TLRs介导的信号通路在马链球菌感染RAW264.7细胞中的作用

为探究Toll样受体(TLRs)介导的信号通路在马链球菌马亚种(S.equi)感染小鼠巨噬细胞RAW264.7中的作用,收集S.equi感染后不同时间点的RAW264.7细胞,提取总RNA并反转录成cDNA,利用实时荧光定量PCR技术检测细胞Toll样受体1、2、6(TLR1、TLR2、TLR6)、接头蛋白骨髓分化蛋白88(MyD88)及细胞因子IL-1、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-αmRNA的表达情况。结果显示,S.equi感染RAW264.7细胞后6h时,TLR1、TLR2、TLR6与MyD88mRNA水平均较对照组没有显著差异(P0.05);感染后12h时,TLR1、TLR2和TLR6mRNA表达量未出现明显上升(P0.05),而MyD88mRNA水平极显著升高(P0.01);感染后24h时,TLR1、TLR2和TLR6mRNA表达水平出现极显著升高(P0.01),MyD88 mRNA表达没有显著变化(P0.05),且IL-10和IL-12mRNA水平与对照组相比极显著升高(P0.01),IL-1、IL-6和TNF-αmRNA水平均极显著下降(P0.01)。结果表明,TLRs介导的信号通路参与S.equi感染RAW264.7细胞的免疫应答反应。     

马链球菌对树突状细胞Toll样受体和MyD88及细胞因子mRNA表达的影响

为探究马链球菌马亚种(Streptococcus equi subsp.equi,S.equi)对小鼠骨髓源树突状细胞(bone marrow derived dendritic cells,BMDCs)TLR1、TLR2、TLR6、MyD88、IL-1、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-αmRNA表达的影响,用GM-CSF、IL-4细胞因子刺激小鼠骨髓细胞使其诱导分化成未成熟的BMDCs,感染S.equi后16、20、26h,采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测感染组及未感染组细胞TLRs、MyD88和细胞因子mRNA的表达情况。结果显示,S.equi感染BMDCs后16、20、26h,TLR1、TLR2、TLR6、MyD88mRNA的表达量均显著或极显著的高于未感染组(P0.05或P0.01)。S.equi感染DCs后16、26h,IL-1的分泌量较未感染组没有变化(P0.05),IL-10、TNF-α的分泌量显著或极显著增加(P0.05或P0.01)。IL-6在S.equi感染DCs后16h的分泌量显著增加(P0.05),但感染后26h无显著变化(P0.05)。IL-12在S.equi感染DCs后16h的表达没有变化(P0.05),但感染后26h分泌量有所增加(P0.05)。说明S.equi具有调节DCs TLRs、MyD88和细胞因子表达的能力,从而介导机体的免疫应答反应。     

猴头菇多糖对MDRV感染RAW264.7细胞TLR3/TRIF诱导表达及病毒复制的影响

试验旨在探究猴头菇多糖（HEP）预处理RAW264.7细胞对番鸭呼肠孤病毒（MDRV）复制的影响及其机制,从Toll样受体3/β干扰素TIR结构域衔接蛋白（TLR3/TRIF）信号通路解析HEP在调节MDRV所致的雏番鸭机体免疫抑制中的作用机制并提供体外试验参考。试验设空白对照组（BCG）、病毒感染对照组（VCG）、HEP对照组（HCG）和HEP预防病毒感染组（HPG）,RAW264.7细胞在MDRV感染12和24 h后,通过Western blotting检测各组细胞中TLR3、TRIF和肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）的蛋白表达量;病毒感染24 h后,用ELISA法检测各组细胞培养液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-10（IL-10）、IL-6、IL-1β、干扰素-β（IFN-β）的含量。TCID₅₀检测结果表明,MDRV病毒的TCID₅₀为10^3.46。病毒感染后12 h,细胞未出现明显变化;病毒感染后24 h,细胞变圆;病毒感染后36 h,细胞大量死亡。MDRV在RAW264.7细胞中的复制结果显示,在感染病毒12~24 h内,σNS的表达量呈现上升趋势;在24~36 h,σNS的表达量维持在较高水平。Western blotting结果显示,与空白对照组相比,VCG组细胞TLR3、TRIF和TRAF6蛋白的表达量在感染后12和24 h均显著升高（P<0.05）,HCG组TRIF蛋白的表达量均显著升高（P<0.05）;与感染组相比,HPG组的σNS、TLR3、TRIF和TRAF6蛋白表达量在病毒感染12和24 h均显著降低（P<0.05）。ELISA检测结果显示,与空白对照组相比,VCG组细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-β的含量均显著升高（P<0.05）;与感染组相比,HPG组细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β含量均显著降低（P<0.05）,IFN-β的含量显著升高（P<0.05）。结果表明,HEP可调节MDRV感染诱导RAW264.7细胞TLR3信号转导通路活化,抑制TLR3信号转导通路下游产物TNF-α、IL-10、IL-6和IL-1β的过度表达,同时上调IFN-β的表达,从而抑制MDRV在RAW264.7细胞中的复制。     

阿司匹林丁香酚酯对体外脂多糖诱导小鼠巨噬细胞炎症反应的抑制效应

本文旨在研究阿司匹林丁香酚酯（aspirin eugenol ester，AEE）对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导小鼠巨噬细胞（RAW264.7细胞）炎症反应的抑制作用及其潜在作用机制。LPS刺激RAW264.7细胞诱导其炎症模型，细胞分为对照组、LPS组、阿司匹林组（aspirin，Asp，150 μmol·L^-1）、丁香酚组（eugenol，Eug，150 μmol·L^-1）、AEE低（75 μmol·L^-1）、中（150 μmol·L^-1）、高剂量（300 μmol·L^-1）组。CCK-8法检测AEE对小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性；ELISA法检测各组细胞中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α炎症因子的含量变化；RT-PCR法检测细胞中花生四烯酸（arachidonic acid，AA）代谢通路关键酶PLA2、COX-2、COX-1、CYP450和5-LOX的mRNA表达量；分子对接研究Asp、Eug、AEE与AA代谢通路关键酶的相互作用。结果表明：1） CCK-8结果显示，AEE浓度在0~350 μmol·L^-1时，对细胞无毒性；2） ELISA结果表明，与空白对照组比较，LPS组炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表达极显著升高（P<0.01）；经不同剂量的AEE处理能极显著降低炎症因子IL-1β、IL-8、TNF-α表达水平（P<0.01）；在炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8中，与Asp和Eug组比较，等摩尔的AEE与其差别不显著（P>0.05），表明其抗炎效果相似；不同剂量的AEE在炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8之间差异不显著（P>0.05）；3） RT-PCR结果表明，与空白对照组比较，LPS组中AA代谢通路关键酶表达极显著升高（P<0.01）；经不同剂量的AEE处理能显著降低AA代谢通路关键酶的mRNA表达量（P<0.05）；与Asp和Eug组比较，等摩尔量的AEE能够显著降低AA代谢通路关键酶PLA2的表达量（P<0.05）；不同剂量的AEE在COX-1、COX-2、5-LOX和CYP450关键酶表达量之间差异不显著（P>0.05）；4）分子对接结果显示，AEE与靶蛋白的结合能均低于-20.9 kJ，表明AEE与靶蛋白结合稳定且质量高，且AEE能够与PLA2、COX-2、COX-1、CYP450和5-LOX之间形成氢键。综上，AEE能够抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应，并且与前体化合物Asp和Eug抗炎作用相似，其可能通过AA代谢通路发挥抗炎作用。     

基于RAGE-TLR4串扰的高糖影响牛肺泡巨噬细胞促炎细胞因子释放的分子机制

本试验旨在研究高浓度葡萄糖对牛肺泡巨噬细胞（BAMs）促炎细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α释放的影响及其机制是否与RAGE-TLR4相关信号通路串扰有关。将BAMs随机分为正常糖组（NG）、高糖组（HG）、高糖+RAGE抑制剂组（H+F）、高糖+TLR4抑制剂组（H+T）及DMSO组,处理12 h后收集上清及下层细胞。采用qRT-PCR和Western blot检测细胞RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB p65的mRNA及蛋白表达情况,ELISA检测上清TNF-α、IL-1β、IL-6浓度。结果表明,高糖极显著上调RAGE、TLR4、MyD88和NF-κB p65基因、蛋白表达水平以及上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α浓度（P<0.01）;RAGE抑制剂与TLR4抑制剂均极显著抑制高糖引起的RAGE、TLR4、MyD88和NF-κB p65基因、蛋白表达水平上调以及IL-1β、IL-6、TNF-α释放（P<0.01）,即RAGE与TLR4均在激活RAGE/TLR4/MyD88/NF-κB炎症信号通路中发挥调控作用。综上所述,高糖能够通过RAGE-TLR4串扰引起牛肺泡巨噬细胞释放促炎细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α,进一步阐明了高糖促进牛肺泡巨噬细胞炎症反应的分子机制。     

奶牛乳腺炎模型的建立及炎症相关因子基因mRNA转录水平的分析

旨在探讨金黄色葡萄球菌（S.aureus）型和大肠杆菌（E.coli）型乳腺炎奶牛乳腺组织的炎症相关因子基因的mRNA转录水平。将10⁵ CFU·mL^-1的S.aureus和E.coli经乳导管分别注入奶牛乳房,在感染第7天采用活体无菌手术法采集乳腺组织,并采用组织HE染色和免疫荧光法进行乳腺炎模型的鉴定;利用qPCR分别检测了2个诱导组和对照组奶牛乳腺组织的趋化因子家族（CCL2、CCL8、CXCR1、CXCL2和CXCL13）、补体因子（CFI和CFB）、自噬调节因子DEPP1和白细胞介素受体IL21R共9个基因的mRNA转录水平。结果显示：与对照组相比,TLR4/NF-κB炎症相关信号通路中的关键分子（TLR4、NF-κB和TNFα）在2个诱导组乳腺组织中的蛋白表达水平均极显著上调（P<0.01）;结合HE染色结果,表明本试验成功构建了2种类型的奶牛乳腺炎活体模型。mRNA转录水平的检测结果表明,与对照组相比,7个基因（CCL2、CCL8、CXCR1、CXCL2、CFI、CFB和IL21R）在2个诱导组乳腺组织中的mRNA转录水平均极显著上调（P<0.001）,CXCL13的mRNA转录水平仅在S.aurues诱导组乳腺组织中极显著上调（P<0.01）;DEPP1的mRNA转录水平在2个诱导组中均极显著下调（P<0.01）。此外,CCL2、CCL8、CXCR1、CFI和IL21R共5个基因在E.coli诱导组中的mRNA转录水平均极显著高于S.aureus组（P<0.01）。S.aureus和E.coli感染均可导致奶牛产生严重的临床乳腺炎症状,并促使上述炎症相关基因的mRNA转录水平在乳腺组织中发生变化,以应对乳腺炎症的发生与发展过程;趋化因子CCL2等5个基因在E.coli诱导组中的mRNA转录水平显著高于S.aureus诱导组,解释了E.coli常常能引起急性乳腺炎,而S.aureus可引起慢性乳腺炎的原因。上述结果可为深入研究不同类型乳腺炎的分子调控机制提供参考。     

沙门菌通过NF-κB/β-catenin信号通路引致IPEC-J2损伤的分子机制

为研究沙门菌引致IPEC-J2损伤的分子机制,试验用沙门菌刺激IPEC-J2,在特定时间收集细胞及其培养上清液,采用荧光定量PCR或ELISA检测细胞紧密连接蛋白、炎症反应相关蛋白和细胞增殖相关蛋白的表达以及乳酸脱氢酶（LDH）含量,以确定该沙门菌能够引起IPEC-J2损伤,并进一步采用NF-κB抑制剂和小干扰RNA预处理IPEC-J2,分析了NF-κB/β-catenin信号通路在沙门菌引起IPEC-J2损伤中的调控作用。结果显示,与对照组相比,沙门菌感染组紧密连接蛋白ZO-1和Occludin mRNA表达量在感染后6和24 h呈极显著下降（P<0.01）;促炎性细胞因子TNF-α和IL-8的生成量以及LDH释放量在感染后6、12和24 h呈极显著上升（P<0.01）,NF-κB p65的mRNA表达在感染后1、3和6 h也呈极显著上升（P<0.01）;细胞增殖蛋白cyclin D1和c-Myc的mRNA表达在感染后6、12和24 h呈显著下降（P<0.05）,其转录调控因子β-catenin的mRNA表达在感染后24 h呈极显著下降（P<0.01）。与沙门菌感染组相比,抑制剂+沙门菌感染组ZO-1和Occludin的mRNA表达量在12和18 h呈极显著增高（P<0.01）,而NF-κB p65、TNF-α和IL-8的表达以及LDH释放量在各时间点均呈极显著降低（P<0.01）;siRNA-β-catenin+沙门菌处理组的β-catenin、cyclin D1和c-Myc的表达量在各时间点均呈极显著降低（P<0.01）,LDH释放量在6和12 h均呈极显著增加（P<0.01）,但在18 h增加不显著（P>0.05）。本试验结果表明,沙门菌激活了NF-κB信号通路,促进了促炎性细胞因子的生成,加重了细胞损伤;同时,沙门菌抑制了β-catenin信号通路,降低了细胞增殖蛋白和紧密连接蛋白的表达,影响了细胞修复,从而出现细胞损伤与细胞修复之间的失调,最终呈现出细胞损伤。本试验从NF-κB/β-catenin信号通路的角度揭示了沙门菌引致IPEC-J2损伤的分子机制。     

植物精油和柠檬酸复合物对肉鸡肠道屏障功能及炎症反应的影响

本试验通过研究饲粮中添加不同水平植物精油和柠檬酸复合物对肉鸡肠道屏障功能、血清细胞因子含量和关键免疫蛋白基因表达的影响,旨在探索植物精油和柠檬酸复合物在肉鸡生产上的适宜添加剂量。选用1日龄健康科宝肉鸡1 344只,随机分为4组（每组12个重复,每个重复28只鸡）,对照组饲喂基础饲粮,3个试验组（T1、T2、T3）分别饲喂添加0.8、1.0和1.5 kg/t的包被植物精油和柠檬酸复合物试验饲粮,试验期为42 d。试验结束当天,每个重复选取6只接近平均体重的肉鸡翅静脉采血,然后屠宰并取空肠、脾脏、肠系膜淋巴结（MLNs）。分别测定血清中D-乳酸（D-LA）、细胞因子的含量及二胺氧化酶（DAO）活性;并对空肠黏膜紧密连接蛋白以及脾脏和MLNs中Toll样受体（TLRs）的mRNA表达量进行测定。结果表明：与对照组相比,T2组肉鸡血清中D-LA含量和DAO活性均极显著降低（P<0.01）;T3组肉鸡血清中D-LA含量和DAO活性均显著降低（P<0.05）。T2和T3组肉鸡空肠封闭蛋白1（Claudin-1）的mRNA相对表达量均显著升高（P<0.05）,T2组闭合小环蛋白1（ZO-1）的mRNA相对表达量显著升高（P<0.05）。T1组血清中IL-1β含量显著降低（P<0.05）,MLNs中TLR4 mRNA表达量显著降低（P<0.05）;T2组血清中IL-1β含量极显著降低（P<0.01）,IL-2含量显著提高（P<0.05）,脾脏和MLNs中TLR4 mRNA相对表达量极显著或显著降低（P<0.01;P<0.05）;T3组血清中IL-1β含量极显著降低（P<0.01）,TNF-α含量显著降低（P<0.05）,IL-2含量显著升高（P<0.05）,脾脏和MLNs中TLR4 mRNA相对表达量极显著降低（P<0.01）。与T1组相比,T2组血清中D-LA含量和DAO活性均显著降低（P<0.05）,TNF-α含量显著降低（P<0.05）;T3组血清中IL-1β含量显著降低（P<0.05）。综上所述,饲粮中添加植物精油和柠檬酸复合物能够提高肉鸡肠道紧密连接蛋白的表达,降低肠道通透性,下调促炎细胞因子的表达,进而增强肠道屏障功能,缓解机体炎症。根据本试验结果,推荐科宝肉鸡饲粮植物精油和柠檬酸复合物适宜添加量为1.0 kg/t。     

籽鹅和莱茵鹅MSTN和MyoG基因表达及其与屠宰性状的相关分析

本研究旨在探讨肌肉生成抑制素(myostatin,MSTN)和肌细胞生成素(myogenin,MyoG)基因对鹅骨骼肌生长发育的影响。试验以莱茵鹅和籽鹅为研究对象,采用实时荧光定量PCR方法测定MSTN、MyoG基因在籽鹅和莱茵鹅胸肌、腿肌中的差异表达情况,运用统计软件对基因表达情况与屠宰性状间的相关性进行分析。结果显示,莱茵鹅胸肌重和胸肌率极显著高于籽鹅(P<0.01),籽鹅胸肌MSTN、MyoG mRNA表达量极显著高于莱茵鹅(P<0.01);在腿肌中,籽鹅MSTN mRNA表达量极显著低于莱茵鹅(P<0.01),籽鹅与莱茵鹅MyoG mRNA表达量间无显著差异(P>0.05)。同一品种MSTN mRNA表达水平也存在差异,在籽鹅胸肌和腿肌中表达量存在极显著差异(P<0.01);在莱茵鹅胸肌和腿肌中表达量存在显著差异(P<0.05)。就MyoG mRNA而言,在籽鹅和莱茵鹅胸肌和腿肌中表达量存在极显著差异(P<0.01)。MSTN基因表达与屠宰性能相关性分析表明,胸肌中MSTN mRNA表达量与活重、胸肌重和胸肌率呈极显著负相关(P<0.01);胸肌和腿肌中MyoG mRNA表达量与活重呈极显著正相关(P<0.01)。说明MSTN和MyoG基因可能对肌肉生长分别起正负调控作用。     

OPN5对鸭颗粒细胞凋亡、增殖及类固醇激素生成的影响

旨在研究视神经蛋白（neuropsin,OPN5）对鸭颗粒细胞凋亡、增殖及类固醇激素生成的影响。本研究分别对鸭颗粒细胞进行OPN5过表达质粒和OPN5 siRNA处理72 h （n=6）,应用EdU细胞增殖检测技术、流式细胞技术、Annexin V-FITC、RT-PCR、Western blot及ELISA技术系统地检测颗粒细胞的增殖、凋亡情况及生殖相关基因的mRNA、蛋白水平及激素水平的变化规律。结果显示,OPN5过表达能促进鸭卵泡颗粒细胞增殖,抑制鸭卵泡颗粒细胞凋亡;能极显著地促进GnRHR、FSHR、LHR的表达 ,并抑制GnIH、GnIHR的表达（P<0.01）;能显著或极显著上调StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1、CYP19A1的mRNA水平（P<0.05或P<0.01）;显著升高OPN5、3β-HSD及CYP19A1的蛋白表达水平（P<0.05）和极显著升高E2、P4分泌水平（P<0.01）,并极显著降低INHβ的水平（P<0.01）。OPN5 siRNA能够显著降低OPN5的表达水平（P<0.01）,抑制卵泡颗粒细胞增殖并促进凋亡,极显著下调GnRH、GnRHR、FSHR、LHR（P<0.01）,促进GnIH、GnIHR的表达（P<0.01）;并极显著抑制StAR、CYP11A1、CYP17A1的表达（P<0.01）;显著降低OPN5、3β-HSD及CYP19A1蛋白表达水平（P<0.05）及极显著降低E2、P4的分泌水平（P<0.01）,并能极显著升高INHβ的水平（P<0.01）。研究表明,OPN5能促进鸭卵泡颗粒细胞的增殖,抑制其凋亡,促进颗粒细胞中类固醇激素的生成和分泌。     

GPX4失活通过JNK通路缓解LPS诱导巨噬细胞炎症反应

【目的】 研究硒蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidases 4,GPX4）失活如何参与调控脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应及其潜在的分子机制。【方法】 体外培养RAW264.7巨噬细胞,以DMSO为对照,使用0.1~5.0 μmol/L GPX4抑制剂FIN56处理,通过CCK-8法检测细胞活力和Western blotting检测GPX4蛋白表达水平,确定抑制剂最适浓度。将RAW264.7巨噬细胞分为4组：对照组,添加DMSO培养24 h;FIN56（GPX4抑制剂）组,添加0.5 μmol/L FIN56培养24 h;DMSO-LPS组,DMSO培养24 h后使用LPS （100 ng/mL）刺激3 h;FIN56-LPS组,FIN56培养24 h后使用LPS刺激3 h。各组细胞经培养后,利用荧光探针2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2',7'-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate,H₂DCFDA）检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,使用试剂盒法检测细胞内丙二醛（malondialdehyde,MDA）水平,分别使用ELISA和荧光定量PCR检测促炎细胞因子白细胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）、白细胞介素6（interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的分泌水平和基因表达量,使用Western blotting法检测Toll样受体4（toll like receptor 4,TLR4）信号通路相关蛋白表达水平。【结果】 与DMSO处理相比,0.5 μmol/L FIN56处理巨噬细胞24 h对细胞活性无显著影响（P>0.05）,且显著降低GPX4蛋白表达水平（P<0.05）,故选用0.5 μmol/L FIN56用于后续实验。与对照组相比,FIN56和LPS均显著增加了ROS积累（P<0.05）,而与DMSO-LPS组相比,FIN56-LPS组ROS水平显著升高（P<0.05）。与对照组相比,LPS可显著增加小鼠巨噬细胞IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达量和IL-6含量,以及c-Jun氨基末端蛋白激酶（c-Jun N-terminal protein kinase,JNK）和c-Jun磷酸化水平（P<0.05）,而FIN56可显著下调LPS诱导的IL-6的mRNA表达量和含量及JNK和c-Jun磷酸化水平（P<0.05）,但对p38蛋白（p38 MAPK,p38）、细胞外调节蛋白激酶（phosphorylate extracellular regulated protein kinases1/2,Erk1/2）蛋白表达水平无显著影响（P>0.05）。【结论】 GPX4失活可有效阻断JNK和c-Jun磷酸化,从而特异性抑制LPS诱导的巨噬细胞的炎症反应。该结果可为以GPX4为靶点研发抗炎治疗策略提供理论依据。     

HO-1在巨噬细胞中的抗炎和抗氧化作用

【目的】旨在揭示血红素加氧酶1(HO-1)在巨噬细胞中的抗炎和抗氧化作用。【方法】利用不同浓度脂多糖(LPS,0、3、5、10、15、20、25μg/mL)、HO-1(0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10μg/mL)及锌原卟啉(zinc protoporphyrin, ZPP;0、5、10、15、20、30 ng/mL)分别处理巨噬细胞(RAW264.7),12 h后通过CCK8法检测RAW264.7细胞活力,计算LPS、HO-1和ZPP处理RAW264.7细胞的最佳浓度。将RAW264.7细胞随机分为对照组(CT)、LPS组(LPS)、LPS+HO-1组(LH)、HO-1组(HO-1)、LPS+HO-1+ZPP组(LHZ),每组3个重复。CT组细胞用含10%胎中血清的DMEM培养基培养;LPS组细胞用LPS处理;LH组细胞用LPS和HO-1共处理;HO-1组细胞用HO-1处理;LHZ组细胞用LPS、HO-1和ZPP共处理,各组细胞的处理时间均为12 h,收集细胞和上清。采用ELISA法检测上清液中白细胞介素-6(IL-6)、IL-8、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、活性...     

马链球菌兽疫亚种烯醇化酶对小鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能的影响

旨在研究马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi ssp.zooepidemicus，SEZ）烯醇化酶（enolase，Eno）对小鼠肺泡巨噬细胞（RAW264.7）吞噬能力的影响。通过构建原核表达质粒获得重组烯醇化酶（rEno），采用台盼蓝活细胞计数法，判定在不同处理浓度和时间下rEno蛋白对RAW264.7细胞的细胞毒性。将rEno蛋白与RAW264.7细胞共孵育后，用SEZ作用于细胞并检测细胞吞菌数量，判断RAW264.7细胞对SEZ的吞噬活性。进一步通过活细胞稳定同位素标记技术（SILAC）和蛋白质谱分析技术（LC-MS/MS），筛选到RAW264.7细胞中可能与SEZ Eno存在相互作用的候选蛋白。结果发现，10 μg·mL^-1 rEno蛋白处理对RAW264.7细胞有明显的细胞毒性，且10 μg·mL^-1 rEno蛋白处理RAW264.7细胞2和4 h可显著抑制其对SEZ的吞噬作用（P<0.01、P<0.05）。初步筛选到RAW264.7细胞中动力蛋白激活蛋白亚单位蛋白（dynactin subunit protein 2，Dctn）、整合素α-M蛋白（integrin alpha-M）等17种可能与Eno发生互作的蛋白。本研究获得了rEno重组表达蛋白，发现rEno可减少RAW264.7细胞对SEZ的吞噬，互作蛋白的初步筛选也为进一步揭示Eno在SEZ抗吞噬中的作用机制奠定了基础。     

Effects of Enolase of Streptococcus equi ssp. zooepidemicus on Phagocytic Functions of Alveolar Macrophages in Mice

To investigate the effect of enolase (Eno) of Streptococcus equi ssp. zooepidemicus (SEZ) on phagocytosis of mouse alveolar macrophages (RAW264.7). Recombinant enolase (rEno) was obtained by constructing prokaryotic expression plasmid, and the cytotoxicity of rEno protein on RAW264.7 cell proliferation was determined by trypan-blue living cell count method. After the rEno protein was incubated with RAW264.7 cells, SEZ was applied to the cells and the quantity of bacteria being phagocytosed was detected to determine the phagocytic activity of RAW264.7 cells. Further, candidate proteins that might interact with SEZ Eno in RAW264.7 cells were screened by live cell stable isotope labeling (SILAC) and protein spectrum analysis (LC-MS/MS). It was found that protein treatment (rEno,10 μg·mL^-1) had significant cytotoxic effects on RAW264.7 cells. Treatment of RAW264.7 cells with 10.0 μg·mL^-1 rEno protein for 2 and 4 hours could significantly inhibit the phagocytosis of RAW264.7 cells (P<0.01, P<0.05). In RAW264.7 cells, dynactin subunit protein 2 (Dctn), integrin alpha-M and about 17 proteins that might interact with Eno were preliminarily identified as rEno interaction proteins. The rEno recombinant expression protein was obtained in this study, and it could reduce the phagocytosis of RAW264.7 cells to SEZ. Preliminary screening of interacting proteins also laid a foundation for further revealing the mechanism of Eno in the anti-phagocytosis of SEZ.