猪链球菌病二联灭活疫苗生产菌株的筛选及培养条件的优化

1997年以来上海地区猪链球菌病的主要致病菌群为马链球菌兽疫亚种和猪链球菌2型，通过动物试验，从l0株马链球菌兽疫亚种和猪链球菌2型分离株中筛选出毒力强、免疫原性好的ATCC35246和HA9801株，作为制备疫苗用的生产菌株。对3种不同培养基、血清浓度、葡萄糖浓度、静置和振荡培养、培养基预热等对细菌生长的影响进行了比较。结果表明，用含有2％犊牛血清、0．2％葡萄糖的改良马丁肉汤培养基较为合适；温度对细菌生长的影响很大，培养基接种前预热可以提高细菌产量；振荡培养对细菌生长的影响不大。     

猪链球菌病的病原分离鉴定及防制措施研究

为了更好地防制猪链球菌病,从沈阳市多个地区疑患猪链球菌病的病死猪中分离到9株链球菌,通过细菌分离鉴定确定这9株链球菌中有1株为猪链球菌,其它8株为马链球菌兽疫亚种;致病性试验结果表明,9株均具有致病性;药敏试验筛选出了对各菌株高敏的药物;选择2株链球菌制备疫苗并免疫仔猪,结果证明有较好的免疫原性,可以作为疫苗株预防猪链球菌病。     

猪链球菌2型毒力因子与MLST分型分析

为了解我国猪链球菌2型毒力因子和MLST型的特点,对四川、重庆和山东等地的22株猪链球菌2型进行毒力因子检测和ST型分析。结果显示,78%(17/22)的分离株为sly+mrp+epf+基因型的强毒株,仅山东省的5株分离株为弱毒力型。四川省和重庆市89%(15/17)的分离株为毒力较强的ST7型,而山东省的分离株均为毒力稍弱的ST1型。结合这些地区的猪链球菌病发病情况,分析提示猪链球菌2型的毒力因子和ST分型与菌株的致病性有一定的相关性。     

鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗生产用菌株的筛选

为了筛选免疫原性良好的鸡传染性鼻炎灭活疫苗生产用菌株，本试验对分离的5株A型、3株B型和3株C型副鸡禽杆菌的致病性和免疫原性进行分析。首先通过毒力试验筛选毒力较强的菌株，对筛选出的菌株进行最小发病剂量测定，再将最小发病剂量定为攻毒剂量，进行免疫原性分析和最小抗原含量测定。毒力试验结果显示，11株分离株均具有较强的毒力，从中筛选出毒力较强的A型菌2株(HN3株和HB2株)、B型菌2株(HN5株和SD4株)和C型菌2株(HN1株和SD3株)。最小发病剂量测定结果显示，A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株毒力最强，最小发病剂量分别约为2.0×10⁴、1.8×10³和2.3×10³CFU。免疫原性分析和最小抗原含量测定结果显示，A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株具有良好的免疫原性，不仅可以抵抗同源菌株的攻击，还能对同血清型异源菌株提供良好的保护，免疫后血清HI抗体效价和阳性比例均较高，且与攻毒保护相关性较好，A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株的最小抗原含量分别为5.0×10⁸、1.0×10<...     

重庆地区表观健康猪中猪链球菌的检测

本研究旨在调查重庆地区表观健康猪的猪链球菌带菌情况,并揭示健康猪群携带猪链球菌的公共卫生学意义。随机采集重庆市17个区县(市)定点屠宰场表观健康猪的腭扁桃体1 360份,进行猪链球菌的分离鉴定,并对致病性较强的1、2、7、9、14型及1/2型进行分型与毒力因子分析。结果共分离到225株猪链球菌,分离率为16.54%;检出猪链球菌2型4株,猪链球菌7型3株,猪链球菌9型3株,猪链球菌1/2型1株;毒力因子谱分析发现多数(10/11)分离株缺失部分毒力因子,但也存在具有全部已知毒力因子的强毒株,且在国内首次检出小片段mrp型猪链球菌1/2型1株和7型2株。结果提示,重庆地区健康猪群带菌现象普遍,且流行菌株具有与国外不同的特点,对屠宰场工作人员健康造成威胁。     

屠宰场猪链球菌分离菌株分型及其致病性和耐药性分析

为了解吉林省猪链球菌的流行情况,从屠宰场采集的猪咽拭子和鼻拭子样品中分离鉴定猪链球菌,并进行菌株血清型、基因型和毒力表型的鉴定,以及致病性和耐药性的分析。结果表明,从100份样品中共分离鉴定猪链球菌104株,其中29株鉴定为血清2型、9型和1型等几种常见的致病性血清型,其他75株不属于常见的致病性血清型。血清2型的菌株中,2株经鉴定为ST1基因型和mrp+epf+sly+毒力型,并经动物试验鉴定为强毒菌株;其他菌株均为ST28基因型和mrp+epf-sly-毒力型,具有中等毒力。血清9型的菌株,均为mrp-epf-sly-毒力型,动物试验鉴定均为强毒菌株。根据Kirby-Bauer纸片扩散法的药敏试验结果,98%的猪链球菌分离株对四环素耐药;对大环内酯类、克林霉素和链霉素的耐药率都在50%以上;对β-内酰胺类、氯霉素和喹诺酮类抗生素的耐药率小于20%。总体分析,从屠宰场分离的猪链球菌强毒菌株所占的比例并不高,但是菌株多重耐药的情况非常严重。     

广西部分地区猪群中猪链球菌分离株的毒力基因检测及毒力测定

为了解广西部分地区(玉林市、大新县、那坡县、东兴市、靖西市和百色市)猪群中猪链球菌(Streptococcus suis,SS)毒力基因的流行情况和毒力水平,试验采用PCR方法检测分离到的201株(经鉴定猪链球菌2&1/2型24株,猪链球菌7型2株,猪链球菌9型15株,一共41株)猪链球菌的毒力基因orf2、sly、ef和mrp,并通过斑马鱼模型筛选毒力较强的菌株,测定菌株的半数致死剂量(LD₅₀)。结果表明：从广西部分地区分离的201株猪链球菌的4种毒力基因携带率从高到低依次为orf2(85.6%,172/201)>sly(55.2%,111/201)>ef(33.8%,68/201)>mrp(26.4%,53/201);6个市县主要流行的毒力基因不同,玉林市、大新县、那坡县、东兴市、靖西市和百色市分离的猪链球菌携带最多的毒力基因分别为orf2(100%)、orf2(89.2%)、orf2(91.5%)、ef(44.4%)、orf2(86.7%)、orf2(40.0%);经鉴定分型的41株猪链球菌中,有7株(17.1%,7/41)同时携...     

猪链球菌多价灭活疫苗对实验小鼠免疫效果的研究

临床分离的猪链球菌经随机扩增多态性DNA分析，挑选出4株毒力强。免疫原性好且遗传距离较远的猪链球菌作为疫苗株，研制出猪链球菌病氢氧化铝胶多价灭活疫苗。该疫苗对实验小鼠安全性好，无不良反应。实验室的小鼠免疫效力试验证实该苗的保护率为100％，优于单价灭活疫苗和猪链球菌病活疫苗。     

新疆石河子部分猪场链球菌2型的分离鉴定与毒力因子检测

为了解石河子垦区具有呼吸道病症状的病死猪感染猪链球菌2型的情况，对采集的53份肺脏组织进行了猪链球菌的分离培养、生化鉴定、PCR鉴定以及cps2J、ef、mrp毒力因子的检测。分离出猪链球菌2型21株，其中8株毒力因-T-为cps2J．10株毒力因子为ef，3毒力因子为cps2J／ef；小鼠试验表明cps2J毒力因子的菌株不具有致病性，毒力因子为ef、cps2J／ef的菌株具有致病性。得出结论，石河子部分规模猪场存在链球菌2型感染情况，且部分感染菌株具有致病性，应引起有关生猪养殖场的高度重视。     

猪链球菌3型疫苗候选菌株筛选及3＋9型二价灭活疫苗对小鼠免疫效果评估

【目的】 筛选猪链球菌血清3型疫苗候选菌株,制备猪链球菌3＋9型二价灭活疫苗并评估其在BALB/c小鼠上的免疫保护效果。【方法】 从发病猪病料中分离猪链球菌血清3型菌株,通过蜡螟幼虫和BALB/c小鼠模型筛选出强毒株作为疫苗候选菌株,并对候选菌株进行生物学特性研究。将筛选得到的3型疫苗候选菌株和前期筛选的9型疫苗候选菌株灭活浓缩,使其抗原浓度为2×10¹⁰ CFU/mL,无菌检测后将浓缩抗原液按1：1配比混合,再混合抗原与Summit Poly Solution佐剂按4：1比例混合,制备猪链球菌3＋9型二价灭活疫苗,疫苗中猪链球菌血清3和9型含菌量均为2×10⁹ CFU/mL。将制备的疫苗免疫6周龄BALB/c小鼠,首免后第14天进行二免,二免后第14天进行攻毒。同时设立商品化疫苗免疫组和阴性对照组,评估疫苗的安全性和免疫保护效果。【结果】 PCR鉴定结果显示,23株临床分离株均为血清3型猪链球菌,依次命名为KQ3-1~KQ3-23。分别通过蜡螟和小鼠进行初筛和复筛,筛选到强毒株KQ3-1。毒力基因检测显示,该菌株基因型为gapdh^＋/sly^＋/fbps^-/orf2^-/mrp^-/89K^-/gdh^＋/epf^-;生长曲线显示,该菌株在37 ℃培养8~10 h时生长达到对数生长后期;BALB/c小鼠致病性结果显示,腹腔接种12 h内可引起小鼠精神萎靡、扎堆、毛发耸立、运动迟缓、死亡等临床症状,该菌株的LD₅₀为5.2×10⁷ CFU/只。制备的疫苗免疫小鼠后,小鼠精神状况、采食等均正常,疫苗注射部位无肿胀、硬块等不良反应,无死亡发生,表明该疫苗具有良好的安全性。免疫后进行猪链球菌血清2型菌株ZYS、猪链球菌血清3型菌株KQ3-1和猪链球菌血清9型菌株YT攻毒,对照组死亡率分别为90%、100%和100%,猪链球菌3＋9型二价灭活疫苗免疫组保护率分别为30%、80%和70%,商品化疫苗组的保护效果分别为70%、0和10%。【结论】 本研究研制的疫苗能对猪链球菌血清3和9型强毒株提供良好的免疫保护,该疫苗具备疫苗市场开发的潜在价值。     

猪链球菌2型的分离鉴定及致病性试验

从全国部分猪场采集疑似猪链球菌感染病例脑样品20份进行细菌分离,成功分离到10株细菌,通过猪链球菌及血清类型鉴定,最终确定其中一株为2型猪链球菌。应用猪链球菌7种主要毒力因子特异性基因扩增检测方法检测所分离到的2型猪链球菌的毒力因子分布情况,并应用小鼠攻毒试验对其致病性进行观察研究。结果表明:分离的2型猪链球菌具备7种毒力因子;动物试验表明SS2能引起小鼠的急性败血症及脑膜炎;细菌回归试验结果表明,试验组死亡小鼠的脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏均有细菌定植,且能分离出攻毒菌。此分离菌株的研究为研制2型猪链球菌病疫苗奠定了基础。     

猪链球菌4型分离株生物学特性研究

为分析猪链球菌4型(Streptococcus suis type 4,SS4)分离株的病原生物学特性,试验对来自中国不同地区的10株猪链球菌4型进行了多位点序列分型,通过PCR方法对猪链球菌7个保守管家基因aroA、gki、dpr、mutS、recA、thrA、cpn60进行扩增,测序后将结果上传至MLST数据库查找序列型,然后制作聚类分析图来阐明菌株之间的亲缘关系;采用PCR方法对7种主要的毒力基因gdh、mrp、epf、sly、fbps、gapdh与orf2进行鉴定,通过毒力因子谱来分析猪链球菌4型毒力因子的分布;以纯化的10株细菌对BALB/c小鼠进行动物致病性试验,根据小鼠致死数量筛选出最强毒株,并进行新西兰兔致病性试验。结果显示,10株猪链球菌4型经多位点序列分型,6株为ST850型,3株为ST1006型,1株为ST94型;结合菌株分离地区分析发现,广东和江苏地区菌株有较高的同源性,江沪地区菌株出现分化现象,表现为遗传多样性;10株菌株均检测到了gdh、gapdh和orf2毒力基因,7株检测到sly基因,4株检测到fbps基因,根据毒力因子谱发现共有3个毒力基因型,gdh+sly+gapdh+orf2+型有6株,gdh+fbps+gapdh+orf2+型有3株,gdh+sly+fbps+gapdh+orf2+型仅有1株。动物致病性试验表明,10株细菌均能使BALB/c小鼠死亡,其中SH1510的半数致死量低至1×108 CFU,对小鼠的致病性最强,将纯化的SH1510菌液接种新西兰兔,可使新西兰兔出现典型的神经症状并死亡。以上结果为猪链球菌的遗传进化、毒力研究提供了新的数据,丰富了猪链球菌病的研究。     

猪链球菌4型分离株生物学特性研究

为分析猪链球菌4型(Streptococcus suis type 4,SS4)分离株的病原生物学特性,试验对来自中国不同地区的10株猪链球菌4型进行了多位点序列分型,通过PCR方法对猪链球菌7个保守管家基因aroA、gki、dpr、mutS、recA、thrA、cpn60进行扩增,测序后将结果上传至MLST数据库查找序列型,然后制作聚类分析图来阐明菌株之间的亲缘关系;采用PCR方法对7种主要的毒力基因gdh、mrp、epf、sly、fbps、gapdh与orf2进行鉴定,通过毒力因子谱来分析猪链球菌4型毒力因子的分布;以纯化的10株细菌对BALB/c小鼠进行动物致病性试验,根据小鼠致死数量筛选出最强毒株,并进行新西兰兔致病性试验。结果显示,10株猪链球菌4型经多位点序列分型,6株为ST850型,3株为ST1006型,1株为ST94型;结合菌株分离地区分析发现,广东和江苏地区菌株有较高的同源性,江沪地区菌株出现分化现象,表现为遗传多样性;10株菌株均检测到了gdh、gapdh和orf2毒力基因,7株检测到sly基因,4株检测到fbps基因,根据毒力因子谱发现共有3个毒力基因型,gdh+sly+gapdh+orf2+型有6株,gdh+fbps+gapdh+orf2+型有3株,gdh+sly+fbps+gapdh+orf2+型仅有1株。动物致病性试验表明,10株细菌均能使BALB/c小鼠死亡,其中SH1510的半数致死量低至1×108 CFU,对小鼠的致病性最强,将纯化的SH1510菌液接种新西兰兔,可使新西兰兔出现典型的神经症状并死亡。以上结果为猪链球菌的遗传进化、毒力研究提供了新的数据,丰富了猪链球菌病的研究。     

猪源链球菌的分离鉴定及生物学特性研究

通过生化试验、药敏试验、PCR分型、毒力基因的PCR检测及动物试验对分离的猪源链球菌进行药物敏感性、血清型和分子流行病学初步研究。从不同省份猪链球菌病疑似病例猪的心血、肝、淋巴结、脑和关节液组织分离出97株链球菌,药敏试验结果表明各菌株对13种抗菌素的耐药谱不同,但对先锋霉素V和环丙沙星的耐药率均低于5%。通过对分离菌株进行PCR鉴定和分型,确认26株为猪链球菌,其中1株为1型,16株为2型,4株为7型,没有9型,另5株为其它型。进一步对1型、2型和7型猪链球菌mrp、epf和sly3种毒力基因的分布情况进行了PCR检测。动物试验表明能100%致死小白鼠的猪链球菌基因型均为epf^＋mrp^＋sly^＋2型猪链球菌,1株2型和1株7型猪链球菌均能复制出典型的猪链球菌病例。     

猪链球菌2型湖南分离株4种毒力基因的序列分析

本试验对猪链球菌2型湖南分离株的cps2j、mrp、epf、sly四种毒力基因进行部分序列扩增、测序后分析,结果表明,4株2型猪链球菌均可检出这四种毒力基因,其中cps2j、epf、sly三基因与国内外报道其他分离株具有很高同源性(98%以上)。然而湖南分离株Hunan-An1、Hunan-An2、Hunan-Ping的mrp基因与其他对比菌株相比同源性低,进化关系远,有较大变异。     

猪链球菌病灭活疫苗安全性与免疫效力试验

我国学者对猪链球菌致病菌的研究证实,国内猪链球菌病的病原主要是C群和D群链球菌,而国外多由R群Ⅱ型链球菌引起猪发生败血型和脑炎型链球菌病.近年来,许多猪场的猪群经猪链球菌疫苗免疫后,猪链球菌病仍时有发生,对分离的致病菌做了分群鉴定后发现,用于免疫疫苗的疫苗株的菌群与当地的流行株不符,结果造成免疫失败.因此在做好该病病原流行株调查基础上,筛选有代表性的、免疫原性好的链球菌作为制苗的疫苗株,研制适合本地区的多价灭活疫苗,已经成为控制该病的有效手段.     

9型猪链球菌广东株的分离鉴定和基因序列分析

为了解9型猪链球菌广东分离株毒力因子基因型、基因变异和进化情况,本试验采集发病猪脑脊液、关节液、脾脏、肝脏、淋巴结进行细菌分离培养和生化鉴定,采用PCR方法鉴定其血清型及部分毒力基因,对cps9D、gdh、gapdh与orf2基因进行序列测定和分析,并构建系统发育树。结果显示,分离菌镜检为革兰氏阳性链状球菌,在鲜血琼脂平板中呈β溶血,可发酵大多数糖类,能成功扩增cps9D基因,含重要的保守基因gdh及毒力基因gapdh和orf2,表明分离菌株为9型猪链球菌。分离菌株cps9D、gdh、gapdh、orf2基因核苷酸序列与GenBank上国内外参考菌株的同源性分别为95.9%~100.0%、98.6%~99.8%、98.7%~99.6%和95.5%~99.9%,说明分离菌株与国内外其他9型猪链球菌毒株核苷酸同源性都较高,且与国内外的流行毒株基本一致,未发生太大的变异。系统发育树表明,分离株与国内外来源不同的猪链球菌分离株同源性高,亲缘关系密切。     

乳牛乳腺炎多联疫苗的研制及其临床应用效果

从全国各地奶牛场采集的256份临床型乳腺炎病乳中分离鉴定出了13株金黄色葡萄球菌、32株无乳链球茵和27株停乳链球菌；采用血清学交叉免疫试验，筛选出了毒力及交叉免疫原性强的3种茵的优势菌株。采用这些菌株和一系列新工艺和新方法，研制出了乳牛乳腺炎灭活多联疫苗。建立了用奶山羊进行制苗菌株毒力复壮及用ELISA进行抗体检测的方法，进行了免疫剂量及注射部位的筛选试验以及疫苗安全性、免疫持续期、效力及田间扩大试验。结果表明，该灭活多联疫苗对乳牛具有安全高效的特点，经肌肉或后海穴免疫1次，每次5mL，免疫持续期可达4个月；且后海穴的免疫效果优于肌肉注射，可使临床型乳腺炎发病率降低49．22％～59．86%。     

9型猪链球菌广东株的分离鉴定和基因序列分析

为了解9型猪链球菌广东分离株毒力因子基因型、基因变异和进化情况，本试验采集发病猪脑脊液、关节液、脾脏、肝脏、淋巴结进行细菌分离培养和生化鉴定，采用PCR方法鉴定其血清型及部分毒力基因，对cps9D、gdh、gapdh与orf2基因进行序列测定和分析，并构建系统发育树。结果显示，分离菌镜检为革兰氏阳性链状球菌，在鲜血琼脂平板中呈β溶血，可发酵大多数糖类，能成功扩增cps9D基因，含重要的保守基因gdh及毒力基因gapdh和orf2，表明分离菌株为9型猪链球菌。分离菌株cps9D、gdh、gapdh、orf2基因核苷酸序列与GenBank上国内外参考菌株的同源性分别为95.9%~100.0%、98.6%~99.8%、98.7%~99.6%和95.5%~99.9%，说明分离菌株与国内外其他9型猪链球菌毒株核苷酸同源性都较高，且与国内外的流行毒株基本一致，未发生太大的变异。系统发育树表明，分离株与国内外来源不同的猪链球菌分离株同源性高，亲缘关系密切。     

B型副鸡禽杆菌田间分离株的毒力及免疫原性研究

为探索分离自安徽省某大型白羽鸡场的1株B型副鸡禽杆菌的毒力及免疫原性,本试验测定了该菌对5～6胚龄SPF鸡胚及35～40日龄SPF鸡的毒力,并用该菌株制备免疫原,免疫35～40日龄SPF鸡,用攻毒的方法测定菌株的免疫原性,同时对本菌株制备的抗原及目前国内、国外市场上销售的鸡传染性鼻炎A型、B型、C型三价或二价灭活疫苗的免疫效力进行比较。毒力试验结果显示,本菌株对SPF鸡胚的最小致死剂量为110 CFU,对SPF鸡的最小发病剂量为5.5×10~3 CFU。免疫原性试验结果显示,本菌株制备的抗原免疫鸡能有效抵抗本菌株的攻击,说明本菌株的免疫原性良好,而市场上销售的鸡传染性鼻炎三价/二价灭活疫苗免疫鸡均无法抵抗本菌株的攻击,说明市场上销售的疫苗对本菌株的保护效果较差,B型菌疫苗间的交叉保护效果不理想。本试验为B型鸡传染性鼻炎疫苗的研究提供参考和物质基础。