猪流行性腹泻病毒HBMC2012株的分离鉴定及其致病性研究

为从腹泻仔猪肠道内分离鉴定猪流行性腹泻病毒(PEDV)并明确其致病性,本文研究应用Vero-81细胞从腹泻仔猪小肠及其内容物中分离鉴定了一株PEDV(HBMC2012株),分析了其遗传变异特征,并将该病毒分离株经口腔感染5头3 d健康初生仔猪,观察其临床表现和病理变化,检测病毒在组织中的分布,分析病毒血症和经粪便排毒的动态。结果显示,分离的PEDV HBMC2012株可以引起明显的细胞病变,与目前国内及美国流行的PEDV株同源性高,与2010年之前的国内流行PEDV株、欧洲株CV777和韩国株DR13同源性低。该病毒株可以导致仔猪出现PED典型的临床症状与病理变化,病毒主要分布于空肠后端、回肠和十二指肠黏膜上皮细胞内,病毒血症和粪便排毒至少持续14 d。该研究结果为PEDV的致病机制和弱毒疫苗研究奠定了基础。     

断奶腹泻仔猪小肠病理变化观察

目的:研究断奶腹泻仔猪小肠病变,以期为临床防治断奶仔猪腹泻提供理论依据.方法:断奶腹泻仔猪及健康仔猪各4头,处死后观察小肠病变及通过显微测微尺测定小肠绒毛高度和隐窝深度.结果:(1)腹泻仔猪小肠发生广泛充血、出血,黏膜上皮细胞变性、坏死和大量炎性细胞浸润;(2)腹泻仔猪十二指肠、空肠、回肠的小肠绒毛出血率均极显著高于健康组(P<0.01);(3)腹泻仔猪空肠绒毛高度均显著低于健康组(P<0.05),隐窝深度显著高于健康组(P<0.05),绒毛高度/隐窝深度值极显著小于健康组(P<0.01).结论:断奶仔猪腹泻造成小肠严重的病变和功能障碍.     

猪轮状病毒的致病性试验

为了对引起北京地区仔猪腹泻的轮状病毒进行致病性研究,购买未采食母乳的初生仔猪6头,分成2组,试验组3头仔猪口服并皮下注射三代细胞病毒1 m L,观察其临床症状;分别在感染前及感染后24、48、72、96 h等采集肛门拭子,RT-PCR检测病毒抗原,观察排毒情况;取感染5 d后的小肠、肝、脾等组织,观察病理学变化。结果显示:试验仔猪感染12 h,肛门拭子即可检测到轮状病毒,一直持续到第5天。组织切片观察发现,仔猪小肠上皮细胞及周围绒毛发生变性,上皮细胞变圆、肿胀、核肿大,细胞边缘不规则。变性细胞从基质脱落至管腔,萎缩绒毛被扁平上皮细胞覆盖,固有层有少量细胞碎片。     

猪轮状病毒江西株AY01的分离鉴定

【目的】确定江西省某猪场哺乳仔猪发生腹泻的病因。【方法】对送检的仔猪小肠样品进行猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)的RT-PCR检测,将阳性样品接种MA104细胞传代进行PoRV的分离;对分离毒株进行电镜观察、间接免疫荧光试验、PoRV VP4和VP7基因序列测序和动物回归等试验。【结果】猪小肠病料样品经终浓度15 μg/mL的胰酶处理37 ℃孵育2 h,接种MA104细胞,能在细胞上增殖传代,第6代开始表现稳定的细胞病变;电镜观察可见病毒粒子直径大小为61~70 nm,平均大小为65 nm,呈带有短纤突且外缘光滑的形似车轮状的粒子,具有轮状病毒粒子典型的形态特征;间接免疫荧光试验和RT-PCR检测均为PoRV阳性,确定该分离株为PoRV。分离株VP4和VP7基因序列分析显示,VP4基因型与P[23]基因型相似性最高,VP7基因型与G5基因型相似性最高,根据A群轮状病毒最新分类方法,分离株属于G5P[23]型。动物回归试验结果显示,经口感染该分离株的1日龄初生仔猪于感染后24 h左右陆续出现水样腹泻、呕吐等临床症状,并能在粪便中检测到PoRV。【结论】通过MA104细胞连续传代,从江西某猪场的腹泻仔猪小肠样品成功分离到1株PoRV,该分离株属于G5P[23]型PoRV,为哺乳仔猪发生腹泻的病原。     

猪德尔塔冠状病毒CH7328株的致病性及全基因组序列分析

为了解猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV） CH7328株的致病性,并分析其基因变异和遗传演变规律,试验通过病毒培养、间接免疫荧光试验（IFA）、病毒生长曲线及仔猪致病性试验鉴定病毒的生长特性和致病性,并分析该毒株的全基因组序列。结果显示,感染PDCoV CH7328株的ST细胞出现肿大变圆、细胞呈碎玻璃状且拉丝、细胞集聚成簇和脱落等病变。IFA结果显示,PDCoV CH7328株主要分布在细胞质中。生长曲线结果显示,PDCoV CH7328株在6 h就已开始增殖,在36 h时达到峰值,对应的TCID₅₀为10^-8.0/mL,随后逐渐下降。仔猪致病性结果显示,攻毒组仔猪出现腹泻、脱水和厌食等临床症状,仔猪小肠明显变薄、透明而充盈,小肠绒毛严重脱落、萎缩或减少、肠绒毛细胞坏死等。粪便病原检测结果显示,在攻毒第2天便能检测到病毒,之后排毒持续增加,而正常对照仔猪无任何临床现象。全基因组测序及序列分析显示,PDCoV CH7328株的基因组全长为25 420 bp,与国内GD株的相似性最高,达到99.9%;遗传演化结果显示,PDCoV CH7328株与国内HKU15-155、CHN-HN-2014和GD株处在同一进化分支,亲缘关系最近。本研究结果为中国PDCoV疫苗候选株的筛选及猪场疫病防控提供了参考数据和理论依据。     

猪流行性腹泻的病理学研究——人工感染仔猪病理组织学及小肠病理组织化学研究

给8头3日龄同窝仔猪经口感染猪流行性腹泻病毒“吉”毒株的猪胎肠单层细胞培养物,于感染后在第18、30、45、96h扑杀,进行病理组织学和病理组织化学研究。病理组织化学(硷性磷酸酶、ATP酶、琥珀酸脱氢酶、单胺氧化酶)的变化早于病理组织学变化。组织学变化以小肠绒毛上皮细胞脱落、绒毛短缩为特征,其中以空肠中,后部的肠绒毛变化最严重;临床症状与病理变化呈正相关,感染后24～36h,实验仔猪呕吐、腹泻最明显,而感染30h扑杀的实验仔猪,小肠绒毛短缩,上皮细胞脱落最严重。作者认为,初期腹泻主要是小肠绒毛柱状上皮能量生成不足,吸收和运输障碍所致;而后期则是肠绒毛柱状上皮能量生成不足,吸收表面积严重减少,绒毛柱状上皮严重变性导致的消化不良共同作用的结果。     

槲皮素对PEDV感染幼龄仔猪肠道形态、抗氧化功能及空肠脂质代谢基因表达的影响

【目的】 通过研究槲皮素对猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染仔猪肠道形态、肠道抗氧化功能及空肠脂质代谢相关基因相对表达量的影响,旨在探讨槲皮素对PEDV感染仔猪肠道的保护作用。【方法】 选取18头健康的7日龄断奶仔猪,随机分为3组：对照组、PEDV组和槲皮素＋PEDV组,每组6个重复,每个重复1头猪。试验期8 d,于试验第0~7天,对槲皮素＋PEDV组仔猪每天口腔灌服10 mg/kg BW的槲皮素,其余组灌服等体积的人工奶。于试验第5天晚上给PEDV组和槲皮素＋PEDV组仔猪口腔灌服10^4.5TCID₅₀的PEDV,对照组仔猪灌服相同体积的PBS溶液。于试验第8天早上屠宰,取仔猪十二指肠、空肠、回肠及结肠组织样品进行检测。【结果】 与对照组相比,PEDV组仔猪空肠和回肠的绒毛高度以及绒毛高度与隐窝深度比值极显著降低（P<0.01）,空肠、回肠和结肠中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和总超氧化物歧化酶（T-SOD）的活力显著降低（P<0.05）,十二指肠、空肠、回肠和结肠中过氧化氢酶（CAT）的活力显著降低（P<0.05）,回肠和结肠中丙二醛（MDA）的含量显著升高（P<0.05）,空肠中载脂蛋白A1（APOA1）、载脂蛋白B （APOB）、载脂蛋白C2（APOC2）、脂肪酸结合蛋白2（FABP2）、酰基辅酶A合成酶长链家族成员3（ACSL-3）和脂肪酸合酶（FASN）基因的相对表达量极显著下调（P<0.01）。与PEDV组相比,槲皮素＋PEDV组仔猪空肠和回肠的绒毛高度以及绒毛高度与隐窝深度比值极显著提高（P<0.01）,空肠、回肠和结肠中GSH-Px和T-SOD的活力显著提高（P<0.05）,十二指肠、空肠和结肠中CAT的活力显著提高（P<0.05）,回肠和结肠中MDA的含量显著降低（P<0.05）,空肠中APOB、FABP2和FASN基因的相对表达量极显著上调（P<0.01）。【结论】 添加槲皮素可有效缓解PEDV感染导致的仔猪肠道损伤,提高仔猪肠道抗氧化能力以及空肠脂质代谢的能力。     

枯草芽孢杆菌对大肠杆菌K88感染仔猪小肠健康的影响

试验主要探讨饲粮中添加枯草芽孢杆菌对大肠杆菌K88感染仔猪小肠发育和微生物区系的影响。选取体重(6.8±0.5)kg的杜长大三元杂种去势公仔猪8头,随机区组均分为2组,每组4个重复,每头猪单栏饲养,对照组饲喂基础饲粮,试验组饲喂基础饲粮+0.1%枯草芽孢杆菌制剂,饲养试验结束前每头猪灌服致病性大肠杆菌K88菌液(1×1011 CFU)。试验结果表明,试验组仔猪比对照组显著提高空肠和回肠绒毛高度(P0.05),显著降低回肠部位隐窝深度(P0.05),极显著提高十二指肠、空肠和回肠绒毛高度/隐窝深度(P0.01);显著降低空肠和回肠大肠杆菌数量(P0.05),显著增加空肠和回肠乳酸杆菌数量(P0.05)。结果提示,在仔猪感染致病性大肠杆菌K88时,饲粮添加枯草芽孢杆菌能有利于调节仔猪小肠发育和肠道微生物区系。     

猪流行性腹泻流行病学研究进展

<正>猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染引起的一种以急性腹泻、呕吐、严重脱水为主要临床症状的急性、高度传染性、高致死性病毒性肠道传染病。PEDV可感染各年龄段的猪,以哺乳仔猪最易感,经口鼻感染后病毒直接进入小肠,在肠绒毛上皮细胞增殖进而对细胞器造成损伤,导致的细胞功能障碍引起肠黏膜细胞坏死、肠绒毛脱落,从而引起腹泻,脱水,小肠臌气、扩张、积液等临床症状,严重者可导致仔猪死     

4株鸽源沙门氏菌致病性观察

为了解分离自四川地区的鸽源沙门氏菌的致病性,本研究先将分离的4株沙门氏菌,腹腔注射SPF昆明鼠,测定其半数致死量(LD50),再依据小鼠攻毒试验结果,选取致病性较强的纽波特沙门氏菌菌株,通过灌胃方式接种信鸽来观察对信鸽的致病性.结果显示:甲型副伤寒沙门氏菌、纽波特沙门氏菌、伯里沙门氏菌、基桑加尼沙门氏菌的LD50分别为3.37×10^6、2.49×10^7、5.46×10^7、3.58×107 CFU;感染鼠的肝脏、脾脏、肾脏及小肠有明显的炎性病变;纽波特沙门氏菌可造成感染鸽的肝脏、肺脏、肾脏和胰腺纤维素样变性及炎性细胞浸润等病变,回肠、空肠、盲肠的肠绒毛结构不完整、绒毛上皮脱落,绒毛及肌层有不同程度的炎性细胞浸润.以上结果表明,4株分离的沙门氏菌对试验鼠有一定的致病性,纽波特沙门氏菌可造成信鸽气囊等组织器官损伤,继而影响其飞行能力.本研究为鸽源沙门氏菌尤其是纽波特沙门氏菌的致病性研究提供一定的理论参考,具有公共卫生学意义.     

猪德尔塔冠状病毒感染对初生仔猪小肠杯状细胞数量及Hes1和MUC2表达的影响

旨在探讨猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）感染仔猪对小肠杯状细胞（goblet cell,GC）的影响,将6头未吃初乳的初生仔猪静养2 d后随机分为感染组（n=3）和对照组（n=3）,感染组仔猪口服接种5 mL 1×10⁵ TCID₅₀·mL^-1 PDCoV-CHN-HG-2017毒株,对照组仔猪口服5 mL DMEM培养基。感染组仔猪分别在口服接种后22、39和70 h出现明显腹泻、脱水和嗜睡等临床症状,及时实施安乐死并采集小肠组织样品;对应时间点分别选取对照组1头仔猪实施安乐死并采集小肠组织样品。采用HE染色、PAS染色和AB染色观察小肠组织病理学变化和GC数量变化。采用荧光定量PCR和ELISA分别检测初生仔猪小肠组织中发状分裂相关增强子1（Hes1）和黏蛋白2（MUC2）的转录和含量的变化。结果显示,感染组仔猪与对照组仔猪相比小肠各段黏膜结构均有不同程度损伤,绒毛长度降低且差异显著（P<0.05）,VH：CD的比值降低且差异显著（P<0.05）。PAS染色与AB染色结果一致,小肠各段GC数量均有不同程度减少且差异显著（P<0.05、P<0.01或P<0.001）。感染组仔猪与对照组仔猪相比小肠各段Hes1 mRNA的转录量和含量均升高,在空肠和回肠中Hes1 mRNA转录量差异显著（P<0.01或P<0.05）,在十二指肠和回肠中Hes1含量差异显著（P<0.01）。感染组仔猪与对照组仔猪相比小肠各段MUC2 mRNA的转录量和含量均降低,在十二指肠和回肠中差异显著（P<0.05、P<0.01或P<0.001）。结果表明,PDCoV感染初生仔猪后引起小肠GC数量明显减少。PDCoV感染仔猪可能通过激活肠道Notch信号通路下游靶基因Hes1表达来阻碍小肠中GC形成和分泌,导致GC数量减少和MUC2表达降低。     

Effect of experimentally-induced villus atrophy on adhesion of K88ac-positive Escherichia coli in just-weaned piglets

Three- to four-week-old, just-weaned piglets were infected with transmissible gastroenteritis (TGE) virus and the next day with K88ac+ enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). Histological examination of caudal jejunum and ileum of piglets killed 2-3 days after virus challenge (1-2 days after ETEC infection) revealed severe villus atrophy especially in the jejunum compared with controls (P less than 0.05). Four-5 days after TGE virus infection villus length increased and after 7 days it was near normal. Villi scraped from jejunal and ileal mucosa of the piglets were incubated in vitro with K88ac+ E. coli and the number of bacteria adhering to 250 micron villus brush border was counted. Attachment of bacteria to villi of piglets killed 2-3 days after TGE virus infection was significantly decreased in comparison with adhesion to villi of non-infected piglets or of piglets killed 7 days after the virus infection. Correlation between in vitro adhesion and villus height was 0.6649 (P less than 0.001). The results suggest that the experimentally-induced villus atrophy was attended with a temporarily diminished susceptibility of villus enterocytes to adhesion of K88ac+ E. coli.     

幼龄仔猪PEDV感染肠道损伤模型的建立

试验旨在建立猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染幼龄仔猪肠道损伤模型。试验选用16头7日龄健康幼龄仔猪（杜×长×大）,随机分为两个处理组：对照组和PEDV组,每个处理8个重复,每个重复1头猪。试验期为10 d,试验期间两个处理组饲喂相同的基础日粮。于试验第7天晚上对PEDV组仔猪口腔灌服PEDV病毒（剂量为10^4.5 TCID₅₀）,对照组灌服等量的生理盐水。于试验第10天早上空腹灌服D-木糖（0.1 g/kg体重）,1 h后前腔静脉采血,屠宰取样,取十二指肠、空肠、回肠等组织样品,测定平均日增重（ADG）、腹泻率（DR）、肠道形态结构、肠道黏膜损伤相关基因mRNA水平。试验结果表明：①PEDV感染显著降低了仔猪ADG（P<0.05）,极显著提高了仔猪腹泻率（P<0.01）;②PEDV感染极显著降低了血浆D-木糖含量、空肠和回肠绒毛高度、十二指肠、空肠和回肠绒毛高度与隐窝深度的比值（P<0.01）,显著提高了十二指肠和空肠隐窝深度（P<0.05）;③PEDV感染极显著提高了仔猪空肠黏膜PEDV M基因的相对表达量（P<0.01）,极显著降低了肠绒毛蛋白（villin）和肠型脂肪酸结合蛋白（i-FABP）基因的相对表达量（P<0.01）。以上结果表明,口腔灌服PEDV可以成功诱导建立幼龄仔猪肠道损伤模型。     

宫内发育迟缓仔猪小肠形态和屏障功能相关基因的表达特征

为了研究宫内发育迟缓(IUGR)仔猪小肠形态和屏障功能相关基因的表达特征,选取24窝"长白×大白"杂交新生仔猪,每窝选取1头IUGR仔猪和1头正常出生体重(NBW)仔猪,分别于7、21和28日龄屠宰8头IUGR仔猪和8头NBW仔猪,采集小肠样品进行分析.结果表明:1)与NBW仔猪相比,IUGR仔猪7日龄时空肠绒毛高度、...     

Enterovirus Neutralizing Activity in the Gastrointestinal Tract of Piglets

Neutralizing activity against porcine enterovirus strain T80 was demonstrated in the contents of the stomach, duodenum or ileum of four piglets which were suckling dams whose milk contained neutralizing substances against the same virus. No neutralizing activity was detected in the gastrointestinal contents of an unsuckled piglet or in four weaned piglets. Extracts of intestinal tissue from each of the above piglets failed to neutralize the virus. Four weaned piglets were dosed orally with live T80 virus. From nine days after infection virus neutralizing activity was found in extracts of tissue prepared from the duodenum, jejunum, ileum, caecum and colon but not in the contents of the gastrointestinal tract and a serological response to the virus was demonstrated. No virus neutralizing activity was detected in gastrointestinal tissue or contents from four weaned piglets inoculated parenterally with live T80 virus or in four piglets dosed orally with inactivated T80 virus and these piglets did not respond serologically to the virus.     

槲皮素对PEDV感染幼龄仔猪的生长性能、血液生化指标和肠道吸收与屏障功能的影响

【目的】 试验旨在探讨槲皮素在防治仔猪感染猪流行性腹泻病毒（PEDV）中的作用。【方法】 选取18头体重相近、健康的7日龄仔猪（杜×长×大）,随机分为3组（对照组、PEDV组和PEDV+槲皮素组）,每组6个重复,每个重复1头猪,试验期共11 d。经过3 d适应期后,于试验第4~10天给PEDV+槲皮素组仔猪口腔灌服10 mg/kg BW的槲皮素,其他组仔猪口腔灌服等体积的人工乳,于试验第8天给PEDV组与PEDV+槲皮素组仔猪口腔灌服1×10^4.5TCID₅₀的PEDV,对照组灌服等体积的PBS溶液。试验第11天早上空腹称重,全部仔猪灌服D-木糖（0.1 g/kg BW）,1 h后经前腔静脉采血,检测血液生化指标、血浆二胺氧化酶（DAO）活性和D-木糖含量;将所有仔猪屠宰取空肠黏膜,检测肠道屏障相关基因,包括肠绒毛蛋白（villin）,紧密连接蛋白-1（claudin-1）,闭合蛋白（occludin）和肠型脂肪酸结合蛋白（iFABP）的相对表达量。【结果】 与对照组相比,PEDV组仔猪平均日增重显著下降（P<0.05）,粪便评分显著升高（P<0.05）;血液中高密度脂蛋白含量显著降低（P<0.05）,肌酐和尿素氮的含量显著提高（P<0.05）;血浆中D-木糖含量显著降低（P<0.05）;空肠claudin-1、iFABP基因的相对表达量显著下调（P<0.05）。与PEDV组相比,PEDV+槲皮素组仔猪平均日增重和血浆D-木糖含量显著升高（P<0.05）;血液中肌酐和尿素氮的含量显著降低（P<0.05）;空肠claudin-1、villin和iFABP基因的相对表达量显著上调（P<0.05）。【结论】 10 mg/kg BW槲皮素可在一定程度上缓解PEDV感染导致的仔猪生长抑制和肾功能损伤,增强肠道吸收与屏障功能。     

水牛初乳粉和常乳粉对新生仔猪小肠组织形态结构的影响

本试验旨在研究水牛初乳粉、常乳粉对0～72 h新生仔猪小肠组织形态结构发育的影响。试验以新生仔猪为研究对象,分别饲喂水牛初乳粉（SCR组）、水牛常乳粉（SC组）、葡萄糖盐水（PY组）,以0日龄新生仔猪（XD组）作为对照。结果表明,水牛初乳粉使新生仔猪小肠绒毛密集、粗壮、排列整齐,肌层厚度、固有膜厚度增加。SCR组与XD组相比,十二指肠绒毛高度、绒毛宽度、固有膜厚度和空肠绒毛宽度、肌层厚度及回肠绒毛高度均极显著增加（P＜0.01）;SCR组与PY组相比,十二指肠绒毛宽度及空肠绒毛宽度、肌层厚度均极显著增加（P＜0.01）。水牛常乳粉使新生仔猪小肠黏膜受损,黏膜上皮脱落,肌层变薄,固有膜裸露,小肠绒毛坍塌、稀疏变短。SC组与XD组相比,十二指肠肌层厚度和空肠绒毛高度、绒毛宽度、肌层厚度、固有膜厚度及回肠绒毛宽度、固有膜厚度均呈降低趋势,但差异均不显著（P＞0.05）;SC组与PY组相比,空肠肌层厚度显著降低（P＜0.05）。综上所述,水牛初乳粉能显著促进新生仔猪小肠发育,尤其对空肠影响最大,其次为十二指肠,而对回肠的影响相对较小;水牛常乳粉不能对新生仔猪肠黏膜形成保护并促进其生长发育,在新生仔猪最初发育的72 h内其价值不如葡萄糖盐水。     

Pathogenesis of intestinal cryptosporidiosis in conventional and gnotobiotic piglets.

The pathogenesis of intestinal cryptosporidiosis was studied in 52 conventionally reared and 20 gnotobiotically reared piglets by inoculation with different doses of Cryptosporidium parvum oocysts. The prepatent period of C. parvum in both groups of animals were variable, depending on the number of oocysts administered. The patent period of C. parvum in conventionally reared piglets was 8 or 9 days; in gnotobiotic piglets cryptosporidia were found in feces until Day post infection (DPI) 16, when the last piglet was necropsied. Cryptosporidiosis in conventionally reared piglets is a self-limited diarrheal disease associated with morphological changes within the intestine. The most severe lesion was seen in the posterior jejunum and ileum from DPI 3 to DPI 7, and consisted of villous atrophy, crypt hyperplasia and inflammatory infiltration in the lamina propria. In gnotobiotic piglets cryptosporidia induced severe enterocolitis which occurred at least until DPI 16. The characteristics of enteric lesions were similar to those found in conventionally reared piglets. Intestinal cryptosporidiosis in both groups of animals shifted in the course of infection in the caudal direction and terminated in the large intestine. Examination by scanning electron microscope showed that infected absorptive cells had thicker and longer microvilli than those on non-infected cells; neighboring non-infected cells were hypertrophic, bulbously protuberant with minute microvilli with no distinct intercellular borders. Numerous cryptosporidia in the heterotopic glandular epithelium in the submucosa of cecum and colon on DPI 9 and 10 were found. No differences in the location and degree of cryptosporidial infection between colostrum-fed and colostrum-deprived conventionally reared piglets were found. Sow's colostrum does not appear to protect piglets from C. parvum infection. The role of intestinal microflora in the pathogenesis of cryptosporidiosis in piglets is discussed.