木薯块根膨大期韧皮部和木质部比较蛋白组学初步研究

以‘华南8号’木薯块根膨大期的韧皮部和木质部为材料,采用改进酚抽法提取总蛋白,进行一维和二维电泳,电泳图谱经Image Master分析,得到差异蛋白点进行质谱鉴定。结果表明:改进酚抽法可以从木薯块根韧皮部和木质部中提取高质量总蛋白,用于蛋白质组学研究;获得分离性好、分辨率及重复性较高的双向电泳图谱;比较木薯块根韧皮部和木质部双向电泳图谱发现265个差异表达蛋白点,其中29个在韧皮部特异表达,17个在木质部特异表达;成功鉴定出8种差异蛋白,这些蛋白主要参与翻译后修饰、无机离子和氨基酸转运代谢、分子伴侣和信号转导等代谢通路。本研究初步比较木薯块根韧皮部和木质部的蛋白表达差异性,为进一步从蛋白质组水平研究木薯块根膨大过程中淀粉转运、积累和合成调控机制奠定了技术基础。     

不同品种木薯叶绿体比较蛋白质组学初步研究

以“华南8号”木薯(SC8)和“华南124号”木薯(SC124)的叶绿体作为研究材料,采用改进酚抽提法提取蛋白,通过单向SDS-PAGE电泳和双向SDS-PAGE电泳,比较不同木薯品种叶绿体的蛋白表达谱,并对表达的差异蛋白进行MALDI-TOF MS质谱鉴定,获得15个差异蛋白,其中有6个蛋白在SC124木薯叶绿体中表达较高,9个蛋白表达很低.对蛋白进行功能分析,发现差异蛋白主要参与蛋白翻译后修饰、周转、分子伴侣、碳水化合物运输等过程.通过RT-PCR验证了木薯核酮糖1.5-二磷酸羧化酶、ATP合酶β亚基的基因表达情况,结果表明,ATP合酶β亚基基因表达与蛋白质的表达比较一致,而核酮糖1,5-二磷酸羧化酶基因与蛋白质表达变化不一致.     

等电聚焦强度对木薯叶片蛋白质双向电泳分离结果的影响

通过优化等电聚焦强度改良木薯叶片蛋白质双向电泳的分离效果。 结果表明,13 万 Vhs 等电聚焦强度能很好地分离木薯叶片蛋白质, 且分离的蛋白质具有良好的质谱兼容性。质谱鉴定 7 个蛋白点, 结果显示这些蛋白主要参与能量代谢,其中有些蛋白点是在 13 万 Vhs 聚焦强度下特异出现的     

晋麦47幼苗叶片水分胁迫差异表达蛋白的鉴定与分析

为了从蛋白质水平进一步揭示小麦抗旱机理,以旱地小麦品种晋麦47为试验材料,采用蛋白质双向电泳技术,结合质谱鉴定技术,研究幼苗在正常供水与水分胁迫(-0.5 MPa的PEG-6000溶液处理48h)后叶片蛋白质组表达谱间的差异,分析水分胁迫差异表达的蛋白种类及其功能.研究发现,在正常供水和水分胁迫处理两种条件下,幼苗叶片蛋白的双向电泳图谱均可重复检测到850个蛋白点;31个蛋白点在两种供水水平间表达量存在显著差异,其中17个蛋白点在水分胁迫处理下表达量明显增加,14个蛋白点表达量明显减少.对这些蛋白点进行肽指纹图谱分析,并利用Mascot软件在NCBInr数据库搜索,最终有26个蛋白点被成功鉴定;其中,未知功能蛋白7个;已知功能蛋白19个,主要涉及能量、代谢、抗病与防御、细胞结构、转录与翻译以及信号转导等功能类别.结果表明,小麦体内的多个代谢及调控途径参与了对干旱的应激反应.最后,本文还对鉴定到的差异蛋白点与水分胁迫的关系进行了分析和讨论.     

玉米叶片总蛋白提取和双向电泳技术的改进

针对植物组织蛋白质含量较低,有些组分在两性电解质中的溶解性低以及绿色组织中的色素、酚类、醌类等次生代谢产物干扰蛋白质双向电泳分离效果的问题,以玉米苗期叶片为材料,对蛋白质裂解液、蛋白质浓度测定体系、等电聚集电泳电压和时间、聚丙烯酰胺凝胶浓度等技术参数做了改进。用改进的裂解液提取的蛋白质样品浓度达3.8μg/μL,比改进前提高90%。通过在浓度测定体系中加入HCl并用裂解液代替超纯水配制标准蛋白,可得到线性更好的蛋白浓度测定标准曲线。用改进后的等电点聚焦电泳的电压、时间和聚丙烯酰胺凝胶浓度,可从玉米叶片总蛋白质样品中分离出963个清晰的蛋白点,在其他条件相同的情况下,比改进前的技术体系多分离出429个蛋白点。     

木薯块根不同发育期β-胡萝卜素和蛋白质积累变化及其有色体蛋白质组学研究

木薯是世界重要的粮食作物,在我国发展潜力巨大。蛋白质和类胡萝卜素是重要的营养品质特性,但木薯蛋白质含量低,提高木薯块根类胡萝卜素和蛋白质含量,提高其营养成分,已成为木薯选育种的重要目标。本研究以蛋黄木薯（‘SC9'）、紫叶黄心木薯（‘BGM019'）和白心面包木薯（‘SC101'）3个木薯品种为试验材料,开展黄心和白心木薯块根营养品质特性的研究,分析其不同发育期类胡萝卜素和蛋白质含量的变化,同时利用双向电泳和质谱法开展木薯块根有色体亚细胞结构蛋白质组的研究,揭示其蛋白质含量提高与类胡萝卜素积累的关联性。结果表明：3个木薯品种块根β-胡萝卜素含量在块根形成期、膨大期和成熟期差异显著（P<0.05）,‘BGM019'和‘SC9'蛋白质含量在同一生长发育时期差异不显著（P>0.05）,但显著高于‘SC101'（P<0.05）。随着木薯块根发育成熟,其类胡萝卜素和蛋白质含量均呈上升趋势,且二者表现为正相关。以膨大期为对照,在‘SC9'成熟期块根有色体中检测到36个差异表达蛋白质,其中26个上调表达,10个下调表达;‘BGM019'中检测到49个差异表达蛋白质,其中28个上调表达,21个下调表达;‘SC101'检测到38个差异蛋白质,其中20个上调表达,18个下调表达。通过对上述差异蛋白质的功能分析,发现它们均参与抗氧化、碳代谢和能量代谢、信号转导等多个代谢过程,说明木薯块根类胡萝卜素积累是由多个代谢途径协同作用的结果。对比分析3个木薯品种块根有色体亚细胞结构的差异蛋白质,发现20个差异表达蛋白质在其中2个品种或3个品种间出现相同的表达趋势。它们主要涉及到碳代谢及能量代谢、抗氧化、细胞骨架蛋白、无机离子运输及代谢、分子伴侣和蛋白质合成等代谢途径,其中与抗氧化相关的蛋白质占20%。构建蛋白质生物调控网络揭示块根有色体蛋白质与β-胡萝卜素积累的关联性,为培育优质高营养的木薯新品种提供新思路。     

大豆质核互作雄性不育系NJCMS1A和其保持系的不同器官蛋白质组比较

质核互作雄性不育在杂种优势利用中起着重要作用,探讨质核互作雄性不育发生的机理具有重要的理论和实践意义.本研究开展大豆质核互作雄性不育系NJCMS1A与其保持系NJCMS1B的不同器官蛋白质组比较分析.以大豆质核互作雄性不育系NJCMS1A和其保持系NJCMS1B的种子、叶片和花药为材料,采用双向凝胶电泳技术对其蛋白质进行分离,考马斯亮蓝染色,获得重复性好的蛋白质双向电泳图谱,利用PDQuest软件处理分析,寻找差异表达蛋白.结果发现不育系NJCMS1A与其保持系NJCMS1B的种子2-DE图谱间存在7个差异表达蛋白点,其中3个在NJCMS1A中表达而在NJCMS1B中缺失,3个在NJCMS1A中缺失而在NJCMS1B中表达,1个在NJCMS1A中表达量明显增强;苗期叶片2-DE图谱间基本一致,没有差异表达蛋白点;单核小孢子期花药2-DE图谱间有9个差异表达蛋白点,其中3个在NJCMS1A中表达而在NJCMS1B中缺失,6个在NJCMS1A中缺失而在NJCMS1B中表达;二胞花粉期花药2-DE图谱间有24个差异表达蛋白点,其中10个在NJCMS1A中表达而在NJCMS1B中缺失,12个在NJCMS1A中缺失而在NJCMS1B中表达,2个在NJCMS1B中表达量明显增强.两系花药间存在较多差异表达蛋白点,种子间仅有少量差异表达蛋白点,而苗期叶片间基本没有差异表达蛋白点,说明不育基因表达具有时空性和器官特异性,与育性有关的蛋白主要在花药中表达.     

茶叶叶绿体分离及其功能的研究

离体茶叶叶绿体芳香族氨酸代谢试验结果,酪氨酸刺激苯丙氨酸的形成,甘氨酸(5毫摩尔)的加入则使酪氨酸大量积累;茶细胞的PAL(苯丙氨酸解氨酶)约有30％集中在叶绿体,用红光诱导时,叶绿体PAL活性明显提高,表明茶叶叶绿体具有芳香族氨酸的代谢机能(苯丙氨酸和酪氨酸解氨及其相互转化)和其调控特点(反馈调节和苯丙氨酸解氨的光调节)。因此,认为苯丙酸盐代谢定位于叶绿体。关于莽草酸途径,酪氨酸对苯丙氨酸形成的反馈促进,暗示茶叶叶绿体含有这两种氨酸的生成酶系,但~(14)C示踪试验证明它缺少该途径的部分酶。聚丙烯酰胺凝     

聚乙二醇胁迫下茶树叶片的蛋白质组分析

应用差异蛋白质组学方法分析了铁观音茶树幼苗在聚乙二醇(Polyethylene Glycol,PEG)胁迫下叶片蛋白质组的变化。对18个蛋白质点在PEG胁迫下的变化特点进行了分析,并对有差异表达的16个蛋白质点进行了质谱分析,共鉴定出14个蛋白质点,代表了10种不同的蛋白,其中5个点是同一个蛋白(1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基,RubisoLSU),另9个蛋白是PEG胁迫响应蛋白,包括光合系统II23kDa多肽、叶绿体伴侣蛋白21(ch-Cpn21)、磷酸丙糖异构酶(TPI)、三磷酸腺苷合酶β亚基、S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS1)、磷脂酰乙醇胺结合蛋白(CEN)、新生多肽相关复合物α亚基(α-NAC)、20S蛋白酶体α亚基(PAE2)、翻译起始因子5A(eIF5A)等,这些蛋白质分别参与了叶绿体组成、糖代谢、能量代谢、硫代谢、蛋白质代谢、信号转导、基因表达调节和细胞程序性死亡等生命活动过程。     

白叶1号白化过程中叶绿体蛋白质组差异分析

白叶1号是一种温度敏感型白化茶树品种,叶绿体的变化是其产生阶段性白化现象的关键因素。本研究以白叶1号鲜叶叶绿体为研究对象,采用双向电泳、质谱鉴定结合生物信息学分析,研究阶段性白化过程中叶绿体蛋白的表达差异,探讨白叶1号阶段性白化现象的分子机制。结果表明,在白叶1号白化前期、白化期和复绿期叶绿体中分别识别726、748、718个蛋白质,其中差异表达的蛋白59个,质谱成功鉴定22个差异表达蛋白。生物信息学分析表明,差异表达蛋白直接或间接参与了光合作用、应激响应、核酸代谢、物质代谢和未知功能等,其中与光合作用相关的差异表达蛋白最多,占31.82%,表明阶段性白化现象可能与这些生理功能相关。通过荧光定量PCR分析发现,差异蛋白的基因表达与蛋白表达存在一定差异,这可能是由于蛋白质翻译后加工及修饰造成的。上述研究为进一步揭示白叶1号阶段性白化现象产生的分子机制奠定了理论基础。     

小麦小花细胞核蛋白质双向电泳体系的优化

为建立适用于小麦小花细胞核的分离及其蛋白质双向电泳（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）体系,以小麦品种西农1376三核期小花为供试材料,采用叶绿素含量测定、荧光显微镜观察和组蛋白免疫印迹检测等方法对分离和富集到的细胞核进行了纯度评价,并在SDS-PAGE胶浓度和蛋白质上样量等方面对细胞核蛋白质双向电泳体系进行了探索和优化,确立了一套适用于小麦小花细胞核的分离及其蛋白质双向电泳的技术方法。结果表明,获得的细胞核完整且纯度较高;经TCA/丙酮法提取其蛋白质,采用17 cm、pH 4~7 IPG胶条和12%SDS-PAGE分离胶,上样量为230 μg的双向电泳体系,更适合于小麦小花细胞核蛋白质组分离,经PDQuest 2DE 8.0.1软件统计分析,可在2-DE图谱上分辨出约264个蛋白点,蛋白点清晰呈圆形,无横条纹干扰。     

橡胶草胶乳蛋白双向电泳方法的建立

采用Tris饱和酚法和TCA/丙酮沉淀法提取橡胶草(Taraxacum Kok-saghyz Rodin)胶乳蛋白质,并建立蛋白双向电泳方法.结果表明,TCA/丙酮沉淀法得到的双向电泳图谱横条纹较多,背景模糊,得到约446个蛋白质点;Tris饱和酚法提取样品双向电泳的聚焦效果较好,图谱显示约630个蛋白点,其中包括较丰富的低分子量蛋白.     

一个抗病性增强的水稻类病变突变体的蛋白质组学研究

水稻类病变突变体chl1具有抗病性增强的类病变表型,对水稻白叶枯病和稻瘟病都具有很强的抗性。利用蛋白质组学技术分析chl1与其野生型之间的差异表达蛋白,探讨chl1类病变表型的形成和抗病反应的分子机制。利用荧光双向差异凝胶电泳(two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis,2D-DIGE)技术和质谱分析,chl1中共鉴定到70个差异表达的蛋白点,包括46个上调蛋白点和24个下调蛋白点。这些蛋白点参与不同的生物过程,包括防御相关、光合作用、氧化还原、氨基酸/蛋白质代谢、分子伴侣、碳水化合物代谢。对这些差异表达蛋白进行生物信息分析,推测它们所在的复杂调控网络可能参与chl1叶片细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)及其抗病性的调控。     

木薯根尖染色体制片方法的优化

以华南6号木薯根尖为材料,采用酶解去壁低渗法和压片法,制备木薯染色体标本,并对其制片过程中的预处理药品、预处理时间、酶解时间等因子进行优化。结果表明：酶解去壁低渗法能获得较好的染色体标本,α-溴代萘与对二氯苯饱和液的混合液和0．1％的秋水仙素与0.002 mol/L 8-羟基喹啉混合液的预处理效果最好,预处理时间以2 h为宜,酶解时间4 h效果最好。     

影响木薯叶片蛋白质双向电泳图谱的因素分析

以木薯华南205为试材,采用苯酚抽提法提取叶片蛋白质,并通过双向电泳技术研究影响木薯叶片蛋白电泳分析图谱的主要因素。结果表明：pH 4～7的IPG胶条可提高特定范围蛋白质点的分辨率;上样量200 μg可得到较好的双向电泳图谱。本研究不仅为进一步研究木薯叶片蛋白电泳分析提供技术手段,同时也为分析木薯块根、茎和繁殖器官的蛋白质提供参考。     

干旱胁迫下橡胶树叶片差异表达蛋白的鉴定与功能解析

干旱是影响橡胶树生长和产胶的重要非生物胁迫.以橡胶树无性系热研7-33-97为试验材料,通过干旱胁迫处理后,提取并纯化样品叶片的总蛋白质,经双向凝胶电泳(2-DE)和胶图分析.结果表明,干旱胁迫与对照样品相比,干旱胁迫10 d和15 d的橡胶树叶片蛋白中共存在38个差异表达蛋白点.采用MALDI-TOF MS分析和数据库检索,对差异表达的蛋白进行鉴定和功能注释,依照功能分类,这些蛋白主要参与胁迫应激响应、能量代谢、光合作用、信号转导以及细胞定位等生物学过程.     

茶树雌蕊总蛋白质双向电泳分离体系的建立

为建立一套适合茶树雌蕊总蛋白质分离的双向电泳体系,对茶树雌蕊总蛋白的提取方法、SDS-PAGE凝胶浓度、聚焦条件和IPG胶条pH范围等进行了比较优化。结果表明,TCA/丙酮-clean up kit法提取总蛋白,用17 cm pH 5~8 IPG胶条,13%SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行分离,用考马斯亮蓝R250染色,可以获得清晰、分辨率高、重复性好的双向电泳图谱,共检测到约1 200个蛋白点,主要分布在pH 5~8,相对分子量14~117 kD范围内,碱性蛋白得到有效分离,可以满足茶树雌蕊的蛋白组学分析和研究。     

大豆GmDRR与互作基因GmDIP1的亚细胞定位及原核表达

本实验室通过疫霉菌诱导大豆绥农10号后,获得差异表达蛋白点,通过序列拼接比对和分析,获得一个新的大豆GmDRR基因,并通过酵母双杂筛选文库的方式获得其互作基因GmDIP1。为进一步明确两个基因关系,对两个基因分别进行亚细胞定位和原核表达以及重组蛋白的纯化。GmDRR蛋白为外分泌蛋白,定位于细胞膜与细胞质中,GmDIP1基因定位于线粒体膜上,二者都成功进行了原核表达,从而获得了有表达功能和生物学活性的蛋白。     

茶树雌蕊总蛋白质双向电泳分离体系的建立

为建立一套适合茶树雌蕊总蛋白质分离的双向电泳体系,对茶树雌蕊总蛋白的提取方法、SDS-PAGE凝胶浓度、聚焦条件和IPG胶条pH范围等进行了比较优化。结果表明,TCA/丙酮-clean up kit法提取总蛋白,用17 cm pH 5~8 IPG胶条,13%SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行分离,用考马斯亮蓝R250染色,可以获得清晰、分辨率高、重复性好的双向电泳图谱,共检测到约1200个蛋白点,主要分布在pH 5~8,相对分子量14~117 kD范围内,碱性蛋白得到有效分离,可以满足茶树雌蕊的蛋白组学分析和研究。     

金柑多糖酶法脱蛋白工艺的研究

蛋白酶法结合Sevag法对金柑粗多糖进行脱蛋白,研究不同酶添加量、温度、pH值、时间等因素对金柑粗多糖脱蛋白效果的影响。结果表明,金柑粗多糖酶法脱蛋白最佳工艺条件是：木瓜蛋白酶添加量120 U/mL、酶解时间80 min和酶解温度40　℃;在此条件下,蛋白质脱除率为75.88％,多糖的损失率为5.45％;再用Sevag试剂处理3次,蛋白质脱除率和多糖损失率分别为85.18％和14.16％。