鲁氏菌cELISA与RBT、SAT检测方法比较

为比较牛羊布鲁氏菌竞争酶联免疫吸附试验(cELISA)与其他免疫学方法检测的一致性,使用2种国产布鲁氏菌cELISA试剂盒以及虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)方法,对采集自山东省日照市的122份牛羊血清样品分别开展布鲁氏菌抗体检测,比较2种cELISA试剂盒与RBT、SAT检测符合率和Kappa值。结果显示,2种cELISA试剂盒与RBT、SAT的符合率均在82%以上,Kappa值均大于0.61。结果表明,2种国产cELISA试剂盒适于牛羊布鲁氏菌净化检测。本文为牛羊布鲁氏菌血清学检测方法的选择应用提供了参考。     

口蹄疫病毒A型竞争ELISA抗体检测试剂盒在流行病学调查中的应用

为评价口蹄疫病毒A型竞争ELISA(cELISA)抗体检测试剂盒在流行病学调查中的应用前景,对2017年从福建省三明市采集的336份黄牛、奶牛、羊和猪血清样品,用A型cELISA抗体检测试剂盒进行抗体检测。结果显示,92份黄牛血清、92份羊血清、92份猪血清、60份奶牛血清的A型抗体阳性率分别为13.04%、11.96%、20.65%、86.67%。从上述4种血清中,各挑选10份血清(阴性、阳性各5份)共40份,采用口蹄疫病毒液相阻断ELISA(LPB-ELISA)抗体检测试剂盒进行验证。结果显示:cELISA检测为阳性的20份血清中,用LPB-ELISA检出阳性19份;cELISA检测为阴性的20份血清中,用LPB-ELISA检出阴性17份;两种方法的κ值为0.8,总符合率为90.00%。结果表明,A型cELISA试剂盒与LPB-ELISA试剂盒的符合率和一致性均较高,可用于口蹄疫流行病学调查和血清学监测。     

几种布鲁氏菌病检测方法比对结果分析

为比较几种常用布鲁氏菌病(简称布病)检测方法特性,在某疫苗免疫的奶牛场随机选取40头奶牛,采集血清和奶样各40份,然后对采集的血清进行虎红平板凝集、试管凝集、胶体金、酶联免疫吸附试验(iELISA和cELISA)和琼脂扩散方法检测,对采集的奶样进行病原学检测(qPCR)和抗体检测(胶体金)。结果显示:4种国标方法(虎红平板凝集、试管凝集、iELISA和cELISA)检出的阳性样品数量有较大差距,分别为16、6、23和33份,其中经试管凝集试验检出的阳性血清,经其他3种国标方法也检测为阳性;通过胶体金法检出阳性血清数(9份)略高于试管凝集试验,且血清及牛奶样品经胶体金检测结果基本一致;琼扩法检出12份阳性血清,且显示抽检奶牛中存在野毒感染;qPCR和胶体金试纸条对采集奶样的检测结果有较大差距,经qPCR检测仅1份样品呈阳性。结果表明:国标方法中,试管凝集试验特异性最高,iELISA和cELISA敏感性较高;病原学检测临床样品检出率较低,琼脂扩散试验敏感性有限,胶体金法敏感性适中,操作简便,适合布病免疫奶牛场自检。本研究为牛场布病不同检测目的方法选择提供了参考。     

某地区羊布鲁氏菌病血清学调查与4种血清学检测方法的比较应用

为更好地开展羊布鲁氏菌病防控技术指导,对某地20家养羊场、户采集羊血样328份,同时应用虎红平板凝集试验与胶体金检测卡进行初步检测,并将上述2种方法初检为阳性的样品与随机选取的阴性样品共计60份,分别应用试管凝集试验及cELISA进行确诊。结果显示,虎红平板凝集试验、胶体金检测卡、试管凝集试验与cELISA方法检测结果的总符合率分别为97.0%、98.3%和98.3%,该地区个体阳性率0.91%,群体阳性率10.0%。在此基础上,应用布鲁氏菌病国家标准阳性血清对4种方法的敏感性进行了测定,结果显示,cELISA检测方法敏感性最高,其次为试管凝集试验与胶体金快速检测卡。综上得出,胶体金检测方法既可以作为布病血清学检测的初筛试验,也可以与cELISA检测方法共同用作布病血清学检测的复核试验。     

两种虎红平板凝集试验检测羊布鲁氏菌病效果比较

为比较常规和改良虎红平板凝集试验（RBPT）的羊布鲁氏菌病检测效果,对239份免疫、非免疫场绵羊和阴性绵羊血清进行检测,并通过竞争ELISA试验（cELISA）和试管凝集试验（SAT）进行确诊。结果显示：常规RBPT检测非免疫血清的敏感性为68.85%,特异性为93.55%,与cELISA的符合率为77.17%;检测免疫羊血清的敏感性为75.81%,特异性为73.33%,与cELISA的符合率为75.00%。改良RBPT检测非免疫羊血清的敏感性为91.80%,特异性为70.97%,与cELISA的符合率为84.78%;检测免疫羊血清的敏感性为98.39%,特异性为10%,与cELISA的符合率为69.57%。两种RBPT和cELISA的阴性血清检测结果全部为阴性,符合率为100%。结果表明：改良RBPT法的敏感性要高于常规RBPT法,可以在阳性羊群中筛选到更多抗体效价较低的早期感染动物。但其特异性有一定程度的降低,必须结合SAT、cELISA等特异性高的方法进行确诊。本研究为羊布鲁氏菌病检测方法的选择提供了参考。     

羊布氏菌病iiELISA抗体检测方法的建立及应用

建立了以布鲁氏菌脂多糖(LPS)为抗原,用于检测羊布鲁氏菌IgG抗体的间接酶联免疫吸附试验(iELISA)方法,并对该方法的敏感性、特异性、重复性、稳定性、符合率进行了评价.结果表明,iELISA比SAT和RBPT的敏感性高60 ～ 150倍;该方法特异性强,可有效区分布鲁氏菌与大肠杆菌O157和都柏林沙门氏菌的IgG抗体,但尚无法与小肠结肠炎耶尔森菌O9的IgG抗体相区分;批间重复性试验和批内重复性试验变异系数分别为1.1％～9.8％,2.9％ ～9.8％,表明该方法具有良好的可重复性;保存期试验显示包被好的酶标板在4℃保存11个月,检测结果稳定.iELISA和RBPT检测385份来自不同地区的血清结果表明,阳性符合率为95.14％,阴性符合率为96.28％,对1932份临床血清样本的检测结果与RBPT比较,总符合率为91.7％,证明此方法可以应用于临床羊布鲁氏菌病的筛查.     

牛布鲁氏菌病间接ELISA检测方法的建立及应用

为建立牛布鲁氏菌病血清学诊断方法,本研究以牛种布鲁氏菌B. abortus2308基因组为模板,PCR扩增其HSP70基因,构建重组表达质粒pET32a-HSP70,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达并纯化,SDS-PAGE结果显示,得到重组HSP70蛋白,HSP70主要以包涵体形式表达。经条件优化建立以该蛋白为包被抗原的间接ELISA(iELISA)方法,结果显示,iELISA最佳反应条件为:抗原HSP70包被浓度为0.2μg/孔,血清稀释度为1200,封闭液为5%脱脂奶粉,兔抗牛IgG-HRP稀释度为14 000,显色10 min;该iELISA方法的临界值为0.186。特异性试验结果显示,除布鲁氏菌病阳性血清外,该iELISA与IBR、BVD和FMD阳性血清无明显交叉反应;敏感性试验结果显示,血清1400稀释时仍能有效检出布鲁氏菌;重复性试验结果显示。批内批间变异系数均小于10%,重复性好。利用本实验建立的iELISA方法与传统的虎红凝集和试管凝集试验同时对血清样品进行检测,比分析检测结果,结果显示该iELISA方法与其它两者符合率较高。利用本方法对秦皇岛未进行布鲁氏菌病免疫的规模化肉牛养殖场血清样品进行检测,布病抗体阳性率为2.5%。本研究建立的iELISA为牛布鲁氏菌病的血清学诊断提供了可行方法。     

布鲁氏菌病不同血清学检测方法结果分析

[目的] 为了确定不同布病检测方法在临床应用中的意义。[方法] 对疑似感染布鲁氏菌病羊血清同时作虎红平板凝集实验（RBT）、试管凝集实验（SAT）、ELISA抗体检测（cELISA）检测,分析它们的Kappa值、符合率、敏感度和特异性等。[结果] 数据显示三者符合度较高,Kappa值在0.76以上,一致性相当可靠,其中RBT敏感度高,但假阳性率也高,相比SAT结果,cELISA敏感度和特异性都高,且两者Kappa值达到了0.85,综合判断临床工作中cELISA更适合确诊诊断。     

补体结合酶联免疫吸附试验方法的建立

为改进免疫学诊断技术的准确性,研究了一种基于补体结合的免疫学检测新技术———补体结合酶联免疫吸附试验（CF-ELISA）。CF-ELISA技术采用酶标记抗菊糖纯化豚鼠补体C3抗体及其酶显色系统作为补体参与反应的指示系统,用ELISA方法进行补体结合试验。经对布氏菌病抗体检测的初步试验结果显示,CF-ELISA技术可检测到0.01 IU的布氏菌病抗体,灵敏度与间接酶联免疫吸附试验（iELISA）相当,是虎红平板凝集试验（RBPT）试管凝集试验（SAT）的5 000倍、补体结合试验（CFT）的10 000倍。对349份确诊布氏菌病感染群牛、羊血清的检测结果显示,CF-ELISAi、ELISA、CFT、SAT、RBPT的阳性率分别为35.82%3、6.39%、31.81%、30.09%、36.1%,CF-ELISA与iELISA、CFT、SAT、RBPT的阳性符合率分别为：98.4%、88.8%、80.0%、90.6%。CF-ELISAi、ELISA、CFT、SAT、RBPT对490份布氏菌病阴性群牛、羊血清的阴性率分别为100%、99.6%、100%、99.4%、99.8%,CF-ELISA与iELISA、CFT、SAT、RBPT的阴性符合率分别为：99.6%1、00%、99.4%、99.8%。研究表明,CF-ELISA是具有高特异性和高敏感性的布氏菌病免疫学检测技术。     

牛副流感病毒3型抗体间接ELISA检测方法的建立与初步应用

旨在建立牛副流感病毒3型(BPIV3)抗体间接ELISA检测方法。克隆NP-HN截短串联基因并构建原核表达载体pET28a(+)-NP-HN,诱导纯化NP-HN重组蛋白作为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立BPIV3抗体间接ELISA检测方法,进一步与病毒中和试验和进口ELISA试剂盒进行比较,应用本方法对270份临床血清样本进行了检测。结果表明,表达的NP-HN重组蛋白大小为44ku,具有良好的反应原性,建立的ELISA检测方法特异性强,与牛的主要呼吸道病原如牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等均无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数小于8%,与病毒中和试验和进口商品化ELISA试剂盒的总符合率分别为96.67%和98.89%。对采自山东、辽宁和天津的270份临床血清样本检测后总的阳性率为82.59%(223/270)。建立的BPIV3抗体间接ELISA方法具有较好的特异性和敏感性,可应用于BPIV3的流行病学调查和抗体检测研究。     

非洲猪瘟病毒抗体检测间接ELISA方法的建立

以基因工程表达的非洲猪瘟病毒VP73蛋白作为包被抗原,建立了间接ELISA方法,用以检测猪血清中抗非洲猪瘟VP73蛋白的抗体。该方法对非洲猪瘟标准阳性血清的检测灵敏度可以达到1∶2 560,与同类进口ELISA试剂盒相当。此方法只特异性检出非洲猪瘟阳性血清,而对猪传染性胸膜肺炎等5种猪传染病阳性血清的检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性。批内和批间重复性试验结果发现,检测同一份血清的变异系数小于10%,表明其重复性较好。包被好的酶标板37℃放置5d后,对同一份血清的检测敏感性无明显变化,初步表明其稳定性较好。利用建立的间接ELISA方法和进口ELISA试剂盒分别对150份血清样品进行非洲猪瘟血清抗体检测,结果表明本方法的特异性和敏感性分别为99.1%和94.3%,2种方法检测结果的符合率为98%。以上试验表明,本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性、较好的重复性和稳定性,可以满足临床检测的需求。     

基于H蛋白表位合成肽的小反刍兽疫病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

本研究旨在建立针对小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV）H蛋白抗体的iELISA检测方法。以筛选的H蛋白B细胞表位为基础,选择反应原性较好的4个抗原表位肽串联后合成作为包被抗原,优化各步反应条件及筛选各种缓冲液,并确定检测临界值。经优化后,多表位抗原肽的最佳包被量为1.5×10^-6 μg·孔^-1,血清临界稀释度为1：100,酶标二抗最佳稀释度为1：80 000;包被液为碳酸氢盐缓冲液,血清和二抗稀释液均为PBST溶液,封闭液为2% BSA溶液;阴、阳性临界值为0.25。不同血清的检测结果表明,批内及批间检测结果变异系数均小于10%,证明该方法具有良好的稳定性;对羊痘、口蹄疫、蓝舌病阳性血清的检测均为阴性,说明该方法具有良好的特异性;与ID-Vet公司的cELISA试剂盒对306份临床血清平行检测,两者相对符合率为92.81%。该研究所建立的PPRV H蛋白抗体iELISA检测方法特异、稳定、敏感,操作比cELISA简便快捷,省时省力,可用于临床小反刍兽疫抗体检测。     

A comparative assessment of culture and serology in the diagnosis of brucellosis in dairy cattle

To investigate the usefulness of culture for the confirmation of brucellosis in cattle, a comparison of culture and serology was undertaken on 248 animals in four dairy herds where the disease was active. Paired supramammary (SM), retropharyngeal (RP), and internal iliac (IL) lymph nodes were cultured, and five serological tests were deployed: the microserum agglutination test (MSAT), complement fixation test (CFT), the indirect (iELISA) and competitive ELISA, and the fluorescence polarisation assay (FPA). Brucella abortus was isolated from 86.8% of animals on combined culture of all three lymph nodes. Individually, the highest isolation rate was from the RP (90.5% of culture positives). Of culture positive animals, 13.7% and 6.2% were positive from the RP and SM alone, respectively.Approximately half of the positive cultures yielded <10 colonies/culture plate. Although 80.9% of animals were positive in at least one serological test, only 45.2% were positive in all five. For culture-positive animals, the MSAT was the most sensitive test (71.8%). Of the culture-negative animals 67.7% were positive in at least one test, while 12.9% were positive in all five. Titres were higher in animals culture-positive from the SM, and there was a direct correlation between higher titres and higher colony counts in SM cultures. Only 8.9% of animals were both culture-negative and seropositive (in at least one test), while 16.5% were culture-positive and seronegative in all five tests. The results highlight and validate the sensitivity of bacteriological culture in confirming a diagnosis of bovine brucellosis. While the MSAT and FPA were the most sensitive serological tests, a significant percentage of infected animals were undetectable using these standard serological assays.     

Detection of antibodies against Anaplasma marginale in milk using a recombinant MSP5 indirect ELISA

An indirect enzyme linked immunosorbent assay (iELISA) for diagnosis of anaplasmosis using undiluted individual milk samples from dairy cows was developed. The recombinant 19 kDa major surface protein 5 (rMSP5) of Anaplasma marginale was used as antigen. A monoclonal antibody against bovine IgG1 conjugated with peroxidase and the chromogen 3,5,3',5'-tetramethylbenzidine were used in the test. Strong and weak, positive and negative milk samples were set up as reference controls. Results were expressed as percentage of positivity (PP) contrasting with the strongest positive control. The test was evaluated in two groups (G1 and G2) of lactating dairy cows from herds located in A. marginale non-endemic areas of Argentina. The infection status of both groups, G1 (n=128) sampled after anaplasmosis outbreak, and G2 (n=216) free of anaplasmosis was established by polymerase chain reaction (PCR). Serum samples of cows from G1 and G2 were analyzed by card agglutination test (CAT) and competitive ELISA (cELISA), while the novel iELISA was evaluated in their corresponding milk samples. At a cutoff of 42 PP, the ELISA has 98% sensitivity and 95% specificity. A significant difference (P<0.0001) was found between the mean PP value of negative samples from G1 (17.4+/-14.9), and G2 (8.6+/-7.1). The agreement and kappa (kappa) value between iELISA and PCR was 96%, kappa=0.919; between iELISA and CAT was 97%, kappa=0.880; and between iELISA and cELISA was 97%, kappa=0.899. These results strongly support the usefulness of iELISA to detect A. marginale antibodies in milk. Additional studies are necessary to define the ability of the milk iELISA to detect not only acutely infected, but also carrier cattle.     

Assessment of milk ring test and some serological tests in the detection of <Emphasis Type="Italic">Brucella melitensis</Emphasis> in Syrian female sheep

Brucella melitensis infection prevalence among Syrian female sheep, to evaluate a number of serological tests and to discuss some epidemiological aspects of brucellosis, was studied. A total of 2,580 unvaccinated Syrian female sheep sera samples were tested for B. melitensis antibodies detection using four serological methods: the Rose Bengal test (RBT), the serum agglutination test (SAT), the complement fixation test (CFT) and an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (iELISA). In addition, 2,375 milk samples were collected, then milk ring test (MRT) and bacterial isolation test were employed to evaluate the natural organism shedding. The samples were considered positive in 66%, 64%, and 60% when we employed the RBT, SAT, and iELISA tests, respectively. Whereas, the CFT test revealed the smallest number of positive samples. By using the MRT, the total prevalence of brucellosis was nearly 38% of samples. A large variation was observed concerning the studied areas, ranging from 24% in Tartous to 44% in both Damascus and Damascus rural areas. Brucella was isolated from only 677 samples out of the 2,375 female sheep milk samples.