木奈果实中花青素合成酶基因PsANS的克隆及原核表达分析

根据NCBI数据库中已知的蔷薇科植物花青素合成酶基因序列设计特异引物,从本实验室已经构建好的木奈成熟果实均一化全长cDNA文库中筛选分离得到了一个编码花青素合成酶的cDNA:基因命名为PsANS,登录号:JN560957。该cDNA长1 478 bp,包含137 bp 5’非编码区,267 bp 3’非编码区,开放阅读框长度为1 074 bp。PsANS编码358个氨基酸,分子量为40.41 ku,理论等电点为5.35。经BLAST分析对比发现,PsANS氨基酸序列与甜樱桃、苹果和草莓的ANS氨基酸同源性都很高,分别为98%、93%和89%。将PsANS亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1和pET-32a上,在大肠杆菌BL21中经1mmol/L ITPG诱导表达获得了木奈PsANS融合表达蛋白,其分子量大小与预期的一致,进一步确认本试验克隆得到的PsANS为木奈花青素合成酶基因。     

茶树亲环素基因cDNA全长的分析鉴定与原核表达

通过对茶树新梢cDNA文库大量随机测序,获得了一个编码亲环素的全长基因,在GenBank登录,登录号为DQ904327。茶树亲环素基因cDNA全长949 bp,其中开放阅读框全长495 bp,编码蛋白质含有164个氨基酸,分子量约为17.47 kD,等电点约为8.54,它具备5’端非编码区的“CAAT”标志及3’端非编码区的”AATAAA”poly-A加尾信号。其推测的氨基酸序列经与26条其他生物亲环素蛋白氨基酸序列进行CLUSTAL W多序列联配并以Neighbor-Joining法进行进化树构建后,发现与水稻和小麦的相似性较高,达到85%以上。根据亲环素基因开放阅读框序列设计引物,构建了原核表达载体pET/Csin-Cyp,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导出了一个分子量为23 kD的亲环素融合蛋白。     

玳玳花瓣脂氢过氧化物裂解酶基因cDNA的克隆及原核表达

以玳玳花瓣为材料,采用RT-PCR和RACE技术,克隆了玳玳HPL基因cDNA全长,全长为1 776 bp,其中包含52 bp的5′非编码区,224 bp的3′非编码区,1 500 bp的编码区(编码499个氨基酸,分子量为55.7 ku)。将该HPL基因cDNA编码区的核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与其他植物的HPL基因cDNA序列进行比较,推断玳玳花瓣HPL属于13-HPL类。通过PCR扩增得到了玳玳HPL基因组全长。测序结果显示玳玳HPL基因中包含1个长2 374 bp的内含子。将分离出来的玳玳HPL基因cDNA的编码区序列插入pET-15b载体上构建原核表达载体,在细菌BL21细胞中进行原核表达。结果表明:该编码区片段可在原核细胞中大量表达,其表达产物分子量大小约为55 ku,与13-HPL蛋白的分子量55.7 ku相符。本研究为下一步利用HPL基因cDNA进行遗传转化研究奠定基础,将为花卉香味的遗传改良提供一条新途径。     

茶树花青素还原酶基因在大肠杆菌中的表达及优化

茶树花青素还原酶是催化非酯型儿茶素EC和EGC合成的关键酶。采用RT-PCR技术,获得了茶树花青素还原酶基因的开放阅读框,它编码含337个氨基酸的蛋白质,推测分子量为37kD,等电点为6.54;成功地将该基因重组到表达载体pET32a(+)上,并在大肠杆菌rosetta中进行原核表达;优化了原核表达中诱导时间、诱导温度、IPTG浓度、氨苄青霉素浓度,纯化出目的蛋白。HPLC检测表明,目的蛋白具有ANR酶活性。     

茶树无色花色素还原酶基因克隆及表达分析

采用EST测序技术和3′RACE技术,获得了茶树儿茶素代谢途径中的一个重要酶—无色花色素还原酶的全长基因,在GenBank的登录号为EF205148,序列全长1 301 bp,其中开放阅读框长1 029 bp,编码342个氨基酸,3′端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号,推测的蛋白分子量约为37.5 kD,理论等电点为5.81。将该基因重组到表达载体pET-32a(+)中进行原核表达,经IPTG诱导、SDS-PAGE检测,结果表明茶树无色花色素还原酶基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约60 kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。同源性分析表明茶树无色花色素还原酶基因编码的氨基酸序列与其他植物具有较高的相似性,例如与亚洲棉、草莓和葡萄的相似性分别为70%、68%、71%。利用半定量PCR技术检测总儿茶素含量不同的4个茶树品种中与类黄酮合成相关的黄酮醇合成酶(FLS)、二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)、无色花色素还原酶(LAR)、花色素合成酶(ANS)等7个基因的表达情况,结果表明DFR和LAR基因的表达量与茶树中总儿茶素含量呈一定的相关性,而其他基因则与其相关性不大。     

栽培大豆Rubisco小亚基基因（rbcS）全长cDNA的克隆及原核表达

根据NCBI中发表的大豆Rubisco小亚基基因（rbcS）序列（AF303939-1）设计特异引物,以吉农13大豆为实验材料,采用Trizol法提取叶片总RNA,通过RT-PCR克隆大豆rbcS的cDNA。将该基因与原核表达载体pET-30a（+）连接,转化大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞,双酶切鉴定后筛选阳性克隆,测序结果显示：rbcS全长 696bp,其中开放阅读框为537bp,编码178个氨基酸;选择含大豆rbcS cDNA阳性克隆菌液IPTG诱导,经SDS-PAGE分析,诱导表达出分子量为29.1kDa的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符。诱导7h蛋白表达量最高,为64.15%。     

茶树DNA甲基转移酶基因CsDRM2的克隆及表达分析

DNA甲基化作为表观遗传修饰的主要途径之一,能够通过对基因组 DNA 的修饰参与植物对外界环境胁迫的响应, DNA甲基化需要DNA甲基转移酶的参与.实验室前期研究表明,茶树在冷驯化过程中发生了甲基化反应.通过RACE克隆,获得了茶树中DNA甲基转移酶CsDRM2基因的cDNA全长序列(NCBI登录号KR057963).CsDRM2序列全长2328bp,含1815bp的开放阅读框,编码604个氨基酸,预测蛋白质分子量为67.39 kD,理论等电点(PI)为4.85.生物信息学分析结果显示,茶树CsDRM2蛋白与芝麻和烟草的亲缘关系最近,CsDRM2的氨基酸序列与其他植物的DRM2相似性均高于65%.CsDRM2基因表达分析的结果发现,随着冷驯化的进行,CsDRM2基因的表达量呈现出增加的趋势,参与茶树冷驯化过程的甲基化响应.     

茶树二氢黄酮醇4-还原酶基因的克隆、表达及功能分析

茶树二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)是儿茶素合成途径中的关键酶。本研究采用RT-PCR技术,获得了茶树二氢黄酮醇4-还原酶基因(CsDFR)的开放阅读框,它编码含347个氨基酸的蛋白质,推测分子量为38.69 kD,等电点为6.02。成功地将该基因重组到表达载体SUMO上,并在大肠杆菌BL21中进行原核表达;优化了原核表达中诱导时间、诱导温度、IPTG浓度;纯化出目的蛋白。利用HPLC-MS方法对重组蛋白进行了体外酶活检测,结果表明目的蛋白具有DFR酶活性,可催化DHQ和DHM的还原反应。     

茶树二氢黄酮醇4-还原酶基因的克隆、表达及功能分析

茶树二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)是儿茶素合成途径中的关键酶。本研究采用RT-PCR技术,获得了茶树二氢黄酮醇4-还原酶基因(CsDFR)的开放阅读框,它编码含347个氨基酸的蛋白质,推测分子量为38.69 kD,等电点为6.02。成功地将该基因重组到表达载体SUMO上,并在大肠杆菌BL21中进行原核表达;优化了原核表达中诱导时间、诱导温度、IPTG浓度;纯化出目的蛋白。利用HPLC-MS方法对重组蛋白进行了体外酶活检测,结果表明目的蛋白具有DFR酶活性,可催化DHQ和DHM的还原反应。     

大豆胞囊线虫热激蛋白基因Hsp70的克隆与原核表达

采用RT-PCR技术结合基因组步移技术,从大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)中克隆了热激蛋白70基因(Hsp70)的全长cDNA序列(Hg-Hsp-70),全长1 953 bp,GenBank登录号为FJ816100.1。碱基序列分析结果表明,该序列含有9个外显子与8个内含子,与其它线虫具有较高的同源性。氨基酸序列分析表明,该基因编码650个氨基酸,相对分子量为70.7 kD,具有2个Hsp70基因家族的签名序列,与其它线虫的该基因氨基酸序列具有很高的同源性。构建了原核表达载体Hsp70pEASY-E1,采用IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳结果表明,当IPTG终浓度为0.2～1.2 mmol.L-1时均能显著诱导表达;以终浓度0.8 mmol.L-1的IPTG诱导5 h蛋白表达量达到最大值。     

文心兰ACC氧化酶基因OnACO1克隆与表达分析

以文心兰切花品种"黄金2号"(Oncidium Gower Ramsey‘Gold2’)为材料,通过RT-PCR和RACE技术,从文心兰的花中分离得到了1个ACO基因成员的cDNA,命名为OnACO1(GeneBank登录号为JQ822088)。该基因全长为1 424 bp,包括972 bp的ORF,172 bp的5′-UTR和280 bp的3′-UTR,编码324个氨基酸,其氨基酸序列与石斛兰等兰科植物的ACO氨基酸序列有较高的同源性。构建原核表达载体pGEX-OnACO1,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达,在SDS-PAGE中显示出了特异性表达条带,与预测的蛋白大小一致。荧光定量PCR分析表明OnACO1基因的表达具有组织特异性,主要在蕊柱中表达,并且乙烯对该基因的表达有上调作用。     

花生CAX相互作用蛋白4(CXIP4)基因克隆表达分析及载体构建

钙离子是细胞信号传导中重要的第二信使。CAX interacting protein(CXIP)是一类能够激活Cation exchanger(CAX)的钙离子转运活性蛋白,在离子转运体系中起重要作用。本研究利用RACE方法获得花生CAX相互作用蛋白4(CXIP4)基因的cDNA和DNA全长序列。该基因cDNA序列的全长包括966bp的开放阅读框,编码321个氨基酸。DNA全长为966bp,不含有内含子序列。推测的蛋白质分子量为36706.24Da,等电点为9.62。使用荧光定量技术(qRT-PCR)分析了该基因在花生品种日花1号植株中的组织表达和青枯菌胁迫条件下的表达变化规律,并构建了该基因的过表达载体、反义表达载体以及原核表达载体,为进一步研究花生中该基因的功能及其在花生抗青枯病中的作用奠定基础。     

四倍体小麦Langdon HMT1基因的克隆及原核表达

硒是人类不可缺少的重要微量元素之一,人类必须补充足够的硒才能保证身体健康。同型半胱氨酸甲基转移酶(homocysteine-S-methyltransferase,HMT)基因与植物富硒关键酶硒代半胱氨酸甲基转移酶(selenocysteine methyltransferase,SMT)基因同源。为了发掘并利用麦类作物中的富硒关键酶基因,基于NCBI已公布的节节麦(Aegilops tauschii Coss.)同型半胱氨酸甲基转移酶1基因(AetHMT1)的序列设计HMT1基因的特异性引物H1-F/H1-R,克隆四倍体小麦Langdon HMT1的开放阅读框(open reading frame,ORF)后进行序列分析,并通过原核表达验证该基因。结果表明,利用H1-F/H1-R从四倍体小麦Langdon(LDN)克隆出两条长度均为975bp的序列,分别命名为LDNHMT1-1和LDNHMT1-2。LDNHMT1-1、LDNHMT1-2与AetHMT1基因一样,均编码342个氨基酸,分子量大小分别为35.19kDa和35.18kDa。通过氨基酸序列比对和进化树分析发现,LDNHMT1-1、LDNHMT1-2与其他HMT、SMT有较高的相似性。构建原核表达载体,并通过SDS-PAGE鉴定,成功获得LDNHMT1-1、LDNHMT1-2的原核表达菌株,且原核表达的蛋白质与预测分子量大小一致。     

茶树CsCDF1基因克隆及表达分析

采用SMART-RACE技术克隆了茶树Dof（DNA binding with one finger）基因CsCDF1的全长cDNA序列,并利用在线生物信息学软件对其进行了分析。采用实时荧光定量PCR分析该Dof基因在茶树不同组织间的表达差异和昼夜表达规律,及其在氮饥饿处理2周后对不同浓度氮素诱导的响应。该cDNA序列全长1β606βbp,包含1个编码464个氨基酸的完整开放阅读框,含有高度保守的DOF结构域,推导的蛋白分子量为50.8βkDa,理论等电点（PI）为5.52;其编码的蛋白序列与茸毛烟草、马铃薯和美花烟草的CDF蛋白（Cycling dof factor）相似性分别为69%、67%、68%。系统发育分析结果表明,该基因编码的氨基酸序列与拟南芥CDF蛋白聚为一类,因此将其命名为CsCDF1;CsCDF1在3个不同茶树品种根系中的表达量均高于一芽二叶和成熟叶;在一天中,该基因的表达呈现出昼夜节律变化;在氮饥饿后重新供氮,不同组织中该基因对不同浓度氮素的响应均为上调。     

大豆GmPM13基因的克隆及原核表达

通过对大豆(Glycine max)油体钙蛋白(caleosin)基因GmPM13的克隆及原核表达,为今后利用基因工程方法检测转GmPM13基因提供抗体。运用RT-PCR技术克隆得到大豆油体钙蛋白GmPM13基因,构建原核表达载体,命名为p ET-28a-pm13。并转化到Ecdi和Rosetta中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,SDS-PAGE分析GmPM13蛋白的表达情况。大豆GmPM13基因全长c DNA序列为738 bp,包括一个720 bp的开放阅读框,编码239个氨基酸,油体钙蛋白的分子量为27.1 k Da,诱导表达产物的大小与预计蛋白大小相符。在28℃,1.5 mol·L~(-1)IPTG浓度下,诱导12 h蛋白的表达量最高,占总蛋白的39.25%。     

斑茅SAMDC基因的克隆及其原核表达分析

以斑茅(Erianthus arundinaceus)samdc基因的cDNA为基础,采用基因重组技术,将该基因按正确的阅读框架定向克隆于原核表达载体pET-29a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析.结果表明:重组斑茅samdc基因在大肠杆菌中获得高效表达,其分子量约为43.281kDa.斑茅samdc基因原核表达载体的成功构建和重组斑茅SAMDC蛋白在大肠杆菌中的高效表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

夜来香SAMT基因的分离与原核表达

为探究夜来香（Cestrum nocturnum）花香基因SAMT在花香代谢中的调控作用,以花瓣为材料,采用RT-PCR和RACE技术相结合,克隆夜来香SAMT基因的全长cDNA。结果表明：该cDNA的序列长度为1 493 bp,编码365个氨基酸,其中包含1 098 bp ORF、130 bp 5′UTR和265 bp 3′UTR,将其命名为CnSAMT;生物信息学分析结果表明：该基因所编码的氨基酸序列与烟草、番茄的同源性分别为98％和98％,属于甲基转移酶-7家族;原核表达结果表明：CnSAMT的蛋白表达产物约为42 ku,与软件预测的结果大致相同。采用染色体步移技术,克隆夜来香CnSAMT的5′端调控序列,结果表明：该序列长度为993 bp,且该序列除了含有TATA-box、CAAT-box等启动子核心元件外,还含有光、生长素、脱落酸、热胁迫、缺氧胁迫等外界环境条件响应的顺式作用元件。     

橡胶树HbDHN1基因克隆及表达分析

采用Macroarray印迹杂交技术从本实验室构建的橡胶树机械伤害诱导的树皮抑制性差减杂交(SSH)cDNA文库中检测到1个差异表达EST.采用RT-PCR和RACE技术获得了该基因全长cDNA序列,包括124 bp的5'端非编码区,337 bp的3'端非编码区和1个编码224个氨基酸的开放阅读框.该cDNA编码的蛋白具有植物脱水素蛋白的特征性结构,属于SK2类脱水素蛋白.命名为H6DDHN1,与其它植物的SK2类脱水素蛋白具有49.0%～68.2%的氨基酸序列同源性.RT-PCR分析表明,机械伤害对HbDHN1基因的表达没有明显影响,受伤组织的脱水显著上调该基因的表达.     

茶树硝酸根转运蛋白基因NRT2.5的克隆及表达分析

通过RACE克隆从茶树[Camellia sinensis (L.)]叶片中获得NRT2.5基因cDNA全长序列。所得基因序列全长为2 457 bp,其中开放阅读框为1 362 bp,编码454个氨基酸,推测蛋白分子量为48.7 kD,理论等电点为9.63。生物信息学分析表明,该基因与可可树、拟南芥等的NRT2.5基因具有高度同源性,且其编码的蛋白质具有NRT家族共有的结构特征。实时定量PCR分析表明,NRT2.5基因在茶树不同组织中均有表达,但主要在成熟叶和根中表达;不同氮浓度处理后,茶树NRT2.5基因在低浓度下的表达量高于高浓度下。     

茶树类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因的克隆和表达分析

以茶树叶片为材料,结合同源克隆方法和RACE技术,克隆了1条UFGT基因,命名为CsUFGT。该基因cDNA全长为1526bp,ORF长1380bp,编码459个氨基酸,推测等电点5.96,推测分子量为49.486kDa。该基因编码的蛋白质与葡萄UFGT（P51094.2）的一致性为59%,相似性为75%,其C-端含有植物UGT家族成员特有PSPG基序。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在茶树根茎叶中均表达,在第4叶表达量最高,根和茎中表达量较低。