禽传染性支气管炎病毒M基因在毕赤酵母中表达与蛋白反应活性检测

将禽传染性支气管炎病毒(IBV)M基因克隆到毕赤巴斯德表达载体pPIC9K中,构建了重组表达载体pPIC9K-M,电击转化毕赤巴斯德酵母GS115,经MD和MM平板筛选和PCR鉴定后,采用G418抗性梯度筛选得到高拷贝重组菌株GS115/pPIC9K-M His~+Mut~+,重组菌株用1%的甲醇诱导分泌表达,并对表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析.结果表明,IBV M基因在毕赤酵母中成功获得了表达,表达蛋白的相对分子质量约为33 000,能与IBV阳性血清特异性结合.将表达蛋白初步纯化后作为包被抗原,ELISA检测结果显示表达蛋白与特异性抗体反应良好,表明表达的M蛋白生物学活性良好.本研究表达的IBV M蛋白可作为制备IB诊断抗原的基础材料,对IB的防治有重要理论和实用价值.     

毕赤酵母(Pichia pastoris )分泌表达牛白细胞介素2

利用舍有强启动子PAOX1和α-因子信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体pPICZαA，构建出舍牛白细胞介素2(BoIL-2)基因的重组质粒BoIL2-pPICZαA。线性化的重组表达栽体转化到巴斯德毕赤酵母X-33及KM71H中，筛选Zeoein高抗性酵母菌株，甲醇诱导目的蛋白表达。经SDS-PAGE和Western blot检测表明，BoIL-2以融合蛋白形式在胞内表达，但没能分泌到胞外。通过BoIL-2在巴斯德毕赤酵母中的表达，重点讨论了信号肽、基因的偏爱性等对外源基因分泌表达的影响。     

传染性法氏囊病毒免疫原基因在毕赤酵母中的高效分泌表达

从国内分离的鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）众多流行株中获得超强毒株（vvIBDV）,应用RT-PCR方法,扩增得到IBDV主要保护性抗原VP2基因的开放编码框,克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαA,将该重组质粒pPICZαA-VP2以电转化方法转入毕赤酵母X-33感受态细胞中,通过PCR鉴定、表型筛选和抗生素浓度梯度筛选,获得高拷贝阳性重组酵母菌株X-33-pPICZαA-VP2。经摇瓶诱导表达试验获得稳定高效分泌表达的酵母工程菌,表达量为0.459mg/ml,聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、免疫印迹（Western-blot）以及动物试验表明,重组酵母工程菌表达的目的蛋白具有鸡传染性法氏囊病病毒天然蛋白的生物活性和免疫原性。     

H1N1猪流感病毒HA基因在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR扩增H1N1亚型猪流感病毒HA基因,亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建分泌型重组表达载体pPIC9K-HA。将线性化的pPIC9K-HA电转化毕赤酵母菌GS115。将经MD平板筛选和PCR鉴定的阳性菌株用G418筛选多拷贝重组子。最后用1%甲醇诱导表达重组子,经SDS-PAGE和Western-blot检测,H1N1亚型猪流感病毒HA基因在毕赤酵母中成功得到了表达,产物约60.4KD,并具有免疫活性。本研究为进一步研究猪H1N1亚型猪流感病毒HA基因的功能及检测方法奠定了基础。     

鸡抗病毒Mx蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达

为了利用酵母表达技术制备鸡抗病毒Mx蛋白,试验采用基因工程技术,将编码鸡抗病毒Mx蛋白基因亚克隆至含有分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-Mx;用电转化法将线性化的pPIC9K-Mx转化至毕赤酵母菌株GS115中,G418梯度筛选转化菌;再经MM与MD平板对比生长试验筛选,PCR鉴定目的片段,筛选出高拷贝重组子,该高拷贝菌株分别经0.5%、1%甲醇诱导,表达产物再经SDS-PAGE检测。结果表明:成功构建了鸡抗病毒Mx蛋白基因的毕赤酵母表达载体,经G418抗性筛选得到高拷贝菌株;在甲醇含量维持在1%时,鸡抗病毒Mx蛋白在毕赤酵母GS115中获得良好表达,表达产物大小约为75ku;表达蛋白约占表达上清液的39.2%。     

O型口蹄疫病毒VP1基因在毕赤酵母中的表达及免疫原性分析

利用毕赤酵母系统表达O型口蹄疫病毒VP1基因,并对表达的蛋白进行免疫原性鉴定。将VP1基因克隆入毕赤酵母分泌性表达载体pPICZα-C中,获得重组表达载体pPICZαC-VP1。将重组质粒pPICZαC-VP1线性化后,用电穿孔法转入酵母菌X-33,用Zeocin+YPDS平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物,并用酵母表达的VP1蛋白免疫小鼠,然后通过ELISA检测抗体水平。结果表明,酵母所表达的VP1蛋白能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。     

微小牛蜱Bm86基因的真核表达

采用RT-PCR技术从微小牛蜱饥饿幼蜱破解物中扩增到Bm86基因，将其与巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPlC9K重组构建了重组表达载体pPIC9K-Bm86，测序正确后将其用SacⅠ内切酶线性化后采用电穿孔法转化巴斯德毕赤酵母菌Gs115，经G418抗性筛选高拷贝重组菌株后用甲醇诱导表达，SDSPAGE和Western-blotting分析结果表明，诱导表达的培养上清液中表达出具有反应活性的68ku重组Bm86蛋白，目的蛋白约占培养上清液中蛋白总量的32％以上，诱导96h目的蛋白的表达量为0．36mg／mL。     

堆形艾美球虫广东株3-1E基因在毕赤酵母中的表达

以重组质粒pGEM-3-1E为模板，扩增了序列两端分别含有EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点的堆形艾美球虫（Eimeria acervulina）广东株3-1E基因（长度为529bp），将3-1E基因克隆至巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαC中，构建了酵母表达质粒pPICZαC-3-1E。转化毕赤酵母X-33得到含有3-1E基因的重组酵母，甲醇诱导产生的目的蛋白经SDS-PAGE分析和免疫印迹检测，表明毕赤酵母成功表达了3-1E基因。     

印第安纳型水泡性口炎病毒核衣壳蛋白基因在毕赤酵母表达系统中的表达

将含有IN型VSV核衣壳蛋白基因的重组质粒pET-32a/N用EcoRI和NotI进行双酶切,目的基因克隆到表达载体pPICZαA,构建重组质粒pPICZαA/N。用SacI酶切线性化,并以电转化方法转化受体酵母菌GS115,PCR证实目的基因整合到重组酵母菌染色体中,经鉴定所获得的重组酵母菌株为Muts表型。用甲醇对重组酵母进行诱导表达,经SDS-PAGE和Westernblot鉴定,核衣壳蛋白基因在毕赤酵母中获得表达,目的蛋白分子量大小为约75kDa,表达量约占菌体总量的20%,并能够被VSV阳性血清所识别,可用于VSV的血清学检测。     

猪β-干扰素的基因改造表达及其抗猪繁殖与呼吸综合征病毒活性测定

本研究根据GenBank上登录的猪β-干扰素基因成熟肽核苷酸序列(mPoIFNβ),在保持原猪β-干扰素蛋白序列不变的基础上,对猪β-干扰素基因进行了毕赤酵母偏嗜性改造,并构建了毕赤酵母重组表达质粒pPICZαC-PoIFNβ。pPICZαC-PoIFNβ经SacⅠ酶切线性化后,电击转化导入感受态的毕赤酵母菌株X-33中,转化子经YPDS+Zeocin抗性平板筛选和PCR鉴定后获得多株阳性菌株。阳性酵母菌株经甲醇诱导分泌表达了重组PoIFNβ,其表达量约为127.9 mg/L。表达产物经SDS-PAGE和Western blotting检测,结果表明,表达产物为分子质量约25和28 ku的混合物,并且二者都可与PoIFNβ阳性血清结合。以细胞病变抑制法测定重组β-干扰素在BHK-21细胞上的抗水泡性口炎病毒活性为2.8×10³ IU/mL;对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在Marc-145细胞上抗病毒活性达到1.6×10³ IU/mL。     

猪α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定

利用基因工程技术,将编码梅山猪α-干扰素成熟蛋白基因(mPoIFNα,501 bp)亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNα。用化学方法(LiCl)将线性化的mPoIFNα与ssDNA共转化入毕赤酵母菌株GS115,转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后,得到的阳性菌株再以高浓度的G418筛选多拷贝重组子。该高拷贝菌株经1%甲醇连续诱导4 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,结果表明在毕赤酵母中猪α-干扰素获得分泌型表达,表达产物约为20 000,在GS115中的表达量约为40mg/L,占GS115表达的可分泌型总蛋白的40.1%。对表达产物进行理化分析发现,重组酵母菌表达的蛋白耐酸(pH2),对热(56℃)部分敏感,并能被特异性抗猪α-干扰素抗体中和而不与抗猪γ-干扰素抗体反应。细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素生物活性,试验结果表明rPolIFNα具有较高的抗病毒生物活性,在MDBK中的抗VSV比活性为8.0×106U/mg。     

E.tenella河北株EtMIC-2基因的克隆及毕赤酵母系统表达

为表达鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)河北株EtMIC-2蛋白,本试验采用RT-PCR方法克隆出E.tenella河北株EtMIC-2基因,连接到毕赤酵母分泌表达载体pPIC9中,构建重组表达载体pPIC9-EtMIC-2。将其线化后转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,甲醇诱导表达,饱和硫酸铵4℃沉淀浓缩后,用His选择镍-亲和层析柱纯化EtMIC-2蛋白。采用SDS-PAGE和Western blot方法验证其蛋白的表达。结果表明,构建的重组表达载体pPIC9-EtMIC-2在毕赤酵母菌中表达出相对分子质量约为45 000的目的蛋白,表达的EtMIC-2蛋白能被E.tenella阳性血清识别,具有良好的免疫反应原性。为进一步研究EtMIC-2蛋白功能及构建DNA疫苗奠定基础。     

犬细小病毒结构蛋白VP2基因的克隆和在毕赤酵母中表达

表达犬细小病毒VP2蛋白（CPV—VP2）,用于重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体,并为犬细小病毒病的诊断奠定基础。采用PCR方法对CPVVP2基因进行扩增,将CPVVP2基因克隆到毕赤酵母分泌表达载体pPICZAA中,构建真核重组表达载体pPICZAA-VP2,将该重组质粒线性化后,转化巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）X-33中,甲醇诱导表达CPVVP2,SDs_PAGE和Westernblotting鉴定表达蛋白。结果,成功扩增了CPV—VP2基因,构建了真核重组表达载体pPICZAA—VP2,在毕赤酵母菌中表达出约68000蛋白。Western—blotting鉴定表明,表达蛋白为目的蛋白VP2。表达菌株扩大表达体系于培养基中培养,上清液用70％过硫酸铵4℃沉淀浓缩,采用His选择镍-亲和层析柱分离纯化获得重组的酵母表达的带组氨酸标签的VP2蛋白,表达量约3mg／L。结果表明,在毕赤酵母中成功地表达了CPV—VP2蛋白,且能被犬细小病毒VP2单克隆抗体特异识别。     

重组猪圆环病毒2型Cap蛋白在毕赤酵母中的表达及免疫原性研究

为了获得在体外表达的猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)Cap蛋白,研究其免疫原性,试验根据GenBank公布的国内PCV2-Cap蛋白基因序列特点,结合毕赤酵母密码子偏好对Cap基因进行优化,合成目的基因后,构建分泌型表达载体pPIC9K-Cap,转化毕赤酵母GS115后,经诱导表达获得重组Cap蛋白。重组蛋白以50μg/只的剂量连续3次免疫豚鼠后检测抗体水平。结果表明:含有PCV2-Cap基因的质粒成功转化到酵母菌基因组中,重组酵母菌株在30℃,经1%甲醇诱导表达96 h后,培养液中能够检测到33 ku的重组蛋白,重组蛋白表达量为155μg/mL,占培养上清液总蛋白的9.362%,Western-blot试验结果显示重组蛋白具有良好的抗原活性。重组蛋白以50μg/只的剂量连续3次免疫豚鼠后,能够刺激豚鼠产生特异性抗体且与接种0.3头份/只剂量的市售PCV2灭活疫苗产生的抗体水平无显著差异(P0.05)。说明成功利用毕赤酵母表达系统分泌表达了PCV2-Cap蛋白,表达的重组蛋白具有良好的抗原活性。     

重组猪β防御素2在毕赤酵母中的表达及其鉴定

根据GenBank猪β防御素2(pBD-2)的氨基酸序列,参照酵母偏爱的密码子,设计无信号肽序列的pBD-2的基因编码序列,并由公司合成.将合成的基因通过SnaB Ⅰ和Not Ⅰ位点插入到酵母表达载体pPIC9K的α因子信号肽序列下游,构建成pBD-2基因的分泌表达载体pPIC9K/pBD-2.利用电穿孔法将经Sal Ⅰ线性化的pPIC9K/pBD-2质粒导入毕赤酵母GS115中,通过G418加压筛选得到His+Mut+表型的高拷贝转化子.经PCR检测证明pBD-2基因在毕赤酵母染色体上得到整合.阳性重组酵母经摇瓶发酵培养和甲醇诱导,用SDS-PAGE方法在发酵上清中检测到重组pBD-2的存在,说明构建重组酵母菌能够分泌性表达pBD-2.琼脂孔穴扩散法检测结果显示,pBD-2对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性.     

鸡β-防御素-3在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定

采用RT-PCR方法从鸡外周血淋巴细胞中扩增鸡β-防御素-3成熟肽基因,将其克隆到酵母表达载体pPICZα-A的分泌信号肽基因下游.线性化后的重组质粒电击转化毕赤酵母宿主菌GS115,经抗生素Zeocin筛选和PCR鉴定后,得到重组酵母菌.阳性转化菌经甲醇诱导后,SDS-PAGE和western blot鉴定结果表明,在毕赤酵母中得到分泌性表达产物,分子量约为8.9 ku,活性检测表明其具有显著的抑菌活性.     

牛白细胞介素-2在毕赤酵母中的表达

将编码牛白细胞介素-2(BoIL2)成熟肽的cDNA克隆到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZB中，构建出含BoIL2基因的重组质粒BoIL2-pPICZB。将经Sac Ⅰ酶切后线性化的BoIL2-pPICZB电转化到巴斯德毕赤酵母X-33中，转化子经高浓度Zeoein抗性筛选鉴定后，用1％甲醇诱导目的蛋白表达。经SDS-PAGE及Western blotting检测，表明BoIL2在酵母中获得了胞内表达；通过金属螯合亲和层析(MCAC)获得纯化的重组蛋白；培养小鼠CTLL2细胞进行活性检测，证实所表达的重组BoIL2具有生物活性。     

番鸭呼肠孤病毒ZJ99株σC基因在甲醇酵母中的表达

将番鸭呼肠孤病毒ZJ99株σC基因插入到酵母表达载体pPIC9K内,转化大肠杆菌TG1,挑取阳性克隆,获得酵母表达重组质粒pPIC9K-σC。用DraⅠ酶切线性化重组表达质粒pPIC9K-σC和对照质粒pPIC9K,电转化至甲醇酵母GS115感受态细胞内,经G418抗性筛选和PCR鉴定,获得了2株pPIC9K-σC酵母阳性整合子和2株pPIC9K空载体对照酵母阳性整合子。分别挑取1株进行甲醇诱导表达,SDS-PAGE检测发现pPIC9K-σC酵母整合子在不同时段的诱导表达上清液中均有可见的目的蛋白条带,分子质量与预计大小相符,而对照pPIC9K酵母整合子的诱导表达上清液中没有相应的蛋白条带。说明番鸭呼肠孤病毒ZJ99株σC基因真核甲醇酵母表达体系构建成功,目的σC蛋白在酵母中能够有效地分泌表达。     

J亚群禽白血病病毒gp85基因在毕赤酵母中的分泌表达

为获得J亚群禽白血病病毒gp85蛋白,将gp85基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K,构建了pPIC9K-gp85表达载体。将鉴定正确的表达载体经Sal Ⅰ酶切线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,经MD及G418抗性平板筛选后挑取阳性克隆进行PCR鉴定,获得重组酵母菌株GS115/pPIC9K-gp85。对阳性重组菌进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE、Western blotting和Dot-ELISA分析,结果表明,gp85基因在毕赤酵母中获得分泌表达,表达产物与J亚群禽白血病病毒多克隆抗体有良好的反应活性,分泌表达量达40 mg/L。本研究为J亚群禽白血病病毒诊断方法的建立及gp85蛋白的深入研究奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒纳米抗体融合蛋白真核表达及鉴定

为防控猪流行性腹泻病毒(PEDV)病的流行,构建了靶向PEDV NB3-NB6-Fc纳米抗体融合蛋白的真核表达载体,并探究能否在毕赤酵母中分泌表达。通过实验室保存的pUC57-NB3-NB6-Fc质粒,成功构建分泌表达载体pPIC9K-NB3-NB6-Fc,经SacⅠ酶将其线性化并电转化入毕赤酵母GS115菌株。经过MD、梯度G418-YPD平板和PCR方法筛选多拷贝阳性重组转化子。经鉴定为阳性重组菌株用8 mL/L甲醇在29℃条件下诱导72 h,用SDS-PAGE和Western blot方法检测上清液中重组蛋白的表达情况。结果显示,成功诱导出大小为53.2 ku的分泌型重组蛋白,经Swiss-model在线预测该蛋白具有相对紧密的空间结构。成功获得pPIC9K-NB3-NB6-Fc-GS115分泌表达菌株,可为PED的预防和治疗提供材料。