不同微生物诱导柞蚕溶菌酶基因的表达分析

溶菌酶是昆虫体液免疫的重要抗菌蛋白质,在昆虫抵御外源物质入侵过程中发挥重要作用。以柞蚕蛹为材料,采用大肠杆菌(Escherichia coli)、蛹虫草菌(Cordyceps militaris)、柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)及无菌水为诱导源,测定不同外源物质诱导柞蚕蛹血淋巴对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)的抑制活性,并根据柞蚕溶菌酶基因(GenBank登录号:DQ353869)设计引物,利用荧光定量PCR技术分析不同外源物质诱导柞蚕蛹血淋巴中溶菌酶基因的表达变化。4个诱导处理组的柞蚕蛹血淋巴均可以产生抑菌活性,但抑菌效果具有显著差异:诱导后72 h柞蚕蛹血淋巴产生明显抑菌效应,抑菌圈直径由小到大依次为无菌水处理组、蛹虫草菌处理组、柞蚕微孢子虫处理组、大肠杆菌处理组,且雌蛹血淋巴的抑菌活性较强。4个诱导处理组柞蚕蛹血淋巴中溶菌酶基因的表达量在诱导后4～8 h内迅速上调,雌蛹和雄蛹中的表达量分别在诱导后24h、8～12 h达到最大,其中,大肠杆菌诱导溶菌酶基因表达上调迅速,但持续时间短,而蛹虫草菌和柞蚕微孢子虫诱导溶菌酶基因的表达量高。研究结果说明柞蚕的免疫应答时间和免疫相关基因的表达水平因诱导源而不同,雌雄个体之间也有差异。     

从柞蚕蛹提取、纯化抗菌肽的研究

本文通过实验,得出了高效率的中国柞蚕蛹抗菌肽D的分离提纯方法。据报道,抗菌肽D的热稳定性较好,而且其等电点有别于其他的杂蛋白,因而,本文用选择性热变性作为抗菌肽D分离提纯的第一步,选择性热变性的最优条件是:PH4.2的诱导血淋巴在90℃水浴加热5’;然后把PH值从4.0调到8.0,大量杂蛋白沉淀     

柞蚕蛹溶菌酶的诱导与提取

本文报道热空气、大肠杆菌K_(12)D_(31)诱导柞蚕蛹(Antheraea pernyi)血淋巴溶菌酶活力提高的最适条件以及从柞蚕蛹免疫血淋巴中提取溶菌酶.以Sephadex G-50和CM-Sepharose柱层析法从柞蚕蛹免疫血淋巴中提取溶菌酶,并首次获得柞蚕蛹溶菌酶结晶,溶菌酶制剂比活力达到57353单位/mg蛋白,提高了257倍,总活力回收79.2%.首次应用选择性热变性,等电点沉淀、DEAE-纤维素离子交换层析、包被甲壳素-纤维素亲和层析等分离技术从柞蚕蛹免疫血淋巴中提取溶菌酶.溶菌酸制剂比活力达25 375单位/mg蛋白,提高了140倍,活力回收51%.用15%、pH4.0聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和3.0-100%.pH6.7-8.9SDS-PAGE鉴定了酶制剂的纯度,并测定了柞蚕蛹溶菌酶的部分氨基酸组成.     

柞蚕抗菌肽——杀菌抗病毒新药的试产

柞蚕抗菌肽具有广谱杀菌功能,又能抑制病毒,对某些肿癌细胞有选择性杀伤作用。华南农业大学蚕桑系的教授及其研究组成员,经多年努力进行了较深入的研究。1995年“柞蚕抗菌肽、溶菌酶的诱导、提取及基因工程研究”获国家教委科技进步二等奖及多项省级奖。“溶菌酶生产方法”获国家发明专利证书并在辽宁省丹东市鸭绿江制药厂进行中试。由于种种     

柞蚕核型多角体病毒侵染对柞蚕幼虫体内部分保护酶活性的影响

研究柞蚕幼虫被柞蚕核型多角体病毒(Ap NPV)侵染后,体内主要保护酶活性的变化,有利于了解Ap NPV对柞蚕的致病机制。测定柞蚕4龄幼虫被Ap NPV侵染后血淋巴中几种保护酶的活性,结果表明:柞蚕幼虫被Ap NPV侵染后,其血淋巴中的过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性逐渐升高,分别在接种后第4和第3天达到最大值0.11 U/(m L·min)、573.97 U/(m L·min),之后又逐渐下降;血淋巴中的过氧化氢酶(CAT)活性则表现出降低-升高-降低的变化趋势,在接种后第5天达到峰值378.44 U/(m L·min)。在柞蚕对Ap NPV侵染的免疫防御过程中,POD、SOD是首先作出应答反应的保护酶,CAT是在前二者之后起作用的保护酶,并且试验组柞蚕幼虫血淋巴中的POD活性始终高于发育同期的对照组幼虫,故推测POD是起主要作用的保护酶。     

不同诱导源对柞蚕滞育蛹酯酶蛋白的诱导效应

用不同的诱导源如E .coliK12 D31、TritonX 10 0、脂多糖 (LPS)及其混合物诱导柞蚕滞育蛹 ,并以SDS PAGE和A4 50nm处蛋白吸收值作为测定指标 ,研究其血液上清液脂酶蛋白的变化。结果表明 ,在SDS PAGE凝胶上可观察到不同的诱导源诱导的新酯酶蛋白 ,同时也导致酯酶蛋白吸收值的不规则变化。单位体积的氨基酸浓度表明有些氨基酸在酯酶蛋白和抗菌肽蛋白的合成中起着重要的作用。亮氨酸是抗菌肽组成中最重要的组分 ,但是在柞蚕滞育蛹免疫血液中含量并不高。证明诱导产物不仅仅是具有杀菌作用的抗菌肽 ,也包括酯酶在内的其他蛋白     

蚕抗菌肽的诱导及功能的研究

一、昆虫抗菌肽的诱导 1974年,瑞典Boman等首先发现将大肠杆菌注射于惜古比天蚕蛹,能诱导血淋巴产生具有广谱杀菌作用的抗菌肽。1981年,黄自然等报道注射大肠杆菌于滞育柞蚕蛹,诱导产生溶菌酶及抗菌肽。1982年,屈贤铭等分离了柞蚕抗菌肽的多个成员并分析了抗菌肽B及D的一级结构。同年,祁国荣等首次     

蚕抗菌肽研究与产业化35年的回顾和展望

1981年国内研究者首次从中国柞蚕(Antheraea pernyi)蛹血淋巴中分离出抗菌肽,测定其序列约37个氨基酸残基。之后又设计合成了柞蚕抗菌肽D、AD及CAD,并且在酿酒酵母、毕赤酵母及芽孢杆菌中得到高效表达,通过优化培养基配方及建立先进的发酵工艺流程后生产的蚕抗菌肽产品质量稳定。目前国内已有广东、河南、山东及湖北等省的多家生产蚕抗菌肽的企业,产品已应用于农业、养殖业、医药、食品、化妆品等领域。例如:蚕抗菌肽代替抗生素作为安全、无药物残留、不污染环境的绿色饲料添加剂用于饲养肉鸡、肉猪及对虾等,能有效预防疾病,提高成活率,增加体质量,降低料肉比;将蚕抗菌肽基因转化作物培育抗病品种,其中转入抗菌肽基因的抗青枯病辣椒品种已在广东、广西2个省(区)推广应用。今后需要进一步通过建立先进、高效的蛋白质重组技术和发酵工程技术,完善蚕抗菌肽产业化开发应用过程的相关标准、法规,努力推进蚕抗菌肽这一绿色生物制品发挥其潜在的巨大经济效益。     

柞蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂6基因Apserpin-6的克隆及功能分析

昆虫的丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)可以通过抑制丝氨酸蛋白酶的活性调控机体的免疫防御反应。依据柞蚕中肠转录组数据库中一段编码serpin的CDS序列设计正、反向引物,以柞蚕幼虫总c DNA为模板克隆得到一段全长1 239 bp的序列,经序列分析后命名为Apserpin-6(Gen Bank登录号:MF944108)。该基因编码412个氨基酸残基,其中N端第1~17位氨基酸为信号肽序列,在C端第357~391位氨基酸之间有一个反应中心环,第374~375位丝氨酸之间是预测的蛋白质裂解位点。半定量RT-PCR检测Apserpin-6在柞蚕5龄幼虫脂肪体中的表达量最高,在血淋巴和头部组织的表达量次之,在中肠、丝腺和马氏管中的表达量较低。荧光定量PCR检测在受到柞蚕肠球菌(Enterococcus pernyi)、白僵菌(Beauveria bassiana)以及柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus)侵染后的柞蚕幼虫血淋巴中,Apserpin-6的表达量均明显上升。利用在原核表达系统表达的重组Apserpin-6蛋白,对柞蚕幼虫血淋巴中的酚氧化酶原(pro PO)和酚氧化酶(PO)活性进行体外抑制试验,结果显示该重组蛋白能够抑制pro PO的活性,但对PO活性没有影响。试验结果提示,Apserpin-6可能作为一种负调控因子参与调控柞蚕血淋巴对于病原菌的免疫防御反应。     

抗菌肽在水产动物的研究现状及发展前景

抗菌肽(antibacterial peptides,ABP)是生物体内产生的一类具有强抗菌作用的小分子多肽,是生物体天然免疫防御系统的重要组成部分。20世纪80年代首次从惜比古天蚕中发现该物质,经过专家研究小组的进一步研究,测定其一级结构,并给这类肽命名为Cecropins,我国学者称其为天蚕素。随着天蚕素抗菌肽的发现,世界许多实验室相继分别从家蚕血淋巴、柞蚕蛹、家蝇等动物体内分离到相似的具有抗菌活性的多肽。经过各国专家的潜心研究发现,这类抗菌肽物质具有强碱性、热     

抗菌肽D基因转化广东桑的研究(初报)

采用前文[1]报道的广东桑转基因技术方法,由叶盘法将人工合成柞蚕抗菌肽D基因导入广东桑。抗菌肽基因由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒携带,对桑树叶盘进行感染和转化,并通过施加Km选择压力,经过诱导和分化,得到了Km~R表型的桑树转化苗。通过桑树叶片胭脂碱合成酶活性电泳检测及其DNA与α—~(32)P—dCTP标记的含抗菌肽基因的探针作点杂交,初步判断柞蚕抗菌肽D基因已在转化细胞中整合,为培育桑树抗青枯病品种奠定了基础。     

农杆菌携带柞蚕抗菌肽基因转入桑树的研究

人工合成柞蚕抗菌肽Ｄ基因通过根癌农杆菌Ｔｉ质粒载体转入桑树叶盘，获得基因转化工程苗。柞蚕抗菌肽对桑树青枯病假单孢菌有明显杀菌作用。人工合成柞蚕抗菌肽基因导入农杆菌感染桑树叶盘并诱导成苗。经卡那霉素筛选，胭脂碱电泳检测及抗菌肽基因探针进行印迹点杂交，确认抗菌肽基因转化桑苗成功，为培育抗青枯病品种打下基础。     

CO60-γ射线辐射柞蚕蛹产生抗菌物质的研究

<正>昆虫是地球上数量多分布广的动物,它们能适应环境而得以生存和发展,是具有其独特的内在因素的。近年来对昆虫免疫和防御机构的研究已有很多报道,昆虫在经致病性或非致病性微生物、化学物质、物理方法或创伤等非特异性刺激的诱导后,能在血淋巴中产生抗菌肽、溶菌酶、凝集素等抗菌活性物质。柞蚕是一种经济昆虫,以     

注射大肠杆菌诱导家蚕5龄幼虫产生抗菌物质

<正> 注射细菌诱导昆虫产生抗菌物质,国内外已有一些报道。Hoffmann(1981)用阴沟肠杆菌注射诱导天蚕蛹、樗蚕蛹、烟草天蛾蛹,均能产生抗菌物质。黄自然等(1981)用大肠杆菌注射诱导柞蚕蛹同样产生抗菌肽。大森和则(1978)用福尔马林处理的细     

蜜蜂抗菌肽研究进展

蜜蜂抗菌肽是蜜蜂在受到病原物感染后，其脂肪体迅速合成的一些具有抗菌活性的肽类，然后释放到血淋巴中发挥抑制细菌、真菌、病毒的作用。对蜜蜂抗菌肽的作用机理、4个基因家族抗茵肽研究进展进行了综述，简述了4个基因家族抗菌肽的进化策略。     

抗菌肽及其在鸡生产上的应用

抗菌肽是生物界.中广泛存在的一类生物活性小肽,过去人们认为宿主天然防御系统的主要参与者是吞噬细胞(如巨噬细胞)、白细胞(如肥大细胞)、血清蛋白(如补体).1980年瑞典科学家Bonlan等,从天蚕蛹的血淋巴中分离得到天蚕素抗菌肽,使人们对抗菌肽的作用机理和应用有了一个崭新的认识[1].抗菌肽是一种具有抗菌作用的活性小分子多肽,由生物体抵御外源性病原微生物的入侵而产生的,是生物非特异性防御系统的免疫应答产物,具有广谱抗菌活性,不仅可以抑制多种细菌或真菌,而且还抗原虫和病毒,对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌均有抑杀作用.     

柞蚕5龄幼虫血淋巴中蛋白质和糖类物质的动态变化

为探讨柞蚕壮蚕期体内物质代谢对滞育生理的影响,研究了不同蚕季的柞蚕5龄幼虫血淋巴中蛋白质和糖类物质含量的动态变化。结果表明:春、秋期柞蚕5龄幼虫血淋巴中总糖、海藻糖和蛋白质含量均随着生长发育而增加,总糖和海藻糖在5龄末期稍有下降;秋期柞蚕血淋巴中的总糖含量略高于春期柞蚕,海藻糖含量二者大致相似,而蛋白质含量却高于春期柞蚕,并且显示出特征蛋白质谱带。推测秋蚕期柞蚕体内物质的变化与发生滞育有关。     

抗菌肽抑制脂多糖诱导的炎症反应

抗菌肽是一种对多重耐药菌株表现出特异性抗菌机制的小分子多肽。同时,抗菌肽还具有抗炎活性,可以通过直接中和脂多糖(LPS)、抑制生物性炎症因子的产生来减轻炎症反应;亦可通过趋化白细胞、促进免疫细胞增殖等来影响获得性免疫,从而调节宿主免疫系统发挥保护作用。本文综述了近年来LPS诱导炎症产生的机制及抗菌肽抑制LPS诱导炎症反应的作用机理。     

柞蚕杆状病毒诱导鸡异嗜白细胞脱粒效应的信号转导通路

通过探讨柞蚕(Antheraea pernyi)杆状病毒诱导鸡异嗜白细胞的信号转导途径,确证其是否具有活化鸡异嗜白细胞的作用。采用β-葡萄糖苷酸酶释放法检测柞蚕杆状病毒诱导的鸡异嗜白细胞脱颗粒反应,并通过应用蛋白酪氨酸激酶(src、syk)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)以及丝裂原活化蛋白激酶(ERK、p38 MAPK、JNK)的特异性抑制剂,分析各蛋白酶通路在柞蚕杆状病毒诱导鸡异嗜白细胞脱粒反应中的作用。结果表明,柞蚕杆状病毒可以显著提高鸡异嗜白细胞的脱粒反应,其中src、PI3-K、JNK的特异性抑制剂能够抑制柞蚕杆状病毒诱导的鸡异嗜白细胞的脱粒反应,而syk、ERK、p38 MARK的特异性抑制剂则对鸡异嗜白细胞脱粒不起作用,说明柞蚕杆状病毒可通过src→PI3-K→JNK信号转导通路来诱导鸡异嗜白细胞的脱粒反应。