小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备条件的研究

为了建立活力稳定的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层,本实验以13．5～14．5d的ICR小鼠胚胎为实验材料,以MTT法测定细胞活力,探讨了不同浓度的丝裂霉素C、丝裂霉素C不同处理时间及不同的成纤维细胞接种密度对MEF活力的影响。结果表明：10μg／ml的丝裂霉素C处理后的MEF活力比其他浓度（1μg／ml、5μg／ml、20μg／ml、30μg／ml）丝裂霉素C处理后的MEF活力稳定;用10μg／ml的丝裂霉素C处理2．5h,MEF活力比处理1．5h、3．5h、4．5h稳定;以2．5～35×10^5／ml密度接种于96孔板上,每孔200μl,MEF活力较接种密度为1．5×10^5／ml、4．5×10^5／ml、7．5×10^5／ml稳定。结论：用10μg／ml丝裂霉素C处理MEF 2．5h,2．5～3．5×10^5／m;密度接种于96孔板上,每孔200μl,以10％的胎牛血清培养液培养能得到活力稳定高效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层。     

绵羊类胚胎干细胞的分离与克隆

从胚胎发育阶段、饲养层和培养体系等方面对影响绵羊类ES细胞分离、克隆效率的因素进行探讨。结果显示：致密桑葚胚和囊胚的ICM增殖率高于囊胚和孵化囊胚。绵羊类ES细胞在同源绵羊胎儿成纤维细胞（SEF）上生长比较缓慢,最终传代次数也低于小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）组。培养液中同时添加胎牛血清（FBS）和Knock-out血清替代品（KSR）,绵羊类ES传至7代,添加了碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）后,最高可传至8代,而单纯添加KSR或FBS,分别传至4代和5代。对类ES细胞进行AKP染色、核型分析、体外分化试验,证实分离的类ES细胞符合ES细胞的主要特征,而且表达多潜能性细胞因子Nanog。由此认为,致密桑葚胚和囊胚更适合绵羊类ES细胞的体外分离和培养,而且MEF更适合于绵羊类ES细胞的分离传代,培养液中添加5%FBS和15%KSR,比较适合类ES细胞的分离传代,bFGF对绵羊类ES细胞的增殖具有促进作用。     

昆明小鼠胚胎成纤维细胞体外培养条件初步研究

本研究旨在探索影响小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)分离培养的因素,建立有效的胚胎成纤维细胞培养体系,为构建饲养层细胞与体细胞核移植技术的细胞核供体建立平台。本研究用组织细胞培养液DMEM作为基础培养液,观察了不同胎龄、不同血清浓度及不同胰蛋白酶作用时间等因素对MEF分离培养的影响。结果显示,在所进行的4个胎龄8.5、10.5、12.5、14.5 d的比较试验中,原代成纤维细胞分离培养的最适胎龄为12.5 d,细胞贴壁迅速,12 h已完全贴壁,增殖速度快;在所进行的不同时间5、10、15、30 min的胰蛋白酶消化中,最佳时间为5~10 min;在所进行的5个血清浓度7%、9%、10%、11%、13%的比较试验中,添加11%胎牛血清浓度培养效果最佳,从3~5代增殖倍数稳定在1.35左右,传代时间也相对较长。以上结果表明,采用12.5 d胎鼠,胰蛋白酶消化5~10 min,在含有11%血清的DMEM培养液中培养MEF细胞时,原代和传代效果最好,传代至第3~5代时细胞生长增殖最旺盛,处于对数分裂期,适宜作为饲养层细胞与体细胞核移植细胞核供体。     

ICR小鼠胚胎干细胞的分离与培养

为了研究不同条件对ICR小鼠ES细胞的影响,试验以12.5~13.5 d ICR小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)为饲养层,以3.5 d ICR小鼠胚胎为试验材料,探讨了血清、生长因子及传代方法对ICR小鼠ES细胞分离培养的影响。结果表明:采用含15%FBS的ES细胞培养液的囊胚贴壁率及ICM增殖率(79.3%,69.0%)均比含15%KSR、5%FBS+10%KSR的细胞培养液高(42.9%,28.6%;75.0%,54.2%),ES细胞最高传至6代;培养液中添加10 ng/mL LIF+10 ng/mL SCF的效果比单独添加1种因子的效果好,最高传至6代,高于单独添加1种因子的传代数(4代,2代);用3种传代方法进行传代时,采用差异贴壁法传代效果最佳,最高传至8代,酶消化法传至4代,机械加酶消化法传至6代。     

小鼠ES细胞条件培养基对绵羊类胚胎干细胞克隆、传代的影响

本研究以无血清培养基为基础培养液,旨在探求小鼠ES细胞条件培养液(ESCCM)和2种不同饲养层对绵羊类ES细胞分离、克隆效率的影响.绵羊内细胞团从胚胎中分离得到后,分别以小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)和绵羊胎儿成纤维细胞(SEF)为饲养层进行培养.结果在MEF饲养层上,绵羊类ES细胞在ESCCM新培养系统中可稳定传至第10代,而使用基础培养液最多传至5代.而在SEF饲养层上,绵羊类ES细胞在ESCCM新培养系统中仅能传至3代.表明使用ESCCM和MEF能促进绵羊类ES细胞的分离和克隆.对类ES细胞进行核型分析、AKP染色及体外分化能力检测,证实所分离的类ES细胞符合ES细胞的主要特征,而且发现这些类ES细胞可以表达胚胎干细胞关键转录因子Nanog.结果表明,ESCCM可显著提高绵羊类ES细胞的分离克隆效率,原因可能是小鼠ES细胞在生长过程中可能分泌某些重要的细胞因子,从而达到促进绵羊ES细胞增殖的作用.且MEF比SEF更适合于绵羊类ES细胞的分离和传代.     

以两种不同成纤维细胞为饲养层培养牛胚胎干细胞的比较

牛胚胎干细胞的培养一直未能确定最适合的饲养层,寻找一种适合于其生长的饲养层对于成功培养牛胚胎干细胞有重要意义。本研究以胎鼠和牛胎儿为材料,分别以含10%FBS的高糖DMEM和含10%FBS的DMEMF12为培养液,分离并且获得2～5代的胎鼠成纤维细胞和5～6代的牛胎儿成纤维细胞。在上述两种成纤维细胞为饲养层的条件下,采用含10%胎牛血清、0.1 mmol/Lβ-巯基乙醇、0.1 mmol/L非必须氨基酸、100 U/mL青霉素、0.05 mg/mL链霉素、20 ng/mL LIF和10 ng/mL bFGF的DMEMF12培养液培养牛胚胎干细胞,来寻找一种适合于牛胚胎干细胞培养的饲养层。结果表明,在相同的培养体系条件下培养牛胚胎干细胞,以胎鼠成纤维细胞为饲养层的贴壁率显著高于以牛胎儿成纤维细胞为饲养层的贴壁率(P0.05),以牛胎儿成纤维细胞为饲养层更利于胚胎滋养层的去除。     

ICR小鼠胚胎干细胞的分离与培养

为了研究不同条件对ICR小鼠ES细胞的影响,试验以12.5～13.5 dICR小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)为饲养层,以3.5 d ICR小鼠胚胎为试验材料,探讨了血清、生长因子及传代方法对ICR小鼠ES细胞分离培养的影响.结果表明:采用含15%FBS的ES细胞培养液的囊胚贴壁率及ICM增殖率(79.3%,69.0%)均...     

丝裂霉素C对小鼠胎儿成纤维细胞增殖抑制作用的研究

为探讨丝裂霉素C对小鼠胎儿成纤维细胞增殖的抑制作用,用10μg/mL的丝裂霉素C处理昆明白胎鼠P1代成纤维细胞1.5、2、2.5、3、3.5、4 h,用台盼蓝和AO/PI染色法观察细胞死亡情况,MTT测其增殖情况,PCNA染色观察其增殖细胞状态,比较胚胎干细胞接种在冻存过的饲养层细胞与未冻存的饲养层细胞的生长情况.结果表明,丝裂霉素C处理MEF时间小于3 h,不能抑制其生长,处理4 h后,饲养层细胞部分已经没有核仁,部分细胞已经崩解,且胚胎干细胞接种在冻存过的饲养层细胞与未经冻存的饲养层细胞都生长良好.从而得出,10μg/mL的丝裂霉素C处理MEF 3 h,能够抑制细胞增殖,且不引起细胞死亡,能用来作ES细胞的饲养层,且可以冻存、复苏后直接用于培养胚胎干细胞.     

饲养层和生长因子对山羊类胚胎干细胞的影响

实验以6~8 d的山羊囊胚为实验材料,采用机械法分离山羊囊胚ICM,分别以小鼠和山羊胚胎成纤维细胞作饲养层,并采用含不同生长因子的培养液进行培养,比较了饲养层和生长因子对分离培养山羊类ES细胞的影响。结果表明:采用MEF饲养层其ICM增殖率优于GEF饲养层;与对照组相比,培养液中添加LIF及SCF或胰岛素对山羊ICM的贴壁增殖及传代都有积极影响;以MEF为饲养层,培养液中同时添加LIF和SCF时,培养山羊类ES细胞的效果最佳,传至3代。     

昆明小鼠胚胎干细胞培养体系的优化

为了更高效地分离昆明小鼠胚胎干细胞,本研究从饲养层、胚胎发育阶段和培养液方面进行优化。将3代以内的小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)用丝裂霉素C处理后,分别按1×104、1×105、1×106·mL-1密度接种,以H-DMEM+15%KSR+LIF为培养液,观察不同密度饲养层对昆明小鼠胚胎干细胞(ES细胞)生长的影响,并研究胚胎发育阶段和培养液中分别添加干细胞生长因子(SCF)、SCF+胰岛素对昆明小鼠ES细胞分离克隆的影响。结果显示,胚胎在密度为1×105·mL-1的饲养层上,F1代和F2代ES细胞克隆形成率均显著高于其他2组(P<0.05)。囊胚的F2代ES细胞克隆形成率显著高于桑椹胚(P<0.05),培养液中添加SCF显著提高昆明小鼠胚胎贴壁率(P<0.05),同时添加SCF和胰岛素得到昆明小鼠最高胚胎贴壁率及F1、F2代ES细胞克隆形成率。所分离的ES细胞显示AKP染色强阳性,Oct-4、SSEA-1的免疫荧光检测阳性,具有ES细胞的特点。由此认为,发育至囊胚的胚胎在MEF密度为1×105·mL-1上,培养液中同时添加SCF和胰岛素更适合昆明小鼠ES细胞的分离培养。     

无血清分离昆明系小鼠胚胎干细胞

以昆明系小鼠胚胎为研究材料,以丝裂霉素C处理的胎鼠成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblasts,MEF）为饲养层,在胚胎干细胞（Embryonic stemcells,ESCs）培养液中添加血清替代物（Knockout serumreplacement,KSR）以替代胎牛血清（Fetal bovine serum,FBS）,并与添加FBS的培养液进行对比,研究了昆明系小鼠胚胎贴壁、ICM（Inner cell mass,ICM）集落形成以及ESCs分离的情况。结果表明,在添加KSR的培养液中,胚胎在培养3~5 d贴壁,胚胎贴壁率显著低于添加FBS的培养液;5~7 d形成ICM集落,集落未分化形态可维持2~3 d,培养10 d ICM集落仍可保持典型的未分化形态;ICM集落形成率和1代ESCs集落出现率与添加FBS的培养液相比差异不显著（P〉0.05）,但2~5代ESCs集落出现率显著高于添加FBS的培养液,其中有2株ESCs在添加KSR的培养液中传到7代;所分离细胞显示碱性磷酸酶染色强阳性,Oct-4、Nanog的免疫组化染色阳性,具有ESCs的特点。结论：在ESCs培养液中添加KSR比添加FBS更有利于维持ICM集落及ESCs的未分化状态。     

丝裂霉素C和γ射线对小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备的影响

用丝裂霉素C和γ射线对小鼠胎儿成纤维细胞进行处理，观察它们对小鼠胎儿成纤维细胞分裂与存活的影响。结果表明，小鼠胎儿成纤维细胞用不同浓度的丝裂霉素C或不同强度的)，射线处理一定时间(5μg／mL 4h、10μg／mL 1～4h、20μg／mL 1．0～2．5h或14Gy 1h、21Gy 1h、28Gy 1h)，能有效地抑制其分裂，且不影响其活力。     

山羊类ES细胞的分离与培养

旨在优化并建立有利于山羊类ES细胞生长的饲养层细胞、培养基、细胞因子和传代方法。本研究选择武汉市本地白山羊配种6～7 d后的胚胎,通过全胚培养法、酶消化与机械分离结合法分离山羊类ES细胞,并在不同的细胞饲养层中饲养、在培养基中添加不同的生长因子、采用不同的传代方法,比较不同培养条件对山羊类ES细胞生长和增殖的影响。通过碱性磷酸酶染色和免疫组化染色法鉴定ES细胞特异生物标记AKT、SSEA-1和Oct-4的表达,并将得到的山羊类ES细胞进行体外分化。结果表明,与小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibro-blast,MEF)和山羊胎儿成纤维细胞(Goat embryonic fibroblast,GEF)相比,C2C12更有利于细胞的贴壁,但差异不显著(P>0.05);细胞传代时,在高浓度细胞因子LIF(Leukemia inhibitory factor)和SCF(Stemcell factor)中处理ICM(Inner cell mass),更有利于细胞传代(传至第8代);培养基中添加LIF和SCF的同时,添加肝素和胰岛素,更有利于细胞的传代(传至第9代);山羊类ES细胞中SSEA-1(...     

绿色荧光蛋白转基因小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养

研究了不同胎龄、消化液、培养液对转绿色荧光蛋白(GFP)基因小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)分离和培养的影响,并对其生长形态进行观察。结果表明,在实验室条件下,12.5～14.5d胎龄的GFP-MEF分离效果最好,0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA所用时间短,消化后培养细胞贴壁率高;GFP-MEF形态以小梭形为主,呈漩涡状、鱼群状生长;最佳培养液为DMEM添加10%胎牛血清。研究获得了实验室分离制备GFP-MEF的方法,为制作饲养层和进一步构建转基因动物奠定基础。     

饲养层细胞的接种密度对分离培养胚胎干细胞的影响

建立有效的昆明白小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)饲养层培养体系,用于分离和培养小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞)的研究.(1)取怀孕14.5 d昆明白小鼠胎儿分离成纤维细胞,利用体外培养体系分离传代,选取生长旺盛并且已纯化的P3代的MEF,经丝裂霉素处理后.用细胞计数板计算活细胞数,分别按1×104、1×106、1×108/mL密度接种,制备饲养层,观察不同密度饲养层的生长状况.(2)取怀孕4 d的昆明白小鼠囊胚,接种在不同密度饲养层上.观察不同密度饲养层上囊胚、ICM及ES细胞的克隆生长情况.结果显示:囊胚在密度为1 × 106/mL的饲养层上,贴壁率和ICM孵出率分别为(97.0±3.606)%和(96.3±2.887)%,显著高于其他2组;密度为1×104/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率高于密度为1×104/mL(差异极显著,P<0.01)和1×108/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率(差异显著,P<0.05);而1×104/mL饲养层和1×108/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率差异不显著(P>0.05).结果表明:以1×104/mL密度接种的MEF作为饲养层,最适合用于分离培养昆明白小鼠ES细胞,有利于囊胚的发育,ICM的增殖,促进ES细胞的增殖,并起到抑制其分化的作用.     

昆明系小鼠饲养层细胞制备条件的优化

通过分离不同胚龄的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),对MEF进行连续传代培养,并对MEF不同的消化时间进行探讨,研究影响小鼠胚胎成纤维细胞分离与培养的因素.结果表明,分离小鼠胚胎成纤维细胞的最适胚龄是12.5 d～14.5 d;37℃条件下,用2.5 g/L胰蛋白酶作用PMEF,作用时间不应超过15min;离散贴壁的成纤维细胞,作用时间以2 min～3 min为宜;MEF在第2代～第5代增殖旺盛,7代以后细胞出现急剧下降.所以选择第3代MEF是制做饲养层的最佳时机.MEF分离方法简单,来源方便,增殖迅速,是用于胚胎干细胞分离培养的有效培养体系.     

提高猪囊胚后期贴壁能力的优化培养体系

为了提高猪孤雌囊胚贴壁率,试验从饲养层及培养液两方面研究猪孤雌囊胚贴壁能力;用小鼠、猪和牛的胎儿成纤维细胞制作饲养层,分别添加DMEM、NCSU-23、DMEM/NCSU-23培养液,探讨猪孤雌囊胚在3种饲养层上的发育效果。结果表明,BEF饲养层能更好地促进猪孤雌囊胚贴壁生长,其囊胚贴壁率为33.67%,与MEF饲养层组的囊胚贴壁率(19.08%)之间差异显著(P0.05),与PEF饲养层组之间囊胚贴壁率差异不显著(P0.05),MEF饲养层组和PEF饲养层组之间囊胚贴壁率差异不显著(P0.05);在BEF牛胎儿成纤维细胞饲养层组,用猪胚胎培养液NCSU-23培养猪孤雌囊胚后,囊胚贴壁率(22.53%)显著高于DMEM培养液组(10.41%)和DMEM/NCSU-23培养液半量混合组(12.05%)(P0.05),DMEM培养液组和DMEM/NCSU-23培养液半量混合组之间差异不显著(P0.05)。牛胎儿成纤维细胞饲养层和猪胚胎培养液NCSU-23能更好地促进猪孤雌囊胚后期贴壁。     

丝裂霉素C对ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备的影响

<正>目的:探索不同浓度的丝裂霉素C(MMC)处理对ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备的影响,用于分离和培养干细胞。方法:取13.5d胎龄ICR鼠胚分离原代成纤维细胞,利用不同浓度MMC处理胚胎成纤维细胞制备饲养层,比较观察MMC对细胞增殖的抑制作用,制作细胞生长曲线;取妊娠3.5d的ICR小鼠胚胎在不同浓度MMC处理的饲养层上培养,观察胚胎贴壁和增殖情况。结果与结论:胎儿成纤维细胞贴壁生长,增殖迅速,6代后细胞逐渐衰老;     

小鼠胚胎干细胞成纤维细胞液养层的制备

采用受孕12.5 d、13.5 d、14.5 d的ICR品系小鼠的胚胎制备原代成纤维细胞,在相同条件下观察不同胚龄胚胎成纤维细胞的增殖情况。结果表明受孕13.5 d胚胎为分离小鼠胚胎原代成纤维细胞的最适胚龄。分离出的原代成纤维细胞在37 ℃时,用0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA消化组织的时间为3 min,可在培养3 d后传代。F1代和F2代较F3代成纤维细胞分泌的抑制干细胞分化因子LIF的量要多。小鼠胚胎成纤维细胞冻存于-135 ℃~-150 ℃10 个月,复苏后能正常传代。丝裂霉素C抑制胚胎成纤维细胞增殖的最适浓度为10μg/105细胞,作用时间为2.5 h,丝裂霉素C处理过的胚胎成纤维细胞可以在12 d内即不增殖也不死亡,但在6 d内使用效果最佳。     

不同体外培养条件对家兔早期囊胚贴壁行为的影响

采集家兔自然交配后96h的早期囊胚，以低糖DMEM＋150mL／L胎牛血清＋0．1mmol／L非必需氨基酸＋100IU／mL青霉素＋100IU／mL链霉素为基础培养基，比较了不同胚胎处理方法、不同饲养层以及培养液中添加不同成分对兔早期囊胚贴壁和增殖的影响，以完善兔胚胎干细胞的建系方法。结果表明，以胚胎分割法和链霉蛋白酶-E（proteinaseE）处理掉黏蛋白及部分透明带的胚胎容易贴壁和增殖；在小鼠成纤维细胞饲养层和兔胎儿成纤维细胞饲养层上，胚胎的脱带率差别不大，但在小鼠成纤维细胞饲养层上贴壁率明显提高，且贴壁后内细胞团增殖较快；添加胰岛素、白血病抑制因子和伊巯基乙醇均利于抑制ES的分化和促进内细胞团的增殖。