辣椒CaERF4的全长cDNA克隆及其表达分析

通过筛选辣椒均一化cDNA文库,获得一个具有AP2结构域的辣椒CaERF4全长cDNA序列,含有一个编码250个氨基酸序列的开放阅读框,与拟南芥等其它植物ERF蛋白之间有35%~38%的氨基酸序列相似性。该基因在辣椒不同器官中均有不同程度的组成型表达,在根系中表达量略低。此外,还发现CaERF4的转录受到茉莉酸甲酯(MeJA)和乙烯利(ETH)等外源激素处理以及青枯菌接种的诱导,但水杨酸(SA)处理作用不明显,高温处理也可诱导其转录表达增强。说明CaERF4可能在辣椒应答病原菌和高温等逆境胁迫中起调节作用。     

辣椒CaMAPK7启动子顺式作用元件及其表达分析

促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)在植物生长、发育和适应环境中起着十分重要的作用,但对该家族多数成员的表达调控机制认识仍十分有限。前期实验已分离获得辣椒一个MAPK家族成员Ca MAPK7,并发现该基因的表达受病原菌、高温等逆境的诱导,但其表达调控机制仍不清楚。本研究进一步分离了Ca MAPK7的启动子序列(p Ca MAPK7),发现其TATA框位于-165 bp与-170 bp之间,此外还发现W-box,HSE,TCA,LTR,ERE等多种与生物及非生物逆境胁迫应答相关的顺式作用元件。通过构建该启动子与报告基因GUS融合表达载体p Ca MAPK7::GUS,利用农杆菌介导的本氏烟草叶片瞬间表达系统分析发现p Ca MAPK7可应答青枯菌接种及水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(Me JA)、油菜素内酯(BR)、脱落酸(ABA)和乙烯(ET)等外源激素处理,表明Ca MAPK7应答青枯菌、外源激素处理主要是通过该启动子介导的转录调节实现的。     

辣椒疫霉作用下叶绿素a/b结合蛋白的表达

从基于cDNA-AFLP分析的辣椒应答疫霉侵染的表达谱中找到1个特异表达基因的序列;利用这个序列设计引物,采用基于PCR技术的96孔文库筛选方法,从疫霉处理的辣椒cDNA文库中筛选出这个应答辣椒疫霉侵染的候选基因的全长cDNA;经生物信息学分析,推测这个长度为1022 bp的候选基因为辣椒叶绿素a/b结合蛋白（chlorophyll a/b binding protein,cab）基因;并利用荧光定量PCR法检测cab在疫霉侵染下的表达情况。     

利用酵母单杂交方法筛选大豆根融合基因表达cDNA文库

酵母单杂交体系通过筛选cDNA文库可直接得到与靶序列相互作用的蛋白质基因序列,是研究DNA-蛋白质相互作用和转录因子功能的最常用、最有效的方法之一.通过构建与Gal4p的激活结构域融合的表达cDNA文库,利用抗病相关基因启动子区的W-box顺式元件采用酵母单杂交方法对该文库进行了筛选,共得到4个阳性克隆.结果为进一步研究与顺式元件W-box相互作用的WRKY蛋白奠定了基础.     

一个辣椒PHD-finger家族转录因子CaPHD1的克隆及其表达分析

以辣椒均一化cDNA文库为模板,通过PCR扩增获得CaPHD1基因克隆,该基因序列含有1个220个氨基酸序列的开放阅读框,同其他植物具有62%~89%的氨基酸同源性。在植物亚细胞定位实验中CaPHD1与GFP的融合蛋白定位于细胞核;实时荧光定量PCR分析结果表明,该基因受到青枯菌侵染和水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯和脱落酸等外源激素的诱导,表明CaPHD1可能在应答病原菌中起重要的作用。     

辣椒Rop cDNA分离及其序列分析

从cDNA文库中分离获得1个cDNA阳性克隆,测序和序列分析结果表明,其长度为1141 bp,含有1个长度为197 aa的开放读码框架,与烟草等植物的Rop有较高的同源性,该cDNA是从UV处理的辣椒cDNA文库中分离获得的,可能与辣椒适应UV辐射胁迫有关.该cDNA的分离为进一步研究其在辣椒适应UV辐射防御反应的分子机理研究奠定了重要的基础.     

小麦DREB转录因子TaAIDFa的互作蛋白筛选

为进一步探讨DREB类蛋白的作用机理,以DREB类转录因子TaAIDFa为探针,利用酵母双杂交技术从cDNA文库中筛选TaAIDFa的互作蛋白,进而探讨DREB转录因子介导的互作网络,以初步阐明DREB转录因子的抗逆机制。结果表明,通过酵母双杂交从cDNA文库中筛选到84个克隆,对其进行测序和Blast序列比对分析,得到4类与TaAIDFa互作的候选蛋白。同源性分析发现,这4类候选蛋白多与信号转导或免疫过程有关,说明TaAIDFa参与了植物逆境胁迫下的信号转导,可调控与逆境胁迫相关基因的表达。     

强优势玉米杂交种雌穗均一化cDNA文库的构建与鉴定

以强优势玉米杂交种豫玉22发育时期的雌穗为材料构建cDNA文库,为进一步研究和分离杂种优势相关基因构建技术平台。选择玉米雌穗发育过程中的4个时期(生长锥伸长、小穗分化、小花分化和花丝始伸期)的雌穗组织分别构建了4个定向cDNA文库,依据基因组DNA饱和杂交的原理,将从4个独立的cDNA文库中提取的质粒混合,通过基因组DNA亲和体系饱和杂交,获得雌穗全发育时期均一化cDNA文库。该文库平均插入片段1.3kb,含有3×104个克隆。对文库中随机的150个克隆进行测序,81.6%的序列为非冗余序列,11.2%的序列含有两个或两个以上的拷贝,并且主要来自多基因家族转录本,说明此文库的均一化有效。对测序结果进行功能聚类分析,发现文库序列涉及水解酶、转移酶、核苷酸结合蛋白、蛋白激酶、转录因子等基因,涉及环境应答、蛋白代谢、物质转运、个体发育等多个生化途径,说明该均一化文库基因覆盖度较高。该文库还包含有大量的未知基因,有待进一步的发掘和研究。     

大豆GmFT2a启动子InDel区结合蛋白的筛选

GmFT2a是大豆光周期反应中的关键基因,为研究其表达调控的分子机制,以光周期敏感品种自贡冬豆和钝感品种黑河27为材料,比较分析两品种Gm FT2a启动子序列的差异,发现在自贡冬豆GmFT2a启动子区存在两个含有光反应元件的插入片段T1和T2,而黑河27无上述片段。根据光响应元件I-box和Sp1的序列,构建诱饵载体,利用酵母单杂交技术筛选自贡冬豆叶片cDNA文库,获得一个与T1元件结合的MYB转录因子。该转录因子的获得为进一步研究GmFT2a表达调控的分子机制提供了新的线索。     

小麦转录因子TaDREB6基因的克隆及鉴定

为了克隆小麦干旱应答基因,构建了干旱诱导的小麦cDNA文库,并从文库中分离了一个DREB类转录因子基因TaDREB6.序列分析表明,TaDREB6具有一个837bp的开放阅读框和242bp的3非编码区,推测的氨基酸序列中含有一个高度保守的AP2/EREBP结构域.采用该基因特异引物PCR技术对一套中国春缺体-四体材料进行扩增,将TaDREB6定位于3A染色体上.这是首次将一个小麦DREB基因定位在特定的染色体上.RT-PCR分析表明,TaDREB6基因受干旱胁迫诱导表达;亚细胞定位结果表明,TaDREB6-hGFP融合蛋白定位于细胞核中.上述结果说明,小麦TaDREB6基因编码的蛋白可能在细胞核内对干旱胁迫应答反应起调控作用.     

海南普通野生稻OrNAC5的克隆和表达分析

根据EST序列信息,从海南普通野生稻中克隆了一个NAC(NAM,ATAF and CUC)类转录因子OrNAC5。该基因编码区cDNA长度699 bp,编码232个氨基酸,对应的DNA长度为2 538 bp,含有3个外显子和2个内含子。推导的OrNAC5氨基酸序列具有典型的NAC类转录因子结构特征,与水稻(Oryza sativa)、短花药野生稻(Oryza brachyantha)、大麦(Hordeum vulgare)、谷子(Setaria italica)中相应蛋白的同源性分别为99%、81%、60%和58%。对OrNAC5启动子序列进行分析,结果发现存在多种激素应答和胁迫响应的调控元件。Real-Time PCR结果显示,低温、干旱和盐胁迫均能诱导OrNAC5的表达。上述结果表明OrNAC5可能在逆境响应过程中具有重要功能。     

木薯蔗糖合酶(SuSy)基因的表达分析及SuSy1和SuSy4编码序列的克隆

依据拟南芥6个蔗糖合酶基因序列搜索木薯基因组数据库,获得了6个木薯蔗糖合酶基因亚型。将6个木薯蔗糖合酶基因亚型的外显子-内含子结构进行分析,结合其它物种蔗糖合酶基因的氨基酸序列构建进化树,将木薯蔗糖合酶基因可分为三类,分别为Su Sy1/Su Sy4,Su Sy2/Su Sy3和Su Sy5/Su Sy6。以木薯KU50的功能叶和5个不同时期块根的RNA为模板,利用RT-PCR的方法对蔗糖合酶基因家族进行表达分析,确定了Su Sy1和Su Sy4高表达的亚型,克隆并获得了Su Sy1和Su Sy4基因的编码区序列,对获得的序列进行同源性和功能结构域分析表明,2条序列的氨基酸同源性为97%,并且有相同的功能结构域。     

偃麦草ErABF1基因克隆及功能分析

抗逆相关bZIP (Basic leucine zipper) 转录因子家族基因主要参与ABA、干旱、高盐等胁迫应答反应,其过表达能够显著增强植物的抗逆性。本研究从偃麦草（Elytrigria repens L.）中分离到一个抗逆相关 ErABF1（E. repens ABA Binding Factor 1）基因,氨基酸序列比对分析发现,该基因与小麦、玉米、拟南芥等bZIP转录因子基因同源性较高,亲缘关系较近;ErABF1基因的表达受到ABA、干旱、高盐、低温的强烈诱导;在2% PEG、200 mmol·L^-1 NaCl胁迫培养基上初步功能分析表明, ErABF1过表达提高了转基因烟草对干旱、高盐的胁迫耐性。     

植物热激转录因子及其与耐热性关系的研究进展

热激转录因子是高等植物热胁迫响应基因转录水平上的中心调控蛋白,在植物的热胁迫信号转导以及耐热性中起着关键作用。为了给作物耐热性研究和应用提供有益的参考,本文从热激转录因子家族基因的分类、克隆、功能分析及其作用机理等方面详细介绍了模式植物拟南芥以及番茄、水稻、玉米和小麦等主要作物中该家族基因与耐热性关系的研究现状,并对该家族基因研究中亟待解决的问题进行了探讨。     

巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌Slt2类MAPK同源基因CMP1的克隆与序列分析

根据几种丝状真菌Slt2类MAPK的保守氨基酸序列设计简并引物,从巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌[Corynespora cassiicola(Berk.Curt.)Wei]中扩增出MAPK同源基因的部分片段,再利用染色体步移法延伸该片段的上、下游邻接序列,获得MAPK编码基因的全长序列,命名为CMP1(GenBank Accession No.GU321364)。序列分析表明,该基因含有5个外显子和4个内含子,编码417个氨基酸的多肽,推测分子量为47.5 ku,等电点为5.57。CMP1含有一个参与双重磷酸化作用的MAPK蛋白激活域(TEY),其氨基酸序列与丝状真菌的MAPK,AAslt2和MAP-kinase等高度同源。系统聚类结果显示,该基因与白菜黑斑病菌(Alternaria brassicicola)、细交链格孢菌(A.alternata)和玉米小斑病菌(Cochliobolus heterostrophus)的Slt2类MAPK基因具有较高的同源性。Southern杂交分析表明,CMP1基因在巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌基因组中以单拷贝形式存在。     

蓖麻WRKY转录因子的全基因组鉴定及其进化分析

 为探讨WRKY转录因子在蓖麻耐胁迫中可能的生物学功能,研究基于已公布的基因组和ESTs数据对蓖麻WRKY转录因子家族进行全面鉴定和系统命名,并在此基础上分析了其基因结构和进化特征。结果显示,蓖麻基因组中至少存在56个WRKY基因,它们散布于39条scaffolds上,所含内含子数目在1-5个;RcWRKYs包含1~2个WRKY结构域,根据WRKY结构域的数量及其锌指结构的特征,这些蛋白可分为I、IIa、IIb、IIc、IId、IIe 和III类/亚类。与拟南芥相比,蓖麻的WRKY基因在物种分化后并未明显进化,它们中的大部分在拟南芥中都有同源基因;相对而言,在不同类基因中,I类的WRKY基因得到了较快的进化。       

菲利普孢囊线虫侵染后小麦防卫相关UniGene表达特性

菲利普孢囊线虫(Heterodera filipjevi)是严重危害我国黄淮海地区小麦生产的重要病原物之一。为揭示该线虫侵染后合胞体建立早期病原与宿主细胞的互作机制,以H.filipjevi易感材料温麦19和抗性材料抗线2号为研究对象,应用real time PCR分析了线虫侵染后不同时段10个可能与防卫相关的UniGenes相对表达量的变化。结果表明,与细胞结构相关的基因UniGeneAK335102(GenBank ID,下同)在抗线2号中的表达量高于温麦19,而另一个与细胞结构相关的UniGeneDR737925在温麦19中的表达量高于抗线2号。与应激相关的一个UniGene JV948284在侵染后各时段,在温麦19中的表达量均远高于抗线2号。与抗性相关的UniGene JP233598在接种线虫3 d以后,在抗线2号中的表达量明显高于温麦19;UniGene JP852719(Ascorbate peroxidase)基因在抗、感材料中的表达量无明显差异;UniGene(CV767657)TIFY 3A-like protein在温麦19中的表达量随接种后时间延长而降低,而在抗线2号中的表达量仅在接种后3、9 d时的表达量相对较高。信号转导相关UniGeneCD87797与WRKY转录因子家族UniGeneEU665453,在温麦19中的表达量随接种后时间延长而逐渐增加,但在抗线2号中则逐渐降低。MYB转录因子UniGene JF951950的表达量在温麦19中接种早期较高,而在抗线2号中接种后期较高;另一MYB转录因子UniGeneAK330737(similarity to Os06g0258000)在抗线2号中的表达量明显高于温麦19。综上所述,在菲利普孢囊线虫侵染后的早期,10个可能与防卫相关的基因表达模式在抗性和易感材料中存在不同程度差异,此结果对揭示小麦对菲利普孢囊线虫抗、感的分子机制有一定启示。     

低磷胁迫柱花草差异表达基因分析研究

研究柱花草在低磷条件下生长的分子机理和反应机制。采用cDNA-SRAP分子标记技术分离柱花草茎和叶在低磷胁迫下相关基因的差异表达片段,并对其进行生物信息学分析。结果表明,8对引物组合共扩增出差异片段195条,其中抑制型表达片段56条,诱导型表达片段92条,上调表达型差异片段36条,下调表达型片段11条,大小均在50~1000 bp之间。二次扩增后将特异性条带回收后进行测序,通过BLAST比对,共比对出14条差异片段的同源序列,其中8个差异表达的核苷酸序列与已知功能基因（JCVI-FLLj-1K4未知mRNA、NBS-LRR型抗病蛋白、ATP合成酶、醛固酮还原酶、叶绿体RF2）有较高同源性,5个序列与假定基因或预测基因（UPF0051蛋白、蛋白酶启动子、SCEI结合酶、吲哚-3-丙酮酸盐单氧酶）同源性较高。本研究为筛选柱花草响应低磷胁迫的差异基因提供参考。     

橡胶树HbWRKY3的克隆及其响应逆境胁迫的表达分析

通过RACE技术扩增获得橡胶树HbWRKY3基因,并对该基因及其所编码氨基酸序列进行生物信息学分析和响应逆境胁迫的表达分析,结果表明：该基因含有2个WRKYGQK结构域和2个C2H2锌指结构,属于WRKY基因家族第Ⅰ类;由4个外显子和3个内含子组成,DNA序列全长3 780 bp;开放阅读框长度为2 211 bp,编码由737个氨基酸组成的多肽。该基因定位于细胞核中,在橡胶树叶片、树皮、花、胶乳等不同组织中都有表达,以花中的表达水平最高。盐、PEG、茉莉酸、水杨酸等非生物胁迫均可诱导HbWRKY3的表达,但干旱、ABA、乙烯和低温胁迫的诱导较为明显。     

橡胶树胶乳WRKY家族转录因子HbWRKY27基因的克隆与表达分析

从巴西橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳中克隆了1个WRKY转录因子家族成员基因,命名为HbWRKY27,该基因含有1个1 266 bp的开放阅读框(ORF),编码422个氨基酸。生物信息学分析结果表明,HbWRKY27含有1个WRKY保守结构域和1个C2H2锌指结构基序,属于II类WRKY家族成员,与大豆、油棕、麻风树、葡萄和拟南芥的WRKY27蛋白的同源性分别为81%、74%、63%、62%和58%。酵母转化试验表明,HbWRKY27具有转录激活活性。实时荧光定量RT-PCR分析显示,HbWRKY27基因在健康橡胶树树皮组织中表达量最高,但在死皮橡胶树树皮组织中的表达量随着死皮程度的增加而下降,而在死皮橡胶树胶乳中HbWRKY27基因表达量则随着死皮程度的增加而升高;割胶、乙烯利和茉莉酸甲酯刺激都可显著促进胶乳HbWRKY27基因上调表达。转录因子HbWRKY27可能在割胶和乙烯等调控橡胶树胶乳代谢中发挥重要作用,并且还可能与橡胶树死皮病的发生相关。