小鼠MSTN shRNA设计及其活性检测

根据小鼠肌肉生长抑制素(MSTN)mRNA序列设计4对shRNA序列,通过退火连接到shRNA过表达载体pGPU6/GFP/Neo,构建相应的过表达载体pGPU6/GFP/Neo-MSTN shRNA。转染C2C12细胞后,利用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)及Western blot试验对shRNA基因沉默后MSTN mRNA及蛋白的表达水平进行检测。结果表明:设计并构建的4个MSTN shRNA过表达载体,在细胞水平都能有效降低MSTN mRNA及蛋白的表达水平,其中转染pGPU6/GFP/Neo-MSTN714载体细胞组基因沉默效率最高,MSTN mRNA和蛋白表达分别下降72%、74%,差异极显著(P0.01)。该研究成功设计了4个MSTN shRNA序列并构建了相应的高效表达载体,为后续通过调控MSTN表达研究其在肌肉发育中功能奠定基础。     

基于Tet-on系统的RFP基因表达载体构建及功能验证

【目的】构建四环素诱导表达调控系统的表达载体,并对其功能进行验证。【方法】利用pTRE-tight和pdsred-Express2-N1构建带有红色荧光蛋白(red fluorescence protein,RFP)基因的载体pTRE-DSred,用其与另一载体pTet-on共转染293T细胞,并加入不同质量浓度(0,0.1,1,10μg/mL)的强力霉素(doxycycline,DOX)诱导,以未经质粒转染的293T细胞为对照组,在荧光显微镜下观察RFP基因的表达情况。【结果】成功构建了pTRE-DSred重组质粒,将其与pTet-on质粒共转染293T细胞,在细胞培养液中分别添加0.1,1,10μg/mL DOX,48h后均有红色荧光蛋白的表达,但10μg/mL DOX组红色荧光蛋白的表达水平明显低于前2个组;0μg/mL DOX诱导组中也有红色荧光蛋白表达,但水平极低;在未转染质粒对照组中未观察到红色荧光蛋白的表达。RT-PCR结果显示,pTREDsred和pTet-on共转染组均检测到RFP基因的转录。【结论】成功构建了Tet-on系统RFP基因表达载体,适宜质量浓度的DOX诱导有助于目的基因的高水平表达,但在不添加DOX诱导剂时,该Tet-on系统存在目的基因低渗漏表达现象。     

基于Tet-on系统的RFP基因表达载体构建及其功能验证

【目的】构建四环素诱导表达调控系统的表达载体,并对其功能进行验证。【方法】利用pTRE-tight和pdsred-Express2-N1构建带有红色荧光蛋白（red fluorescence protein,RFP）基因的载体pTRE-DSred,用其与另一载体pTet-on共转染293T细胞,并加入不同质量浓度(0,0.1,1,10 μg/mL)的强力霉素（doxycycline,DOX）诱导,以未经质粒转染的293T细胞为对照组,在荧光显微镜下观察RFP基因的表达情况。【结果】成功构建了pTRE-DSred重组质粒,将其与pTet-on质粒共转染293T细胞,在细胞培养液中分别添加0.1,1,10 μg/mL DOX,48 h后均有红色荧光蛋白的表达,但10 μg/mL DOX组红色荧光蛋白的表达水平明显低于前2个组;0 μg/mL DOX诱导组中也有红色荧光蛋白表达,但水平极低;在未转染质粒对照组中未观察到红色荧光蛋白的表达。RT-PCR结果显示,pTRE-Dsred和pTet-on共转染组均检测到RFP基因的转录。【结论】成功构建了Tet-on系统RFP基因表达载体,适宜质量浓度的DOX诱导有助于目的基因的高水平表达,但在不添加DOX诱导剂时,该Tet-on系统存在目的基因低渗漏表达现象。     

猪STC-1 siRNA设计及其基因沉默效率检测

根据猪肌肉斯钙素(STC)mRNA序列设计3对小干扰RNA(siRNA)、阴性对照siRNA,转染PK15细胞后,通过荧光观察转染效率和基因表达效率,利用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)及Western blot测定细胞内siRNA基因沉默后STC-1siRNA及蛋白的表达水平。结果表明:3个STC-1siRNA转染细胞后均有较高的荧光信号;STC-132细胞组STC-1mRNA和STC-1蛋白相对表达水平都最低,该组与其他组差异极显著。结果说明成功设计出STC-1siRNA序列,为后续通过调控STC-1表达研究其在肌肉发育中的功能奠定了基础。     

不同处理小鼠卵巢组织中HIF1α基因的表达分析及其真核表达载体构建

为研究低氧诱导因子1α(HIF1α)及其下游基因胰岛素样生长因子2(IGF-2)和血管内皮生长因子(VEGF)在注射孕马血清促性腺激素(PMSG)(促排组)的促排卵巢与注射生理盐水(对照组)的普通卵巢组织中的mRNA转录水平,构建小鼠HIF1α基因真核表达载体,观察其转染的小鼠颗粒细胞中HIF1α基因的表达情况,以探讨HIF1α与小鼠卵泡发育的关系。用荧光定量PCR检测不同处理组织中HIF1α、VEGF及IGF-2 mRNA转录水平,免疫组化技术定位HIF1α在卵泡中的表达,基因重组技术构建HIF1α-pcDNA3.1真核表达载体并将其转染小鼠颗粒细胞,荧光定量PCR与Western blot技术检测转染细胞中HIF1α表达情况。结果表明:HIF1α在促排小鼠卵巢中的mRNA转录水平极显著高于普通小鼠卵巢组织(P0.01),在促排组和对照组的其他组织内HIF1αmRNA转录水平并无显著差异;HIF1下游基因VEGF和IGF-2在促排小鼠卵巢组织中的转录水平分别显著(P0.05)与极显著(P0.01)高于普通小鼠卵巢组织中的转录水平;卵泡发育至有腔卵泡后,HIF1α才开始在卵泡中表达;HIF1α-pcDNA3.1真核表达载体能够在颗粒细胞中转录HIF1αmRNA并翻译成蛋白。结论:HIF1α只在有腔卵泡内表达,其转录水平与卵巢内有腔卵泡数量成正相关,HIF1α通过上调VEGF和IGF-2参与卵泡的发育及成熟。     

过表达及RNA干扰糖尿病相关锚定重复序列蛋白基因腺病毒的制备及鉴定

目的 构建含糖尿病相关锚定重复序列蛋白(DARP)基因的重组腺病毒过表达及RNA干扰载体.方法 应用PCR技术扩增大鼠DARP基因序列,设计并合成shRNA序列,分别插入表达载体GV-314和GV-119,经基因测序鉴定.用重组DARP过表达和shRNA表达穿梭载体与辅助包装质粒pBHGloxAE 1共转染人胚肾细胞HEK293,进行病毒包装、出毒和扩增,采用终点稀释法测定病毒滴度.用重组腺病毒感染大鼠H9c2细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度,Western Blot检测DARP蛋白表达.结果 基因测序显示DARP过表达及shRNA载体序列与原设计序列完全相符,转染HEK293细胞包装成功.DARP过表达和shRNA腺病毒明显影响H9c2细胞中DARP蛋白表达水平.结论 成功构建了大鼠DARP过表达及特异性shRNA腺病毒表达载体.     

山羊MyoG启动子的克隆和活性检测

【目的】肌细胞生成素(myogenin,MyoG) 是生肌调节因子(MRFs)基因家族中唯一能在骨骼肌细胞发育与生长过程中均可表达的调控因子, 在肌肉细胞分化过程中起着中心调控的作用,它正调控着骨骼肌卫星细胞向成熟肌细胞分化的过程,是唯一不可代替的生肌调节因子。MyoG基因在复制、扩增、基因激活、转录、翻译等多级水平上对肌肉发育进行调控。基因转录的起始阶段是机体生长发育因子进行调控的开端,而此阶段调控的实质是通过启动子和上游调控序列的相互作用,调控目的基因的表达。因此克隆MyoG基因的启动子,探讨启动子区域的启动活性,有助于从理论上揭示MyoG基因表达的关键调控位点,同时也有利于揭示肌肉发育调控的相关机理,为治疗人类相关疾病以及改良家畜肉质研究提供实验依据。本研究克隆山羊Myogenin（MyoG）基因的启动子区域,检测其在哺乳动物骨骼肌细胞内的启动活性。【方法】克隆山羊MyoG基因的启动子序列,连入pDsRed2基本骨架构建了以红荧光蛋白基因为标记基因的真核表达载体pDsRed-GoatMyoG(5.3 kb)。表达载体pDsRed-GoatMyoG经酶切和测序鉴定后,分别转染体外培养的绵羊肌卫星细胞、肌管细胞和成纤维细胞,观察红色荧光蛋白表达情况,然后利用实时荧光定量PCR、Western blot和冰冻切片、免疫组化等技术检测细胞转染后标记基因mRNA 和蛋白在体外培养细胞中的的表达活性。pDsRed-GoatMyoG表达载体对小鼠进行肌肉注射,检测GoatMyoG启动子在体内组织中的启动特异性和效率。肌肉注射5 d后,分别取小鼠的注射腿肌肉组织、非注射腿肌肉组织、睾丸组织、肠组织和肝脏组织,通过实时荧光定量 PCR 检测标记基因DsRed在不同组织中的表达情况。【结果】克隆得到的MyoG启动子序列测序正确,载体pDsRed-GoatMyoG经酶切和测序鉴定,证实载体构建成功;转染质粒 pDsRed-GoatMyoG后,肌卫星细胞和肌管细胞在显微镜下均可观察到细胞发红色荧光,成纤维细胞没有红色荧光。通过实时荧光定量PCR检测得出,转基因肌管细胞内GoatMyoG 启动DsRed 基因表达mRNA 的相对量为14.07;通过Western blot技术检测出转基因肌管细胞含有GoatMyoG启动的DsRed蛋白质,在转基因成纤维细胞内没有检测到 DsRed 蛋白质,说明GoatMyoG启动子可在肌肉组织特异性启动外源基因表达。小鼠肌肉注射pDsRed-GoatMyoG质粒后,注射腿肌肉组织内GoatMyoG 启动DsRed 基因转录mRNA 的相对量为212.32,非注射腿肌肉组织内mRNA的相对量为39.76,注射腿肌肉组织和非注射腿肌肉组织内mRNA 的量均是其它组织的1.99倍以上。通过免疫组化技术在注射腿肌肉组织和非注射腿肌肉组织内均可检测到红色荧光蛋白,在睾丸、肠和肝脏内均未检测到DsRed 蛋白。【结论】山羊MyoG启动子可以特异性的在骨骼肌组织驱动外源基因的表达,是一种有效的肌肉特异性启动子。     

过表达及干扰人APE1重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建含过表达及干扰人APE1的重组腺病毒.方法 应用PCR技术扩增人APE1基因序列,设计并合成shRNA序列,分别插入pDC315-EGFP和pDC316-EGFP-U6表达载体,经基因测序鉴定.用重组APE1过表达和shRNA表达穿梭载体与辅助包装质粒pBHGdeltaE11ox3Cre共转染人胚肾细胞HEK293A,进行病毒包装、出毒和扩增,采用终点稀释法测定病毒滴度.用重组腺病毒感染人AC16心肌细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度,Western blot检测APE1蛋白表达.结果 基因测序显示APE1过表达及shRNA载体序列与原设计序列完全相符,转染HEK293A细胞包装成功.APE1过表达和shRNA腺病毒明显影响人AC16心肌细胞中APE1蛋白表达水平.结论 成功构建了人APE1过表达及特异性shRNA腺病毒表达载体.     

细胞和个体水平沉默效应的差异(英文)

[目的]研究3种不同长度的四联shRNA载体及其在细胞与个体水平的沉默效应差异。[方法]以EGFP为靶标基因,用hU6、mU6、h7SK、hH14种启动子,构建21、27、29bp的3种四联沉默载体,通过转染Vero细胞和注射小鼠肌肉,以实时荧光定量PCR的方法检测绿色荧光蛋白基因的mRNA水平。[结果]3种载体都有很强的沉默效应;其在细胞水平上的沉默效应远高于个体水平上;可以通过未成年鼠的肌肉注射进行转基因。[结论]多位点串联表达shRNA是一种可以达到较好干扰效果的方法;肌肉注射将是一个简便的转基因途径。     

细胞和个体水平沉默效应的差异

[目的]研究3种不同长度的四联shRNA载体及其在细胞与个体水平的沉默效应差异。[方法]以EGFP为靶标基因,用hU6、mU6、h7SK、hH1 4种启动子,构建21、27、29 bp的3种四联沉默载体,通过转染Vero细胞和注射小鼠肌肉,以实时荧光定量PCR的方法检测绿色荧光蛋白基因的mRNA水平。[结果]3种载体都有很强的沉默效应,其在细胞水平上的沉默效应远高于个体水平上,可以通过未成年鼠的肌肉注射进行转基因。[结论]多位点串联表达shRNA是一种可以达到较好干扰效果的方法,肌肉注射将是一个简便的转基因途径。     

黄鳝atrogin-1蛋白表达及细胞定位研究

为提高黄鳝养殖效率以及肌肉的质量,进一步发掘黄鳝肌肉发育相关基因,以atrogin-1为研究对象,构建了3种原核表达载体:pCold-TF-atrogin-1、pET28a (+)-atrogin-1及pGEX6P-1-atrogin-1。将构建的重组表达载体转入Transetta(DE3)感受态细胞,重组菌株经诱导表达后,仅pCold-TF-atrogin-1/Transetta(DE3)菌株表达出可溶性较高的重组蛋白。IPTG诱导试验结果表明,诱导剂浓度对蛋白质表达可溶性及含量几乎没有影响,诱导时间在20 h最佳。可溶性部分经Ni-NTA柱亲和层析纯化以及SDS-PAGE(10%聚丙烯酰胺)电泳,证实获得了重组蛋白。构建真核表达载体pEGFP-N1-atrogin-1,转染293T细胞,结果表明,atrogin-1融合蛋白在细胞质及细胞核中均有表达,且在细胞核中表达量相对较高。     

关岭黄牛MSTN启动子真核报告载体的构建与启动活性研究

采用PCR 技术扩增牛MSTN 基因启子,亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic 中,构建重组报告载体pGL3-Basic- MSTN-promoter。将重组报告载体pGL3-Basic-MSTN-promoter 与内参质粒pRL-TK 用脂质体法瞬时共转染小鼠成肌细胞系C2C12 和小鼠胚胎成纤维细胞3T3-L1,通过双荧光素酶活性检测其启动子活性遥测序结果表明,成功构建了牛MSTN 基因真核报告载体pGL3-Basic-MSTN-promoter,瞬时转染试验表明,pGL3-Basic-MSTN-promoter在C2C12细胞和3T3-L1 细胞中的启动子活性分别为pGL3-Basic空载体的14.53 倍尧5.02 倍。研究结果为进一步研究MSTN 基因的表达调控机制奠定了基础。     

AAV-SaCas9敲除MSTN基因病毒的构建及鉴定

为了研究肌肉生长抑制素(MSTN)的相关功能,应用分子生物学方法构建敲除MSTN的AAVSaCas9载体,通过转染293T细胞提取基因组后进行T7酶切鉴定、TA克隆及测序确定该基因的敲除效果;将鉴定正确的AAV-SaCas9重组质粒与pHelper质粒共转染AAV-293细胞3 d后,分离纯化病毒并用实时荧光定量PCR法检测病毒滴度。结果显示,成功构建了敲除MSTN基因的AAV-SaCas9重组载体,T7酶切和测序鉴定出sgRNA2位点可以对MSTN进行编辑,并成功将其包装成病毒,经荧光定量PCR鉴定病毒滴度为2.73×10~(12)vg/mL。     

miR-505慢病毒表达载体的构建

目的:构建携带增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和miR-505基因的慢病毒载体。方法:采用PCR方法从pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-505表达载体质粒扩增出miR-505 shRNA基因编码区173bp、175、171bp片段,通过限制性酶切、T4DNA连接酶连接,分别将miR-505 shRNA基因插入慢病毒表达载体FUGW与L26Fsy(1.1)GW中,构建成重组载体FUGW-miR-505-3p/5p/nc与Fsy-miR-505-3p/5p/nc。脂质体介导下将慢病毒重组载体转染至HEK 293T细胞,通过EGFP观察转染效率,RT-PCR方法检测miR-505的表达量。结果:荧光显微镜下观测到HEK 293T细胞转染后有较强绿色荧光;RT-PCR显示转染FUGW-miR-505-3p/5p与Fsy-miR-505-3p/5p的HEK 293T细胞中对应miR-505-3p/5p明显升高。结论:成功构建带有EGFP和miR-505-3p/5p/nc shRNA基因的慢病毒表达载体。     

牛FADD基因过表达和RNAi载体构建及在牛胎儿成纤维细胞中的表达

FADD(Fas-associated death domain protein)存在于Fas/FasL系统中,是信号传导通路的一个信号连接蛋白,FADD通过传递凋亡信号,从而介导细胞凋亡。为进一步验证FADD基因抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用,从牛卵巢组织中扩增FADD基因,将FADD基因连接到带有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pAcGFP-N1中,构建过表达FADD基因载体,并构建FADD基因的RNAi载体;用脂质体介导法将FADD基因RNAi载体、真核表达载体转染到牛胎儿成纤维细胞中,观察有无荧光的表达,并使用Real-Time qPCR和Western blot方法检测FADD基因mRNA、蛋白水平的表达情况。结果表明:成功构建出FADD基因RNAi载体和高表达载体,重组质粒转染牛胎儿成纤维细胞24 h后在荧光显微镜下可观察到绿色荧光,转染效率可达50%。     

茎部长度为21、27、29bp的shRNA表达载体构建

利用shRNA(Small hairpin RNA)载体调控基因表达已经成为研究基因功能的有力工具。针对增强型绿色荧光蛋白标记基因(Enhanced green fluorescent protein,egfp),分别设计茎部长度为21bp、27bp、29bp的干扰片段,体外合成的单链shRNA片段退火后连入带有U6启动子的真核表达载体psiSTRIKE中,酶切及测序结果证明设计的干扰片段已经成功克隆进入表达载体,为进一步在小鼠细胞以及个体水平上综合评价不同茎部长度shRNA的干扰效应奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒N基因重组真核质粒构建及其表达

为探明猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)N基因编码的蛋白对PEDV感染早期诊断的作用,根据PEDV CV777株N基因全序列设计一对特异性引物以扩增N基因,定向插入到pPM-CHis真核表达载体中构建重组表达质粒pPM-C-His-N,将重组质粒肌肉注射昆明系小鼠,以检测其在小鼠体内的表达水平;将pPM-C-His-N转染至Vero细胞,分别在基因水平和蛋白水平对N基因的表达进行检测,并采用间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测N蛋白在细胞中的表达分布情况。结果表明,重组质粒在基因水平和蛋白水平均成功表达,免疫小鼠血清中抗体的效价为1∶51 200,Western-blot结果显示,免疫血清能与重组N蛋白发生特异性反应,说明实验成功构建了重组真核表达质粒pPM-C-His-N,且在Vero细胞内检测到了绿色荧光,为PEDV诊断方法的建立及致病机制的研究奠定基础。     

肌肉生成抑制素功能调控研究进展

摘要:肌肉生成抑制素(Myostatin,MSTN)作为骨骼肌发育的负调控因子,其调控功能对畜牧生产具有重要的意义。从遗传选育、基因重组、免疫中和、MSTN结合蛋白以及受体结合与信号转导等方面综述了MSTN调控的最新研究进展。     

p E G F P - N 3 - L P L重组真核表达载体的构建及在V e r o细胞中的表达

目的:构建贵州白香猪LPL基因与增强型绿色荧光蛋白基因的融合表达载体pEGFP-N3-LPL,转染Vero细胞,观察重组质粒的表达.方法:采用HindⅢ和BamHⅠ两种限制性内切酶获得LPL基因编码区片段和pEGFP-N3线型载体,将目的片段与该载体连接、转化、挑取阳性克隆,进行菌落PCR、双酶切及测序鉴定.使用Lipofectamine2000将重组质粒转染Vero细胞,观察细胞中绿色荧光蛋白的表达并对其进行mRNA检测.结果:成功构建重组真核表达载体pEGFP-N3-LPL,经mRNA检测,实验组在1 500bp处出现特异性条带,说明重组载体已在Vero细胞中获得表达.结论:本试验构建的真核细胞表达载体pEGFP-N3-LPL,为进一步阐明LPL基因与肌内脂肪沉积间的生物学作用机制奠定了基础.     

小鼠MCK基因启动子的克隆及其活性初步分析

本研究克隆了小鼠MCK基因5'侧翼区以及核心启动子区,并分析和研究了其调控活性。首先以小鼠尾部肌肉基因组DNA为模版克隆了小鼠MCK基因5'侧翼区序列,回收纯化,连接pEASY-T3 Cloning载体,测序,分析了其增强子与核心启动子序列。然后将核心启动子序列亚克隆到无启动子的荧光蛋白报告载体pGL3-Venus中,转染小鼠成肌细胞C2C12,观察其在荧光显微镜下的表达情况。结果表明,小鼠MCK基因-1354～+1 bp核心启动子序列能调控Venus荧光蛋白在C2C12细胞内表达,证实MCK启动子核心序列具有组织特异性调控能力。