松材线虫效应蛋白Bx-FAR-1的原核表达与活性测定

[目的]纯化获得松材线虫效应蛋白Bx-FAR-1并验证其体外活性,为后续研究效应蛋白Bx-FAR-1参与松材线虫侵染松树的分子机制打下基础.[方法]利用PCR技术从松材线虫cDNA中扩增出效应基因Bx-FAR-1,用同源重组的方式将目的片段连接至原核表达载体pET-32a(+).通过原核表达系统诱导并纯化获得大量效应蛋白Bx-FAR-1,利用SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting对纯化获得的蛋白进行鉴定,同时通过本氏烟瞬时表达系统验证蛋白活性.[结果]从松材线虫cDNA中成功扩增出Bx-FAR-1基因(BXY_1685000.1);通过同源重组成功获得重组表达载体pET32a-BxFAR,并转化至大肠杆菌BL21感受态细胞.当诱导条件为15℃下150 r/min诱导16 h时重组蛋白以可溶性形式表达,且蛋白表达量高.效应蛋白Bx-FAR-1活性测定结果显示,当蛋白浓度达100 nmol/L时,可抑制致病疫霉的病原相关分子模式(PAMP)INF1引起的烟草细胞坏死.[结论]松材线虫效应蛋白Bx-FAR-1可抑制寄主植物的免疫反应.     

刺激植物响应蛋白基因Epl1克隆、原核表达及功能初探

目的研究刺激植物响应蛋白Epl1对木本植物山新杨的刺激响应功能, 为开发新一代提高植物免疫的新型诱导剂奠定基础。方法从棘孢木霉ACCC30153菌株中克隆获得一个刺激植物响应蛋白基因Epl1, 并进行序列分析和原核表达, 将获得的原核重组蛋白rEpl1与山新杨组培苗进行互作, 初步探讨rEpl1蛋白对山新杨生长、生理指标、以及生长和防御相关基因转录水平的影响。结果刺激植物响应蛋白基因Epl1的cDNA序列全长为417 bp, 预测蛋白分子量12.6 kDa, 属于Cerato-platanin家族; 通过构建原核表达载体, 成功获得重组蛋白rEpl1;在1 μg/mL rEpl1诱导下, 山新杨组培苗生长较快、根系旺盛, 生物量明显增加, CAT活性在诱导第1 d时为对照的3.51倍, 可溶性糖含量和脯氨酸含量在诱导初期急剧积累; 山新杨生长素基因LAX2/AUX和水杨酸防御基因JAR2的转录水平分别在蛋白诱导2 d和12 h时达到峰值, 分别为对照的873.10和388.02倍。结论Epl1基因的克隆、序列分析和原核表达为进一步研究Epl1蛋白诱导植物系统抗病性提供了理论基础; 重组蛋白rEpl1与山新杨组培苗互作实验, 初步Epl1蛋白能够刺激木本植物在生理及分子水平上的响应, 从而促进生长, 提高抗性。      

花生AhSOS2基因原核表达载体的构建及表达

SOS2(Salt Overly Sensitive 2)是植物中一类耐盐相关基因的统称,在植物对盐害的响应及适应过程中具有重要作用。本试验以花生AhSOS2基因全长cDNA为模板,经PCR扩增获得AhSOS2的蛋白编码区,将该区段与表达载体pET-28a(+)融合,构建获得原核表达载体pET-28a-AhSOS2,并进一步在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。经1.0 mmol/L IPTG诱导后,获得一条约51 kD的融合蛋白条带,且随着IPTG诱导时间的延长,蛋白表达量逐渐提高,诱导8 h可获得较高的蛋白表达水平。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体耐药机制研究进展

肿瘤化疗药物耐药是肿瘤临床治疗面临的主要障碍。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是肿瘤坏死因子(TNF)家族中新发现的一个配体成员,通过与肿瘤细胞死亡受体DR4或DR5相互作用,从而启动细胞凋亡,被认为对肿瘤细胞具有选择性杀伤作用,因而在肿瘤治疗上具有较好的应用前景。然而,多种肿瘤细胞可对TRAIL产生耐药,使得TRAIL在临床应用受到很大限制。对近年来报道的TRAIL耐药的相关分子靶点和信号通路进行总结,主要包括异常的蛋白质合成、内质网应激途径、泛素调节死亡受体表达、热休克蛋白、细胞自我吞噬等相关信号,为肿瘤TRAIL耐药患者提供新的治疗靶点和思路。     

坏死梭杆菌白细胞毒素基因SH片段的克隆与表达

坏死梭杆菌白细胞毒素是坏死杆菌病的主要致病因子,白细胞毒素基因（lkt）是其编码基因。以分离到的国内牛源坏死梭杆菌FN（A）菌株F4基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增白细胞毒素基因SH片段,克隆至pMD18-T载体上,以BamHⅠ和HindⅢ酶切的目的片段SH与相应酶切的pET32a载体连接构建pET32a-SH重组表达质粒,经转化E coli BL21（DE3）后用IPTG进行蛋白诱导,SDS-PAGE检测重组蛋白表达情况。结果表明：扩增基因序列大小为1800bp,SDS-PAGE检测重组蛋白有效表达,表达得到大小为80.2kDa的目的蛋白,采用镍柱亲和层析方法纯化SH重组蛋白,获得了纯度达95%的重组蛋白;经West-ern-blot证实,该蛋白对抗坏死杆菌阳性血清具有反应活性。     

人促凋亡蛋白基因bax的克隆与原核表达

以人促凋亡蛋白基因bax全长转录本eDNA为模板,经PCR扩增得到bax基因,将其克隆到pMD18-T,并构建原核表达质粒栽体pGEX-4T-1-Bax,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达.PCR扩增、双酶切鉴定他测序结果均显示bax基因已被成功克隆到表达载体中,表这产物经SDS-PAGE检测,证实为GST-Bax融合蛋白.     

人胎盘TRAIL基因的cDNA克隆及序列测定

根据GeneBank(U37518)中TRAIL(肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体)的cDNA序列,设计扩增引物。采用RT-PCR从人胎盘中扩增出TRAIL基因的全长cDNA。产物纯化后连至pGEM-TEasy载体,转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆菌,酶切鉴定并进行序列测定。结果表明,本试验成功地克隆了TRAIL基因的1039bp全长cDNA。     

卡拉库尔羊TNF-α基因原核表达载体的构建及表达条件优化

利用反转录PCR (RT-PCR)技术扩增卡拉库尔羊肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因,连接到pET-28b载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),在不同的IPTG浓度、时间、温度条件下诱导TNF-α的表达.结果表明,原核表达栽体pET-28b-TNF-α构建成功,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,优化的诱导表达条件为诱导温度37℃、诱导时间4h、IPTG浓度1.0 mmol/L.     

鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子基因的原核表达

本研究根据前期研究获得的鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子(RaDtxR)基因序列特征设计特异性引物,并在引物上下游引入BamHI和XhoI酶切位点,将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-RaDtxR,对其进行IPTG诱导表达条件优化和表达目的蛋白的生物学活性鉴定。SDS-PAGE和Western-blot分析表明,分子量约为51ku目的蛋白得到表达,并具有良好的生物学活性。本研究成功对鸭疫里默氏菌RaDtxR基因进行表达,为研究鸭疫里默氏菌RaDtxR蛋白生物学功能奠定基础。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及其受体与肝肿瘤

细胞凋亡是生物体最重要的生理和病理现象之一，其在癌变机制和维持宿主免疫系统的内稳定方面有着重要的意义和不可或缺的调节作用。在细胞凋亡的调控系统中，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)或称凋亡素2配体(Apo2 ligand，Apo2L)，是在肿瘤坏死因子家族中发现的新成员，这个凋亡诱导配体已引起了学者     

鸡TIGAR基因真核表达质粒的构建及其抗凋亡功能评价

【背景】 TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR）是p53下游的靶基因,具有调节糖酵解水平和去除活性氧（Reactive oxygen species,ROS）并降低由活性氧诱发的细胞凋亡水平。【目的】 构建鸡源TIGAR基因的真核表达质粒,并检测TIGAR基因在DF1细胞中的抗凋亡作用,为建立稳定表达鸡TIGAR基因的细胞系做准备。【方法】根据GenBank（登录号：XM_417232.6）中预测基因设计引物,利用RT-PCR的方法从SPF鸡脾脏中扩增鸡TIGAR基因,将扩增产物克隆至载体（Flag-CMV14）后送公司测序验证;随后构建进化树对鸡TIGAR基因与其他哺乳动物及水生动物的TIGAR基因进行同源性分析。将重组质粒（Flag-TIGAR）转染入DF1细胞24 h后,使用新城疫病毒诱导细胞凋亡,利用Western Blot检测重组质粒表达情况以及Poly ADP-Ribose Polymerase（PARP）裂解情况。此外还将重组质粒（Flag-TIGAR）转染入DF1细胞,并于收样前2 h使用Staurosporine刺激细胞发生凋亡,分别在转染后24、48 h收集样品,并用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。【结果】 RT-PCR扩增TIGAR基因,在843 bp处出现目的条带与预测相符,构建的TIGAR真核表达质粒（Flag-TIGAR）经测序,结果显示其序列与GenBank上预测的基本一致。Western Blot结果显示在30 h、36 h收集的样品中PARP均被裂解且转染重组质粒（Flag-TIGAR）的实验组与未转染质粒（MOCK）组或转染空载体（Flag-CMV14）组的样品相比,裂解的PARP表达量明显降低,且差异极显著（P<0.01）。流式结果显示：24 h 检测转染Flag-CMV14后细胞总凋亡率为11%（早期凋亡7.8%,晚期凋亡3.2%）,而转染Flag-TIGAR后细胞总凋亡率仅为4%（早期凋亡3.7%,晚期凋亡0.3%）,转染Flag-CMV14的早期凋亡率和晚期凋亡率均高于转染Flag-TIGAR组,且差异显著（P<0.05）。48 h转染Flag-CMV14后细胞总凋亡率为20.3%（早期凋亡14.3%,晚期凋亡6.0%）,而转染Flag-TIGAR后细胞总凋亡率为6.4%（早期凋亡4.8%,晚期凋亡1.6%）,转染Flag-CMV14组的细胞早期凋亡和晚期凋亡率均高于转染Flag-TIGAR的组,且差异极显著（P<0.01）。【结论】成功扩增出鸡TIGAR基因,并构建了其真核表达质粒,通过Western Blot和流式实验均证实过表达TIGAR后可降低细胞的凋亡程度并有利于细胞存活。     

棉花GhCAD6基因表达载体构建及GUS基因的瞬时表达

[目的]以GUS基因为报告基因,构建GhCAD6基因的瞬时表达载体.[方法]采用PCR方法和基因枪法.[结果]用PCR法,以pGEM-T-CAD6质粒为模板,获得GhCAD6基因目的片段.然后将其克隆到瞬时表达载体pRTL2-GUS/NIa中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的pGUS-CAD6融合表达载体,使目的基因能够和GUS基因同时表达.采用基因枪法将pGUS-CAD6转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h,经GUS组织化学染色,检测到多个洋葱细胞呈现蓝色.[结论]构建的瞬时表达载体可在植物细胞中高效表达,为进一步研究棉花GhCAD6基因的功能奠定了实验基础.     

A small molecule Smac mimic potentiates TRAIL- and TNFalpha-mediated cell death

We describe the synthesis and properties of a small molecule mimic of Smac, a pro-apoptotic protein that functions by relieving inhibitor-of-apoptosis protein (IAP)-mediated suppression of caspase activity. The compound binds to X chromosome- encoded IAP (XIAP), cellular IAP 1 (cIAP-1), and cellular IAP 2 (cIAP-2) and synergizes with both tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) and TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) to potently induce caspase activation and apoptosis in human cancer cells. The molecule has allowed a temporal, unbiased evaluation of the roles that IAP proteins play during signaling from TRAIL and TNF receptors. The compound is also a lead structure for the development of IAP antagonists potentially useful as therapy for cancer and inflammatory diseases.     

prd29A-otsAB表达载体的构建与转化本生烟草的研究

分别以拟南芥(Arabidopsis thaliana)和大肠杆菌(Escherichia coli)的基因组DNA为模板,通过PCR技术克隆得到rd29A启动子、ots A和ots B基因,将其依次插入到p2300-gfp质粒中,从而构建p2300-prd29A-ots AB融合基因表达载体。利用农杆菌介导法将prd29A-ots AB融合基因导入到本生烟草(Nicotiana benthamiana)中,通过对转基因烟草进行筛选,初步获得具有卡那霉素抗性的转基因植株,为今后进一步研究相关基因的功能以及通过基因工程技术提高植物的抗胁迫能力奠定基础。     

二色补血草LbGST基因的原核表达载体构建与表达

从二色补血草(Limonium bicolor)中分离出一个编码谷胱甘肽硫转移酶(LbGST)基因,并将该基因构建到pGEX-4T-2原核表达载体,转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,利用0.1 mmol/L的IPTG诱导该基因在大肠杆菌BL21中进行表达.SDS-PAGE检测表明,出现了特异的...     

犬黑皮质素受体4真核表达载体的构建及表达

[目的]构建带myc和His标签的犬黑皮质素受体4真核表达载体并在MDCK细胞中进行表达。[方法]以犬MC4R基因组DNA为模板PCR扩增目的基因编码区,将扩增产物进行T-A克隆;酶切、测序鉴定成功后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A。重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R经酶切和测序鉴定;采用FuGENE HD介导转染技术将重组体导入MDCK细胞;转染后继续培养72 h,提取细胞内总RNA,RT-PCR鉴定目的基因的表达;提取细胞总蛋白,Western Blot检测蛋白表达。[结果]构建带标签的pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R重组真核表达载体,测序结果与GenBank公布的序列相似性为99%。RT-PCR和Western Blot检测到目的基因表达。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-MC4R,重组体能在MDCK细胞中表达。     

IL15/PAP融合蛋白基因克隆及其原核与植物表达载体的构建

将IL15和PAP基因通过一甘氨酸接头(Gly4Ser)3连接在一起,构建原核和植物表达载体,以期表达具有导向杀伤活性的融合蛋白.在引物设计中,通过引物在IL15基因下游引入(Gly4Ser)3的编码序列和BamHI位点,然后采取分步克隆及PCR、酶切、连接等一系列分子克隆方法,将IL15和PAP基因融合在一起,构建融合蛋白的原核与植物表达载体.经PCR和NcoI/SalI双酶切鉴定及测序,证实原核表达载体pET32a-IL15/PAP及植物表达载体pB-I P中均插入了正确的融合基因序列.     

薰衣草DXS基因的克隆、表达分析及原核表达

【目的】 研究拟克隆薰衣草DXS基因,并分析其表达,为揭示该基因在调控薰衣草萜类物质合成中的分子机理提供研究基础。【方法】 以薰衣草杂花为试材,同源克隆薰衣草DXS基因,进行基因序列分析、表达量比较和原核表达。【结果】 (1)薰衣草DXS基因开放阅读框长为2 181 bp,编码由726个氨基酸组成的蛋白质序列;薰衣草DXS蛋白等电点为6.57,分子量约为78.39 KDa,具有高度的保守性,与狭叶薰衣草、冬凌草、毛喉鞘蕊花的DXS蛋白亲缘关系相近;(2)DXS基因在杂花花器官的衰败期表达量最高,在法国蓝花器官的盛开期表达量最高,DXS基因在杂花花器官五个不同发育时期的表达量均高于法国蓝;DXS基因在杂花花萼中表达量最高,在法国蓝雄蕊中表达量最高,DXS基因在杂花花器官5个不同组织表达量均高于法国蓝(雌蕊、雄蕊除外);(3)在37℃、IPTG 0.8 mM条件下诱导4 h后,DXS蛋白表达量最大。【结论】 DXS基因表达量与薰衣草精油产量存在正相关关系。     

番茄SYTA的克隆及表达分析

【目的】克隆获得番茄SYTA(Solanum lycopersicum STYA,S.l SYTA),分析其基因序列生物信息学特征和预测蛋白的结构特征,明确S.l SYTA亚细胞定位和组织表达,并分析其在绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记的烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)侵染下的表达变化及其对TMV移动的影响,为明确S.l SYTA在植物病毒侵染致病过程中的作用提供理论依据。【方法】根据番茄基因组含有的SYTA同源基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计克隆引物,采用RT-PCR技术克隆S.l SYTA全长序列;应用生物信息学方法分析该基因的序列特征;使用MEGA 7.0对S.l SYTA蛋白序列及其同源序列进行多序列比对,并构建同源物种间系统进化树;通过与GFP蛋白融合进行亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测番茄各部位S.l SYTA的表达量以及在TMV胁迫的番茄中S.l SYTA的表达变化;构建植物瞬时表达载体p CV-SYTA-m GFP,通过农杆菌介导在本氏烟草中瞬时表达,TMV-GFP攻毒,利用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测在本氏烟中瞬时表达S.l SYTA时TMV-GFP的积累和移动情况。【结果】克隆得到1 620 bp的S.l SYTA基因开放阅读框全长,序列比对及生物信息学分析表明,其编码的氨基酸序列具有SYTs家族的典型特征,含有N端的跨膜区、胞间连接区和C端的两个C2结构域;多序列对比及系统进化树分析发现,与茄科林生烟草、绒毛状烟草等植物亲缘关系较近,与黄瓜较远;亚细胞定位显示S.l SYTA定位于细胞质膜。在番茄的根、茎和叶中S.l SYTA的表达量从高到低依次为根叶茎;TMV-GFP侵染番茄导致其S.l SYTA表达量在接种后第1天显著上调,在第7天降至正常水平。在S.l SYTA瞬时表达的本氏烟叶片部位接种TMV-GFP,TMV-GFP在接种第5天时已经到达新叶,而接种部位仅表达空载体对照的本氏烟新叶中未观察到TMV-GFP,且接种第5天时TMV-GFP在接种叶和新叶中的积累量均明显高于其在空载体对照处理的叶片。【结论】获得的S.l SYTA具有SYTs家族的典型特征。S.l SYTA定位于细胞质膜,S.l SYTA在番茄根中表达量最高。在TMV-GFP胁迫下,番茄中S.l SYTA表达呈现先上升后下降至正常水平。在本氏烟中瞬时表达S.l SYTA有利于TMV-GFP侵染初期的积累和移动。     

番茄抗性相关基因SlHin1的克隆、表达与抗病毒功能

【目的】克隆番茄抗性相关基因Sl Hin1(harpin-induced gene 1),分析其生物信息学特征、组织表达和亚细胞定位情况,研究其在抗烟草花叶病毒侵染、移动中的作用,为番茄抗性育种提供理论依据。【方法】通过RT-PCR及基因克隆方法,从番茄总RNA中克隆得到基因SlHin1;应用生物信息学方法分析其DNA序列及其编码的蛋白序列特性,使用MEGA6.0对SlHIN1氨基酸序列及其同源序列进行多序列比对,并构建同源物种间系统进化树;将该基因片段通过Sal Ⅰ和Bam HI双酶切连接至荧光表达载体pCV-m GFP-C1,采用GFP标记的方法进行亚细胞定位检测,分析编码蛋白表达位置;利用实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)分析该基因在番茄不同组织的表达量水平;将该基因片段通过Nco Ⅰ和Bam HI通过双酶切连接至植物表达载体pFGC5941,用土壤农杆菌EHA105瞬时过表达该基因并接种标记有绿色荧光的烟草花叶病毒侵染性克隆,以检测植株对病毒的抗性变化,间接ELISA法检测病毒的含量,探究该基因的抗病毒功能。Western blot验证SlHIN1蛋白在本氏烟内的表达情况。【结果】利用RT-PCR方法从番茄材料(Solanum lycopersicon cv.Ailsa Craig)的叶片组织中克隆得到全长为675 bp的番茄抗性相关基因Sl Hin1,将序列分别提交至Gen Bank,得到序列号KU195820。序列比对及生物信息学分析表明,其基因预测编码225个氨基酸,分子量为26.1 k D,理论等电点为9.35,结构上具有LEA-14保守结构域,不具有跨膜区段,并且位于番茄基因组10号染色体上(Solyc10g081980);多序列比对及进化树分析表明,该基因编码的蛋白与茄科植物HIN1氨基酸同源性80.0%以上而与水稻、高粱单子叶植物的亲缘关系较远;亚细胞定位显示定位在细胞膜上与PSORT Prediction预测的亚细胞定位最高概率一致;qRT-PCR结果分析表明该基因具有组织特异性,表达量在根、叶、茎间依次降低;在本氏烟中瞬时过表达SlHIN1并在表达部位接种标记有绿色荧光的烟草花叶病毒侵染性克隆,处理组本氏烟在接种病毒4 d后没有任何荧光出现,而对照组出现绿色荧光。随着接种时间推移,接种7 d后处理组叶片上零星荧光有略微的扩大,而对照组的绿色荧光已经扩散至心叶。间接ELISA检测病毒含量较对照组少,处理组的病毒扩散受到抑制。Western blot分析结果表明,显色后的硝酸纤维素膜上约在26 k D处有一特异条带,而空载体的对照无相应条带,说明SlHIN1蛋白在注射部位成功表达。【结论】Hin1在供试科植物中均存在,其中SlHin1定位在细胞膜,过表达该基因可抑制病毒扩散,推测其可能参与茄科植物对烟草花叶病毒的抗性反应,使植株获得抗性。