猪A群轮状病毒SCJY-13株的分离鉴定及致病性分析

【目的】 在从腹泻仔猪粪便中分离鉴定猪A群轮状病毒(Rotavirus group A, RVA)并了解其致病性。【方法】 应用MA-104细胞从仔猪腹泻粪便中分离鉴定RVA, 将其经口感染健康初生仔猪, 观察其临床症状, 并利用实时荧光定量PCR检测排毒、HE染色观察病理变化、免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)试验了解病毒分布。【结果】 分离到1株可引起MA-104细胞明显细胞病变的G9P[23] RVA, 命名为RVA/Pig-tc/CHN/SCJY-13/2017/G9P[23](简称SCJY-13株), 病毒滴度为10^5.5 TCID₅₀/100 μL。经口感染SCJY-13株的仔猪在感染后11 h出现腹泻, 持续到感染后165 h完全恢复, 其发病率为100%(7/7), 病死率为28.57%(2/7)。感染后8 h可从仔猪肛拭子检测到病毒核酸, 直至感染后192 h, 峰值出现在感染后24 h。感染后54 h各段小肠病毒载量达到最高, 其中回肠中病毒载量最高, 显著高于十二指肠、空肠(P<0.05);HE染色和IHC检测结果显示, SCJY-13在感染仔猪小肠的绒毛及隐窝中大量聚集, 尤其是回肠段; SCJY-13株感染引起十二指肠、空肠和回肠绒毛固有层大量淋巴细胞浸润、黏膜上皮细胞和肠绒毛尖端空泡变性、柱状细胞增多、绒毛断裂脱落等, 以回肠段较严重。【结论】 SCJY-13株能引起新生仔猪100%发病, 其主要靶位区在回肠, 感染后排毒时间长。本试验结果为猪RVA的致病性研究提供了一定的参考依据。     

实验性流行性腹泻仔猪小肠粘膜上皮细胞及肠系膜淋巴结的超微结构

给8头生后3d的哺乳仔猪经口感染猪流行性腹泻病毒(PEDV)“吉”毒株,于感染后18、30、45和96h各扑杀2头,以透射电镜和扫描电镜观察了小肠粘膜上皮细胞及肠系膜淋巴结的超微结构。结果表明,小肠上皮细胞的病变因感染时间不同而有明显差异。上皮细胞的脱落和残留上皮细胞超微结构的破坏,以感染后30h最严重,病毒在这些上皮细胞内的增殖最显著。感染后45h,见有大量新生上皮细胞修补损伤的肠绒毛。感染后96h,小肠绒毛短缩、粗大乃至发生融合。实验仔猪肠系膜淋巴结内巨噬细胞和淋巴细胞的超微结构均遭到破坏,在巨噬细胞内见有PED冠状病毒粒子。     

某规模化猪场暴发仔猪轮状病毒感染致腹泻的诊断

为调查贵州省铜仁市某规模化猪场仔猪腹泻大量死亡的病因,采用流行病学调查、临床症状观察、病理解剖诊断、细菌分离培养及采集肛门拭子样品提取核酸,并进行猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒和猪德尔塔冠状病毒的RT-PCR检测,结果显示:导致该猪场大量仔猪腹泻死亡的原因为猪轮状病毒感染。     

猪轮状病毒试验接种无菌猪的肠道变化

象幼儿腹泻一样,轮状病毒也是数种动物,诸如犊牛、乳鼠、羔羊以及雏鸡腹泻的原因。在澳大利亚、英国、比利时、美国也有轮状病毒引起的仔猪腹泻的报告。经试验研究确定了轮状病毒可以引起自然宿主腹泻及其在小肠内产生病变。该病变是由立方或鳞状上皮细胞被复的萎缩绒毛构成的。应用免疫萤光抗体和透射电镜技术可以在小肠上皮细胞中分别检出轮状病毒抗体和病毒颗粒。本文的目的是描述应用光学显微镜,扫描电镜和透射电镜技术观察猪轮状病毒感染小猪肠道的变化。     

人工感染PRV仔猪不同组织器官病毒分布及排毒规律研究

为了研究伪狂犬病毒在猪体不同组织部位的分布和对外排毒规律,将14头50日龄仔猪随机分为实验组(10头)和对照组(4头)。实验组肌内注射半数致死为10~(6.5) TCID_(50)/mL PRV 2 mL,记录不同时间猪只的临床症状,并采用RT-PCR法对攻毒后不同时期各组织器官及血液、鼻拭子、肛门拭子的病毒载量进行研究。结果显示,PRV感染后12 h,试验猪只表现为体温升高、食欲不振、精神萎靡、咳嗽、打喷嚏等症状,攻毒后第3天逐渐出现神经症状;PCR检测表明PRV在体内分布较广,以淋巴结、肺脏、脑组织中病毒载量最高;攻毒不同时期病毒载量的变化规律为先上升后下降的趋势,以第7天或第14天病毒载量最高;对外排毒由高到低依次为鼻拭子、血液、肛门拭子,排毒时间持续35 d。通过研究PRV的分布规律和对外排毒规律,对于揭示PR的发病机制具有重要意义。     

人工感染PRRSV JXA1株仔猪肾脏组织病理变化及病毒分布

为了解感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)仔猪肾脏组织的主要病变和病毒主要分布的细胞类型,试验取人工感染PRRSV JXA1株的仔猪肾脏组织制作石蜡切片,采用HE染色法观察其病理变化,采用免疫组织化学方法检测病毒GP5蛋白和N蛋白在肾脏组织内的分布。结果表明,感染仔猪的肾脏组织呈现广泛性充血和出血,大量的炎症细胞浸润;感染仔猪肾脏组织的免疫组织化学染色,PRRSV GP5蛋白和N蛋白呈广泛性阳性着色,阳性细胞包括肾小球毛细血管内皮细胞、肾小管周围毛细血管内皮细胞、肾小管上皮细胞和肾间质等。说明PRRSV感染仔猪病毒粒子能够侵入肾脏组织,感染肾血管内皮细胞和肾小管上皮细胞等。     

猪轮状病毒江西株AY01的分离鉴定

【目的】确定江西省某猪场哺乳仔猪发生腹泻的病因。【方法】对送检的仔猪小肠样品进行猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)的RT-PCR检测,将阳性样品接种MA104细胞传代进行PoRV的分离;对分离毒株进行电镜观察、间接免疫荧光试验、PoRV VP4和VP7基因序列测序和动物回归等试验。【结果】猪小肠病料样品经终浓度15 μg/mL的胰酶处理37 ℃孵育2 h,接种MA104细胞,能在细胞上增殖传代,第6代开始表现稳定的细胞病变;电镜观察可见病毒粒子直径大小为61~70 nm,平均大小为65 nm,呈带有短纤突且外缘光滑的形似车轮状的粒子,具有轮状病毒粒子典型的形态特征;间接免疫荧光试验和RT-PCR检测均为PoRV阳性,确定该分离株为PoRV。分离株VP4和VP7基因序列分析显示,VP4基因型与P[23]基因型相似性最高,VP7基因型与G5基因型相似性最高,根据A群轮状病毒最新分类方法,分离株属于G5P[23]型。动物回归试验结果显示,经口感染该分离株的1日龄初生仔猪于感染后24 h左右陆续出现水样腹泻、呕吐等临床症状,并能在粪便中检测到PoRV。【结论】通过MA104细胞连续传代,从江西某猪场的腹泻仔猪小肠样品成功分离到1株PoRV,该分离株属于G5P[23]型PoRV,为哺乳仔猪发生腹泻的病原。     

断奶前仔猪经胎盘感染猪圆环病毒2型对猪流行性腹泻病毒引起的肠炎的影响

本文报道了经胎盘感染猪圆环病毒2型对猪流行性腹泻病毒引起新生仔猪肠炎的影响。6头怀孕母猪被随机分为感染组和对照组,每组3头。感染组3头怀孕母猪在分娩前3周鼻内接种6mLPCV2组织培养毒(病毒含量为1.2×105TCID50/mL,毒株为SNUVR000470);对照组3头怀孕母猪同时接种正常细胞培养上清液。PCV2感染母猪所产的30头仔猪被随机分为A、B两组,每组15头;对照组非感染母猪所产的30头仔猪被随机分为C、D两组,每组15头。A和C组仔猪在3日龄口服2mLPEDV第3次传代病毒液(病毒含量为1×106.5TCID50/mL,毒株为SNUVR971496)。在感染后36、48和72h测量绒毛高度与隐窝深度的平均比值,A组PCV2感染母猪所产的仔猪感染PEDV与C组PCV2阴性母猪所产的仔猪感染PEDV差异显著。在感染后24h,A组PEDV感染仔猪的空肠组织中比C组检测到更多的PEDV核酸。此后,在感染后36、48、60和70h,C组PCV2阴性母猪所产的PEDV感染仔猪的空肠组织中比A组检测到更多的PEDV核酸。由此推断,经胎盘感染PCV2显著影响PEDV所致疾病的临床进程。     

猪轮状病毒的分离与鉴定

将疑似感染猪轮状病毒的内蒙古某猪场的腹泻仔猪粪便样品在MA104细胞上分离培养,得到一株能产生明显细胞病变的毒株(命名为PRV L1株).经纯净性检测,该毒株无菌生长、无支原体污染及外源病毒污染.特异性检测结果显示该PRV L1株能被猪轮状病毒单特异性血清中和,并可被猪轮状病毒单克隆抗体识别,其VP7基因序列与G5型猪轮状病毒VP7基因序列同源性为99％.动物回归试验结果表明,该毒株口服攻击3日龄仔猪,可引起典型的猪轮状病毒病发病症状,并能在发病仔猪小肠内容物中检测到猪轮状病毒.     

断奶腹泻仔猪小肠病理变化观察

目的:研究断奶腹泻仔猪小肠病变,以期为临床防治断奶仔猪腹泻提供理论依据.方法:断奶腹泻仔猪及健康仔猪各4头,处死后观察小肠病变及通过显微测微尺测定小肠绒毛高度和隐窝深度.结果:(1)腹泻仔猪小肠发生广泛充血、出血,黏膜上皮细胞变性、坏死和大量炎性细胞浸润;(2)腹泻仔猪十二指肠、空肠、回肠的小肠绒毛出血率均极显著高于健康组(P<0.01);(3)腹泻仔猪空肠绒毛高度均显著低于健康组(P<0.05),隐窝深度显著高于健康组(P<0.05),绒毛高度/隐窝深度值极显著小于健康组(P<0.01).结论:断奶仔猪腹泻造成小肠严重的病变和功能障碍.     

猪轮状病毒的分离与电镜观察

近年来,北京地区猪轮状病毒感染,不仅严重威胁养殖业的发展,同时威胁到肉食品和人类的安全。取胶体金抗原检测为阳性的2头哺乳仔猪病料用Marc-145细胞培养,分离到1株轮状病毒,连续盲传至4代出现细胞病变,用Marc-145细胞进行病毒噬斑纯化,挑取单克隆病毒株扩大培养后,将病毒感染Marc-145细胞7 d后,应用Reed-Muench法计算轮状病毒TCID50为106.6/0.1 mL,用感染细胞超薄切片进行电镜观察,可见典型的晶格状排列的轮状病毒粒子,为轮状病毒感染的诊断提供了科学依据。     

猪流行性腹泻的病理学研究——人工感染仔猪病理组织学及小肠病理组织化学研究

给8头3日龄同窝仔猪经口感染猪流行性腹泻病毒“吉”毒株的猪胎肠单层细胞培养物,于感染后在第18、30、45、96h扑杀,进行病理组织学和病理组织化学研究。病理组织化学(硷性磷酸酶、ATP酶、琥珀酸脱氢酶、单胺氧化酶)的变化早于病理组织学变化。组织学变化以小肠绒毛上皮细胞脱落、绒毛短缩为特征,其中以空肠中,后部的肠绒毛变化最严重;临床症状与病理变化呈正相关,感染后24～36h,实验仔猪呕吐、腹泻最明显,而感染30h扑杀的实验仔猪,小肠绒毛短缩,上皮细胞脱落最严重。作者认为,初期腹泻主要是小肠绒毛柱状上皮能量生成不足,吸收和运输障碍所致;而后期则是肠绒毛柱状上皮能量生成不足,吸收表面积严重减少,绒毛柱状上皮严重变性导致的消化不良共同作用的结果。     

PRRSV感染仔猪肾组织的超微病理变化分析

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是能引起仔猪高死亡率的疾病,给养猪业带来极大的经济损失。本研究对PRRSV感染仔猪肾组织的病毒定位及产生的超微病理变化进行观察,以期了解PRRSV对肾组织细胞以及血液循环的影响。主要采用透射电镜技术结合血清生化检测、免疫组织化学染色（IHC）,对仔猪感染PRRSV后肾组织进行超微病理学观察及分析。结果发现,PRRSV感染后引起肾组织损伤,病毒主要分布于肾小球、坏死的肾小管上皮细胞胞质及巨噬细胞胞质内;肾小球内足细胞足突广泛融合或微绒毛化,内皮细胞肿胀;肾小管上皮细胞线粒体肿胀、嵴断裂、溶解;间质炎性细胞浸润。PRRSV通过巨噬细胞内复制随血液扩散至肾组织,引起损伤;根据透射电镜观察结果,足细胞足突融合,肾小球血管内皮细胞损伤引起微血栓形成,说明PRRSV感染仔猪后影响了肾小球滤过率,同时,对肾血液微循环系统造成损伤。本研究为阐明PRRSV的感染致病机制提供理论基础。     

猪萨佩罗病毒原位杂交检测方法的建立

为了直观、原位且特异性的检测猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus,PSV)在感染仔猪后器官和组织中病毒核酸的分布,本研究根据GenBank中PSV的5′端非编码区基因的保守序列设计并合成1对引物,利用PCR地高辛探针合成的方法制备成原位杂交检测探针,建立了PSV原位杂交组织切片检测的方法。应用该方法检测PSV感染仔猪小肠组织,结果表明阳性信号主要存在与在于肠绒毛上皮细胞和固有层淋巴细胞中,阴性对照无显色。该方法可以用于组织切片中的PSV核酸的定位,为猪萨佩罗病毒在感染仔猪后器官和组织中病毒核酸分布及致病机理研究奠定基础。     

中药复方颗粒剂对断奶腹泻仔猪小肠黏膜超微结构的影响

为研究中药颗粒剂对断奶腹泻仔猪小肠黏膜超微结构的影响,选择（28±1）d、体重10.04 kg左右的杜长大三元杂种断奶腹泻仔猪18头,随机分为抗生素治疗组和中药复方颗粒剂治疗组,每组3个重复,每个重复3头猪。两组分别于用药后14 d每组随机抽取3头猪颈动脉放血处死,腹腔解剖观察病理变化,无菌采集小肠黏膜进行细胞学观察。结果显示,中药复方颗粒剂治疗组小肠黏膜除有少量出血外,未发现明显病理变化。抗生素治疗组小肠黏膜脱落,有广泛充血、出血;黏膜上皮细胞变性坏死;嗜酸性粒细胞浸润,有大量以淋巴细胞（LELs）、杯状细胞（GSs）为主的炎性细胞浸润;微绒毛排列紊乱,脱落;细胞受损严重,线粒体等细胞器结构异常。表明抗生素治疗仔猪腹泻造成小肠黏膜显著的病理变化和功能障碍,而中药复方颗粒剂治疗有利于仔猪小肠黏膜结构的修复。     

猪德尔塔冠状病毒感染对初生仔猪小肠杯状细胞数量及Hes1和MUC2表达的影响

旨在探讨猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）感染仔猪对小肠杯状细胞（goblet cell,GC）的影响,将6头未吃初乳的初生仔猪静养2 d后随机分为感染组（n=3）和对照组（n=3）,感染组仔猪口服接种5 mL 1×10⁵ TCID₅₀·mL^-1 PDCoV-CHN-HG-2017毒株,对照组仔猪口服5 mL DMEM培养基。感染组仔猪分别在口服接种后22、39和70 h出现明显腹泻、脱水和嗜睡等临床症状,及时实施安乐死并采集小肠组织样品;对应时间点分别选取对照组1头仔猪实施安乐死并采集小肠组织样品。采用HE染色、PAS染色和AB染色观察小肠组织病理学变化和GC数量变化。采用荧光定量PCR和ELISA分别检测初生仔猪小肠组织中发状分裂相关增强子1（Hes1）和黏蛋白2（MUC2）的转录和含量的变化。结果显示,感染组仔猪与对照组仔猪相比小肠各段黏膜结构均有不同程度损伤,绒毛长度降低且差异显著（P<0.05）,VH：CD的比值降低且差异显著（P<0.05）。PAS染色与AB染色结果一致,小肠各段GC数量均有不同程度减少且差异显著（P<0.05、P<0.01或P<0.001）。感染组仔猪与对照组仔猪相比小肠各段Hes1 mRNA的转录量和含量均升高,在空肠和回肠中Hes1 mRNA转录量差异显著（P<0.01或P<0.05）,在十二指肠和回肠中Hes1含量差异显著（P<0.01）。感染组仔猪与对照组仔猪相比小肠各段MUC2 mRNA的转录量和含量均降低,在十二指肠和回肠中差异显著（P<0.05、P<0.01或P<0.001）。结果表明,PDCoV感染初生仔猪后引起小肠GC数量明显减少。PDCoV感染仔猪可能通过激活肠道Notch信号通路下游靶基因Hes1表达来阻碍小肠中GC形成和分泌,导致GC数量减少和MUC2表达降低。     

一例高致病性猪蓝耳病、猪流行性腹泻混合感染的诊断

2018年11月,湖南郴州某规模化猪场发生2~3日龄仔猪呕吐、腹泻为主的疫情,发病率70%,死亡率80%,为确定引起仔猪腹泻的原因,从发病猪群中采集2头病死猪的小肠、肺脏、淋巴结等组织进行PCR检测及基因测序分析。检测结果显示猪流行性腹泻和猪蓝耳病均为阳性,猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒均为阴性。测序分析显示所检测到的猪蓝耳病病毒与JXA1毒株高度同源,为高致病性毒株,检测到的猪流行性腹泻病毒为变异毒株,隶属于GⅡ-b群。综合分析,引起此次新生仔猪大批死亡系变异猪流行性腹泻病毒混合感染高致病性猪蓝耳病所致。     

重组猪干扰素α对急性病毒性腹泻仔猪肾脏损伤的保护作用研究

为研究重组猪干扰素α(rPoIFNα)在人工感染仔猪病毒性腹泻模型上对肾脏损伤的保护作用,选取10日龄健康三元哺乳仔猪15头,随机分为rPoIFNα治疗组(使用剂量100万单位/头)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染对照组和正常对照组,每组5头仔猪。rPoIFNα治疗组和感染对照组仔猪经口饲喂PEDV悬液4 mL(接种量为4.0×10~(5.5) TCID_(50)/头),正常对照组仔猪同步饲喂4 mL生理盐水,建立PEDV致哺乳仔猪病毒性腹泻模型。模型建立结果显示,攻毒后72 h,感染对照组仔猪全部出现腹泻、脱水等典型病毒性腹泻症状,仔猪小肠及肾脏病料组织的PEDV核酸检测为阳性。同时发现,该组仔猪血肌酐水平显著升高(P0.05),尿比重较其他两组偏高,并检测出颗粒管型和尿蛋白。镜下HE染色病理学观察到肾间质组织中出现嗜酸性粒细胞,提示超敏反应参与对肾脏的损伤。rPoIFNα治疗组仔猪症状轻微且易恢复,PEDV核酸检测阳性率仅为30%。仔猪相关血液及病料组织样本检测结果显示,rPoIFNα对PEDV感染仔猪治疗有效率达到60%。试验表明,rPoIFNα可有效治疗PEDV感染引起的仔猪腹泻,同时对肾脏具有明显保护作用。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒在人工感染仔猪体内侵染过程和分布规律的研究

为研究血凝性脑脊髓炎病毒(HEY)在人工感染仔猪体内的侵袭过程和分布规律,本实验采用滴鼻的方式感染5头1日龄未食初乳仔猪,并在感染后每隔24 h迫杀1头仔猪,采集鼻黏膜、气管、口腔黏膜、舌、食管、胃、肠、心肌、肝、脾、肺、肾、各段脊髓和脑等组织脏器制作切片,通过间接免疫组织化学方法检测HEV在仔猪体内的动态侵袭过程.此外,采用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法检测病毒在各组织脏器中的分布情况.结果显示:感染病毒后2 d～3 d,仔猪出现精神沉郁、全身震颤等中枢神经系统症状,免疫组织化学检测可见病毒抗原首先出现于脑桥,并进一步蔓延至延髓和各段脊髓,最后进入小脑浦肯野氏细胞和大脑皮层锥体细胞中;Real-time PCR检测结果显示病毒广泛分布于大脑皮层、脑桥、延髓、脊髓和小脑等中枢神经系统的组织中,其中大脑皮层的检出率最高.     

猪流行性腹泻的防治体会

猪流行性腹泻是由冠状病毒引起的严重影响猪群健康的急性接触性肠道传染病,病毒在小肠上皮细胞内增殖,引起小肠上皮细胞变性,细胞功能障碍绒毛脱落,不但影响营养物质的消化和吸收,而且由于肠道内容物高渗引起组织液外渗,使仔猪腹泻和脱水死亡。疾病恢复后生长缓慢,对猪场的生产造成重大损失。