昆明犬IGF-1基因CDS区克隆、生物信息学分析及组织表达研究

试验旨在系统研究昆明犬胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）基因的结构和功能，揭示该基因的组织表达规律，为探讨工作犬体型及生长发育性状提供基本数据。以昆明犬为试验材料，运用分子克隆技术扩增IGF-1基因CDS区，应用生物信息学方法进行序列同源性比对并构建系统进化树；获得对应的氨基酸序列并分析蛋白理化特性及蛋白亚细胞结构、亲疏水性和磷酸化位点，利用SOPMA和SWISS-MODEL软件预测蛋白二级结构并构建蛋白质三级结构模型；同时利用实时荧光定量方法检测该基因在昆明犬各组织的表达情况。结果显示，昆明犬IGF-1基因CDS区长462 bp，编码153个氨基酸，其核苷酸序列与家犬的同源性较高（100%），与小鼠和鸡的同源性较低（82.6%和81.2%）。IGF-1蛋白分子质量和理论等电点分别为16.97 ku和9.36，属亲水性分泌型蛋白，无跨膜结构，存在信号肽区域（第1-48位氨基酸）；亚细胞定位分析表明，IGF-1蛋白主要分布于细胞核（56.5%）及线粒体（17.4%）中；磷酸化位点分析发现，IGF-1蛋白存在15个磷酸化位点；该蛋白的二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。组织表达显示，IGF-1基因在昆明犬不同组织中均有表达，尤其在脾脏、肝脏及肾脏中呈现高表达。本试验结果为今后深入研究IGF-1基因功能提供了理论参考，并为深入探讨IGF-1基因对昆明犬生长发育性状研究提供一定的基础资料。     

蛋鸡OCX-32、OVA基因多态性及其与蛋品质性状的关联分析

试验旨在研究卵钙蛋白-32（ovocalyxin-32,OCX-32）、卵清蛋白（ovalbumin,OVA）基因多态性与蛋品质性状的关联性,寻找与蛋鸡蛋品质性状相关的分子遗传标记。采用PCR-SSCP技术对海兰褐蛋鸡父母代中OCX-32、OVA基因的多态位点进行检测,使用SPSS 22.0软件将不同基因型与海兰褐蛋鸡蛋品质性状进行关联分析,并进一步在子代中验证,寻找优势基因型。结果显示,OCX-32基因第6外显子中检测到AA、BB和CC 3种基因型,2个突变位点,分别位于7 018和7 116 bp;OVA基因第5外显子中检测到AA、BC、BB 3种基因型,2个突变位点位于4 296和4 323 bp。关联分析结果表明,海兰褐蛋鸡父母代OCX-32基因AA基因型的蛋黄重极显著高于BB和CC基因型（P < 0.01）;海兰褐蛋鸡父母代OVA基因AA基因型的哈氏单位及蛋白高度极显著高于BC基因型（P < 0.01）,显著高于BB基因型（P < 0.05）,AA基因型蛋白重显著高于BC基因型（P < 0.05）。在子代中验证进一步确定了OCX-32基因的AA基因型为调控蛋黄重的优势基因型,OVA基因的AA基因型为调控哈氏单位、蛋白高度和蛋白重的优势基因型。综上所述,OCX-32及OVA基因对蛋品质性状有一定影响,可作为蛋鸡的分子育种标记。     

肉鸡养殖场中耐药相关基因散播情况的调查研究

为研究耐药相关基因在肉鸡养殖场中的分布流行情况，本研究以河北省肉鸡养殖场待出栏肉鸡为研究对象，采用随机抽样方式采集肉鸡泄殖腔拭子样品264份，粪便污染地面样品9份，进行bla_NDM、bla_OXA、bla_CTX-M、armA、fexA、cfr、mcr-1、qnrS 8种耐药基因和int1、ISCR1 2种与耐药基因散布密切相关基因的实时荧光定量PCR检测。结果显示，10种基因在273份样品中均有不同程度检出，检出率在4.03%~97.07%之间，检出率最低的为armA基因，最高的为int1基因；样品中有基因共存情况，并以3种耐药基因共存的情况最多，有4份样品存在1种耐药基因，6份样品未检出任何耐药基因，没有样品共存8种耐药基因；通过数据分析，共得到41种不同的耐药基因谱型，其中常见的耐药基因谱型为bla_CTX-M-fexA-mcr-1和bla_OXA-bla_CTX-M-fexA-cfr-mcr-1-qnrS；分析发现样品携带两种及以上耐药基因时，与耐药基因散布相关的int1和ISCR1元件检出率越高，耐药基因在样品中检出的种类越多；耐药基因bla_OXA、bla_CTX-M、fexA、cfr、mcr-1、qnrS与int1基因的共存有统计学意义（P<0.05）；耐药基因bla_NDM、bla_OXA、bla_CTX-M、fexA、cfr、qnrS与ISCR1元件的共存有统计学意义（P<0.05）。本研究为畜牧兽医养殖行业耐药性监测工作提供了基于样品的新型实时荧光定量PCR检测方法，为有效预防耐药菌、耐药基因产生、控制耐药性的快速传播提供了可靠的数据支持。     

布鲁氏菌侵染对类泛素SUMO-1表达的影响及类泛素SUMO-1慢病毒表达载体的构建

研究布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7后类泛素SUMO-1的表达变化,并构建小鼠类泛素SUMO-1基因过表达的慢病毒载体。本试验分别利用布鲁氏菌16M、M5-90侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,利用实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测细胞中类泛素SUMO-1的表达;利用DNA重组技术将类泛素SUMO-1基因片段插入到慢病毒表达载体pLEX-MCS 中,获得重组慢病毒质粒pLEX-SUMO-1,测序鉴定成功后转染293T 细胞,包装好的慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,并利用实时荧光定量PCR、Western blotting方法分别检测细胞中类泛素SUMO-1 mRNA及蛋白表达水平。结果表明,布鲁氏菌16M、M5-90侵染细胞后,在感染早期类泛素SUMO-1的表达受到抑制,12 h内呈现下降趋势,在12 h后开始上升,极显著高于正常水平(P < 0.01);测序结果证明,类泛素SUMO-1基因正确插入到pLEX-MCS 质粒中;实时荧光定量PCR方法检测表明,类泛素SUMO-1 mRNA转录水平上调。由此可见,布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7能够引起细胞内类泛素SUMO-1表达的改变;成功构建了类泛素SUMO-1慢病毒过表达载体,为进一步研究类泛素SUMO-1的功能奠定基础。     

大长杂交猪DJ-1基因克隆、生物信息学及表达分析

【目的】克隆大长杂交猪DJ-1基因CDS区并进行生物信息学分析,探讨DJ-1基因在猪脂肪组织中的表达规律,为后续探究该基因在猪脂肪沉积中的功能奠定基础。【方法】以大长杂交猪腹股沟皮下脂肪组织cDNA为模板,PCR扩增DJ-1基因CDS区,利用在线工具对DJ-1蛋白进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR检测DJ-1基因在大长杂交猪、大白猪（瘦肉型猪）和莱芜猪（脂肪型猪）脂肪组织中的表达量,并比较表达差异。【结果】大长杂交猪DJ-1基因CDS区全长570 bp,编码189个氨基酸。系统进化树分析表明,大长杂交猪和牛亲缘关系最近,与斑马鱼亲缘关系最远。DJ-1蛋白分子质量为19.94 ku,是一种稳定的酸性、亲水性蛋白,且含有1个GAT_1超家族成员Thij结构域;无信号肽和跨膜结构域,具有21个磷酸化位点、4个N-糖基化修饰位点和1个O-糖基化修饰位点。DJ-1蛋白二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲组成,占比分别为42.86%、17.99%、7.94%和31.22%,三级结构预测结果与其一致。蛋白互作分析发现,DJ-1蛋白可能与SOD2、NDUFV2、SNCA、BCL2L1和MAP3K等蛋白存在相互作用。实时荧光定量PCR结果表明,DJ-1基因在大长杂交猪背膘、腹股沟脂肪和肾周脂肪组织中均有表达,但无显著差异（P>0.05）;且在大白猪脂肪组织中的表达量显著或极显著低于莱芜猪（P<0.05;P<0.01）。【结论】本研究成功克隆了大长杂交猪DJ-1基因CDS区,其编码蛋白属稳定的酸性、亲水性蛋白,在莱芜猪脂肪组织中的表达量显著或极显著高于大白猪。本试验结果为进一步研究猪DJ-1基因功能提供理论参考。     

河流型水牛TGF-β基因家族鉴定及其胚胎发育早期的表达分析

本研究旨在鉴定河流型水牛中转化生长因子-β （transforming growth factor-β，TGF-β）基因家族成员，分析该家族成员在胚胎发育早期的表达情况，并讨论其可能的作用。根据人类中已鉴定的TGF-β基因家族信息，通过BLASTP在河流型水牛全基因组层面鉴定TGF-β家族成员，同时对牛、山羊和小鼠的TGF-β家族信息进行鉴定，结合5个物种中的TGF-β基因家族信息构建系统进化树。根据河流型水牛胚胎发育早期4个阶段（2-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚期）的RNA-seq数据分析，通过FPKM（Fragment of Per Kilobase of exon model per Million mapped reads）值计算TGF-β家族成员的表达情况。结果显示，根据人类中的33个TGF-β基因，分别在河流型水牛、牛、山羊和小鼠的基因组中鉴定出32、23、32和26个TGF-β基因，几个物种中TGF-β基因家族成员数量相近且在系统进化树中分布均匀，说明该家族在各个物种中具有分布和功能的保守性。在河流型水牛的32个TGF-β基因中，21个TGF-β基因家族成员在胚胎发育早期不表达或极低剂量表达，6个分化抑制因子低剂量表达，5个高表达的TGF-β基因均有报道过与繁殖过程相关，说明在河流型水牛的胚胎发育早期只有部分成员（5/32）参与其中行使功能，绝大多数的TGF-β基因（27/32）并没有参与其中。本研究结果为河流型水牛中TGF-β基因家族研究提供了数据基础，并为TGF-β基因家族在胚胎发育早期的功能研究提供了理论依据。     

Diseases associated with spontaneous feline leukemia virus (FeLV) infection in cats

More than 2000 cats sent for necropsy in order to provide a diagnosis were investigated immunohistologically using paraffin sections for the presence of a persistent infection with feline leukemia virus (FeLV). The spectrum of neoplastic and non-neoplastic diseases associated significantly with FeLV infection was determined statistically. Three-quarters of the cats with persistent FeLV infections died of non-neoplastic diseases and about 23% died of tumors, nearly exclusively those of the leukemia/lymphoma disease complex. A strong association with liver degeneration, icterus and a FeLV-associated enteritis was found in addition to the known association with non-neoplastic diseases and conditions such as anemia, bacterial secondary infections and respiratory tract inflammations due to the immunosuppressive effect of FeLV, hemorrhages and feline infectious peritonitis. Surprisingly, diseases and conditions like feline infectious panleukopenia, enteritis (of other types than FeLV-associated enteritis and feline infectious panleukopenia), glomerulonephritis, uremia and hemorrhagic cystitis were not associated with persistent FeLV infection. Another unexpected finding was that most pathogenic infectious agents demonstrated in the cats were not FeLV-associated either. Thus, immunosuppression due to FeLV infection seems to make the animals susceptible to certain pathogenic infectious agents, but not to the majority.     

Cloning of Pig ZO-1 Gene and Screening on its Effective shRNA Fragments

The aim of this study was to screen effective shRNA fragments targeting pig zonula occludens-1 (ZO-1) gene,which would lay foundation to further explore its function in pig oocytes in vitro maturation (IVM) by RNAi technology.Pig ZO-1 gene was cloned and its eukaryotic expression vector was constructed,its effective shRNA fragments were screened.The results showed that the CDS length of cloned pig ZO-1 gene was 3 036 bp.The results of sequence multialigned showed that the sequence of pig ZO-1 gene shared 88%,88%,87% and 85% homology with Taurus,Ovis aries, Equns caballus and Homo sapiens,respectively.Clear RFP red fluorescent was observed in transfected cells with the pDsRed-N1-ZO-1 eukaryotic expression plasmid transfected into HEK293T cells by X-tremeGENE HP DNA transfection reagent.Two shRNA fragments targeting pig ZO-1 gene were designed and synthesized,weaker RFP red fluorescent was observed in co-transfected cells with the target and interfered shRNA plasmid groups.The Real-time PCR results showed that the two designed shRNAs could effectively inhibit the expression of pig ZO-1 mRNA,shRNA201 fragment had significantly higher inhibition effect than that of shRNA1276 fragment (77.8% and 67.0%,P < 0.05).     

猪紧密连接蛋白1基因克隆及其shRNA片段的筛选

试验旨在筛选有效抑制猪紧密连接蛋白1 (zonula occludens-1,ZO-1)基因表达的shRNA干扰片段,为后期利用RNA干扰技术深入了解ZO-1基因在猪卵母细胞成熟过程中的功能奠定基础。本研究首先克隆了猪ZO-1基因,并构建了其真核表达载体,而后筛选了有效抑制ZO-1基因表达的shRNA干扰片段。结果表明,猪ZO-1基因编码区长度为3 036 bp,多重序列比对结果显示,猪ZO-1基因核苷酸序列与牛、羊、马和人相应序列的同源性分别为88%、88%、87%和85%。构建的pDsRed-N1-ZO-1真核蛋白融合表达载体经脂质体法转染HEK293T细胞后,可观察到清晰的RFP红色荧光蛋白表达。将靶质粒与shRNA干扰质粒共转染HEK293T细胞48 h后,与对照组相比,可观察到红色荧光表达得到抑制。实时荧光定量PCR结果显示,设计合成的2条shRNA对猪ZO-1基因表达均有抑制效果,其中ZO-1 shRNA201的抑制效果显著高于ZO-1 shRNA1276 (77.8%和67.0%,P < 0.05)。     

术苦芩总多糖对湿热泄泻仔猪肠道菌群和免疫功能的影响

旨在探究术苦芩总多糖(ZKQPs)对湿热泄泻仔猪肠道菌群和免疫功能的影响。通过HPLC分析ZKQPs的单糖组成,体外抑菌试验研究ZKQPs体外对常见肠道致病菌的直接影响,同时建立仔猪腹泻模型,用白头翁散(PP)及3种剂量的ZKQPs (25、50和75 mg·kg^-1)治疗腹泻仔猪,治疗结束后,收集小肠各段组织、盲肠内容物,对菌落进行鉴定与计数;通过16S rDNA高通量测序分析肠道菌群的变化,测定小肠免疫相关细胞因子mRNA表达。结果显示:ZKQPs一级结构主要由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖构成。在体外试验中,大肠杆菌、沙门菌、猪源产气荚膜梭菌肠道常见有害菌对ZKQPs敏感,并在一定范围内呈现浓度依赖性。动物试验中,ZKQPs有效促进了腹泻仔猪肠道乳酸杆菌的生长,对致病大肠杆菌生长有较强的抑制作用,其中,50 mg·kg^-1ZKQPs影响最为显著。16S rDNA高通量测序结果表明,ZKQPs调节了腹泻仔猪菌群Alpha多样性,对肠道菌群在纲和属水平上有显著影响,腹泻仔猪芽胞杆菌纲、乳酸杆菌属相对丰度显著下降,梭菌纲相对丰度显著上升;ZKQPs治疗后芽胞杆菌纲、乳酸杆菌属相对丰度均显著上升且高于正常值,梭菌纲相对丰度极显著下降,显著改善了腹泻仔猪肠道菌群结构。仔猪腹泻时,小肠各段Th1细胞因子IL-2 mRNA水平上升(P<0.01),Th2细胞因子IL-4、IL-5 mRNA水平均下降;ZKQPs治疗后,腹泻仔猪小肠各段IL-2 mRNA水平下降,IL-4、IL-5 mRNA水平普遍上升,且不同细胞因子mRNA水平在小肠不同位置变化有所差异,50和75 mg·kg^-1ZKQPs治疗后对其影响最为显著,综合分析50 mg·kg^-1ZKQPs治疗腹泻仔猪对细胞因子mRNA水平影响最大。综上表明,ZKQPs在体外对常见肠道致病菌生长具有良好的抑制作用,可以改变腹泻仔猪肠道微生物群的丰富度和多样性,提高乳酸杆菌属的相对丰度,并改善菌群结构,同时调节肠道免疫反应,有效增强了仔猪抗腹泻能力。     

猪肾上皮细胞SLA-1基因的克隆及分子结构特征分析

【目的】 利用猪肾上皮细胞15(PK15)建立系统的猪白细胞抗原1(SLA-1)抗原表位筛选系统。【方法】 提取PK15细胞总RNA,设计特异性引物,应用RT-PCR方法扩增SLA-1基因(SLA-1*PK15),将该基因克隆到pMD18-T载体上,并进行双酶切及测序鉴定;利用DNAMAN 5.2.2、Mega 5.0、Multalin及同源建模进行系统进化树、二级结构、三级结构分析。【结果】 RT-PCR扩增获得约1 400 bp条带,质粒提取和酶切鉴定结果表明SLA-1成功插入pMD18-T载体;测序结果证实该基因共1 419 bp,其中2－1 087 bp为编码区,共编码361个氨基酸,信号肽为21个氨基酸,符合SLA-1基因特征。进化树分析结果显示,SLA-1*PK15与SLA-1*wxd(中国梅山猪)和SLA-1*0401(中国巴马小型猪)进化关系最近,而与SLA-1*lr02(丹麦长白猪)及SLA-1*0509(中国西藏野猪)进化关系较远。胞外区氨基酸比较分析表明,PK15细胞SLA-1基因与其他SLA-1基因胞外区主要变异位点存在于α1区和α2区,α3区的变异位点较少,无特征性氨基酸变异位点。PK15细胞SLA-1蛋白的二级结构主要以α-螺旋和β-折叠为主。同源建模结果显示,SLA-1蛋白具有SLA class Ⅰ典型的三级结构,α1区和α2区构成抗原多肽结合区。【结论】 SLA-1基因稳定存在于PK15细胞,PK15细胞具有作为SLA-1抗原表位筛选系统的潜在应用价值。     

绵羊痒螨巨噬细胞迁移抑制因子重组蛋白对兔外周血单个核细胞Th1/Th2型和Th17/Treg型特征因子表达的影响

为了初步探讨绵羊痒螨巨噬细胞迁移抑制因子（PoMIF）对健康新西兰兔外周血单个核细胞（PBMC）中Th1/Th2和Th17/Treg细胞平衡的变化。采用RT-PCR从绵羊痒螨总RNA中扩增得到MIF全长基因，经原核表达、纯化重组PoMIF（rPoMIF）蛋白，并分析其氧化还原酶和互变异构酶活性。筛选与健康新西兰兔PBMC孵育的最佳rPoMIF浓度，且用最佳浓度rPoMIF（0.2 μg·mL^-1）与PBMC共同孵育0、1、6、12、24、36 h后收集细胞，用荧光定量PCR检测其Th1/Th2/Th17/Treg细胞相对应的特征性转录因子T-bet/GATA-3/RORc/Foxp3和特征性细胞因子IFN-γ/IL-4/IL-17A/IL-10 mRNA表达变化。结果表明：PoMIF全长363 bp，rPoMIF大小为32 ku（含pET32a标签蛋白19 ku），且具有互变异构酶活性；rPoMIF刺激后PBMC中Th1细胞的T-bet和IFN-γ先下降后上升，Th2细胞的GATA-3和IL-4均呈下降趋势，且T-bet/GATA-3和IFN-γ/IL-4比值在12、24和36 h均升高；Th17细胞的RORc和IL-17A在各时间点下降，而Treg细胞的Foxp3和IL-10在各时间点升高，且RORc/Foxp3和IL-17A/IL-10比值在各时间点均变低。rPoMIF可造成家兔外周血单个核细胞的Th1/Th2和Th17/Treg平衡分别向Th1和Treg偏移。     

牦牛AIF-1蛋白表达及对巨噬细胞炎性因子mRNA的影响

旨在对牦牛同种移植炎症因子-1(allograft inflammatory factor-1,AIF-1)蛋白进行原核表达、纯化,并探讨其对巨噬细胞炎性因子的影响。采用q-PCR检测AIF-1基因在牦牛5种组织中的表达量,构建原核表达载体表达纯化AIF-1蛋白,q-PCR检测小鼠巨噬细胞4种炎性因子的表达量。结果表明,AIF-1基因在麦洼牦牛脾中表达水平最高,极显著高于其它组织(P<0.01)。表达并纯化出约29.47 ku的AIF-1重组蛋白,1.0、10.0、100.0μg·mL^-1 AIF-1蛋白均能促进小鼠巨噬细胞IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS的表达。这表明AIF-1在巨噬细胞免疫应答中发挥着一定作用,为深入研究牦牛AIF-1功能提供参考。     

HMGB1与日本血吸虫病肝炎症和纤维化的相关性分析

旨在探究高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1,HMGB1）与日本血吸虫病肝炎症和纤维化的相关性,本研究将BALB/c小鼠随机分为空白对照组（n＝10）,感染后4周组、6周组和HMGB1抑制剂组（n＝5）,进行血常规及生化检测,观察肝病理学及Masson染色情况、荧光定量PCR检测HMGB1、IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ、α-SMA、Col1α1、TGF-β1、Smad2和Smad3的转录水平。结果显示：感染后4周,小鼠谷丙转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、肝组织HMGB1、α-SMA、TGF-β1、IL-6和 TNF-α的转录水平均显著或极显著升高（P<0.05或P < 0.01）;感染后6周,小鼠WBC、Neu、Mon、Eos、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）和ALT极显著升高（P<0.01）,肝组织HMGB1、IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ、α-SMA、Col1α1、TGF-β1、Smad2和Smad3的转录水平均显著或极显著升高（P<0.05或P<0.01）;感染后6周小鼠肝虫卵聚积处伴有炎性细胞浸润和胶原纤维增生;HMGB1抑制剂可显著降低小鼠血清ALT值和肝组织HMGB1、α-SMA、TGF-β1、IL-6和TNF-α的转录水平（P<0.05）。综上表明,HMGB1与日本血吸虫病肝炎症和纤维化具有一定相关性。     

Bta-miR-677靶向线粒体抗病毒信号蛋白影响Ⅰ型干扰素的生成

旨在探究bta-miR-677调控Ⅰ型干扰素（IFN）表达的分子机制。将bta-miR-677转染MDBK细胞,检测Ⅰ型IFN和干扰素刺激基因（ISGs）的转录水平;随后通过TargetScan预测bta-miR-677的靶基因,双荧光素酶报告基因系统、qRT-PCR和Western blot验证bta-miR-677的靶基因;利用siRNA敲减验证靶基因对Ⅰ型IFN转录的影响。结果显示,过表达bta-miR-677组IFN-α/β的转录水平高于对照组2~4倍（P<0.001）,随后检测到6种ISGs（IFI6、OAS1Y、OAS1Z、RSAD2、MX1和MX2）转录量上调2~16倍（P<0.01或P<0.001）;反之,抑制表达bta-miR-677组IFN-α/β转录量下调（P<0.01或P<0.05）,同时IFI6、OAS1Y、OAS1Z、RSAD2、MX1和MX2转录量下调（P<0.05或P<0.01）。经TargetScan预测和双荧光素酶报告基因系统、qRT-PCR和Western blot检测显示,bta-miR-677可靶向结合线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）的3'-UTR,抑制MAVS蛋白的表达;MAVS基因敲减后发现,IFN-α、IFN-β和6种ISGs转录量上调。研究结果表明,bta-miR-677通过靶向MAVS上调IFN-α/β转录水平,进而提高ISGs的表达量,为基于bta-miR-677研制抗病毒药物提供了重要资料。