仔猪骨骼肌注射pGRF基因质粒的促生长及代谢调控效应研究

给体重约 5 0kg的长白×太湖仔猪以 0 2 5、0 5、1 0、2 0mg剂量半腱肌部位注射 pGRF基因的表达质粒 ,5～ 10kg阶段终体重分别比 0mg组增加 4%、17%、2 0 %和 16 % ,日增重增加 8%、37%、43%和 36 % ,采食量提高 17%、2 7%、2 3 %和 11% ;耗料增重比 ,0 5mg组、1 0mg组及 2 0mg组分别比 0mg组降低 8%、14%和 18%。1 0mgpGRF基因质粒使血液中生长激素释放因子 (GRF)比对照组升高 1 6倍 (P <0 0 5 )、生长激素 (GH)升高2 5倍 (P <0 0 1)、类胰岛素生长因子 (IGF Ⅰ )升高 2 3倍 (P <0 0 1) ,血液中尿素浓度降低 2 0 % (P <0 0 5 ) ,血液中甘油三酯浓度 (TG)明显下降 (P <0 0 5 )。试验研究还证明生长抑素 (SS)分泌的增加是限制 pGRF基因质粒高用量时正效应发挥的重要因素 ,1mg为 5～ 10kg阶段仔猪注射 pGRF基因质粒的适宜剂量。     

生长肥育猪骨骼肌注射表达pGRF基因质粒的效应研究

将猪的GRF基因表达质粒注射于猪的骨骼肌后,研究其促生长效应与机理。选用始重6.3kg的44头去势长白×太湖仔猪,分6组,采用2×3因子安排的完全随机区组设计,按6～10kg、10～20kg、20～50kg、50～100kg4个阶段饲养。4个饲养阶段的饲粮低蛋白水平分别是20.70%,17.90%,15.03%,13.00%;高蛋白水平分别是23.70%,20.90%,18.02%,16.00%。pGRF基因质粒注射剂量设0mg、0.5mg、1.0mg3个水平,于试验开始与试验猪体重达60kg时共注射基因质粒2次。测定各阶段日增重,饲料消耗量,耗料增重比以及30、70、100kg时血液中GH、GRF、IGF-I的浓度。100kg时屠宰进行胴体品质测定。结果表明:饲粮蛋白水平对各阶段及全期试验猪日增重均有显著影响(P<0.05或P<0.01),对50～100kg阶段与全期日采食量和耗料增重比有显著影响(P<0.05或P<0.01)。注射pGRF基因质粒对各阶段及全期日增重均有显著影响(P<0.05),对6～10kg、10～20kg、50～100kg3阶段及全期日采食量有显著影响(P<0.05),对6～10kg阶段、50～100kg阶段及全期耗料增重比有显著影响(P<0.05)。注射pGRF基因质粒对30kg及70kg体重时猪血液中GRF、GH、IGF-I浓度均有显著影响(P<0.05)。提高饲粮蛋白水平与注射pGRF基因质粒均可明显降低超声波测膘厚及屠宰测膘厚、增大眼肌面积(P<0.05)。     

家兔肌肉组织表达外源性生长激素释放因子对增重的影响

用 Wicks法提取 pc DNA- GRF(1～ 32 )质粒并用 DNA Cacu L ator定量 ,同时制备原生质体。将 5 4只家兔随机分为 9组 ,分别注射质粒 pc DNA- GRF(1～ 32 ) 0 .4(用布比卡因处理 )、0 .4(含 10 %甘油 )、0 .4(含 2 5 %蔗糖 )、0 .2、0 .4、0 .6、0 .8mg及空质粒 0 .1mg和原生质体 1m L( ～ 组 )。分别于注射后 0、3、8、14、19、2 4、31d称重 ;于注射后 0、3、8、19、31d采血并分离血清 ,测定血清中 GH浓度 ,用 t检验进行统计学分析。结果表明 ,布比卡因处理组注射后 3d内GH浓度升高 6 5 %(P<0 .0 1) ,平均日增重 2 9g(P<0 .0 5 ) ;注射 0 .8mg组 31d平均日增重较对照组多 34 .6 2 %;注射原生质体组 31d平均日增重较对照组多 40 .5 7%(P<0 .0 5 )。 31d后将家兔屠宰 ,取注射部位肌肉提取 DNA和总RNA,用 PCR和 RT- PCR方法分别检测到了 GRF在肌肉中的存在和表达 ;用 EL ISA方法没能检测到血清中的 GRF抗体。     

注射pGRF基因质粒对猪血清生长轴激素变化规律的影响

本研究旨在探讨注射pGRF基因质粒在猪体内的表达效应及作用规律.试验选择8头体质量相近((15 0.43)kg)的健康长白×大白二元杂交阉公猪,随机分成2组.试验组颈部肌肉注射含4.5 mg pGRF基因质粒的注射液2 mL,对照组注射生理盐水2 mL.于处理后第1、4、7、11、16、21、26、31天空腹采血样制备血清,测定血清中生长激素(GH)、类胰岛素生长因子(IGF-I)、生长激素释放因子(GRF)、生长抑素(SS)的含量.结果表明:试验组在注射pGRF基因质粒后第7天,血清GH含量达峰值,比对照组高了113.47%,差异极显著(P<0.01);然后逐渐下降.到第11天时,比对照组高47.09%,差异显著(P<0.05).到第31天时,与对照组基本一致.试验组血清IGF-I和GRF含量虽然提高幅度不大,但其变化与GH含量存在着显著相关性,均在注射pGRF基因质粒后第7天达到峰值,然后降至对照组水平,其相关系数分别为0.589(P<0.05)和0.678(P<0.05).与对照组相比,试验组血清SS含量在11 d前一直呈下降趋势,第11天时降至最低点,但差异不显著.到第16天时2组均有所上升,21 d后缓慢下降,第31天时与对照组趋于一致.血清SS含量与GH、GRF的含量分别存在显著和极显著负相关,相关系数分别为-0.689(P<0.05)和-0.777(P<0.01).由此可见,pGRF基因质粒在体内快速表达并作用于机体,主要通过提高GRF的含量而促使GH的分泌,同时抑制SS的分泌,一定程度阻止其对GRF和GH的抑制作用,从而达到有效的促生长作用.同时本试验发现,虽然采用了颈静脉导管方法,猪血液中生长轴激素测定值变异仍较大,加强护理和增加测试猪的数量是取得更为客观结果的必要条件.     

肌注猪促生长激素释放因子(pGRF)基因质粒后猪神经内分泌生长轴激素的变化规律

试验探讨pGRF基因质粒在猪体内的表达效应及作用机理。将10头体重相近([15.24±0.53)kg]、遗传基础相似的健康杜×长×大三元杂交阉公猪安装颈静脉血导管,随机分成2组。试验开始时,试验组每头猪左侧臀部肌肉注射4.5mgpGRF基因质粒,第30d时,试验组每头猪右侧臀部肌肉注射相同剂量pGRF基因质粒,对照组两次分别注射2ml生理盐水。测定采样血浆中GRF、SS、GH及IGF-I的浓度。结果表明:①第一次注射pGRF基因质粒8d时,试验组GH的水平较对照组有显著提高(P<0.05),第12dGH水平达最高,为对照组的157%(P<0.01);第8、12、17、22d的IGF-I水平分别为对照组的185%(P<0.01)、237%(P<0.01)、200%(P<0.01)、131%(P<0.05);第12d试验组的SS水平较对照组有明显下降(P<0.05),其余时间无明显变化;GRF的水平在第12d分泌量达到最高,为对照组的143%(P<0.01),17d为对照组的133%(P<0.05),此后逐步下降又上升,与对照组的水平差异不显著。②在此试验条件下,基因质粒在5～8d开始缓释表达,12d左右达到表达高峰,其有效剂量持续时间在20d以上。③第二次注射基因质粒后,试验组第33d以后GH的水平逐渐升高,到45dGH水平达到峰值,为对照组的144%(P<0.05);第39、45、60d的IGF-I水平分别为对照组的166%(P<0.05)、173%(P<0.05)、117%(P<0.05);GRF的水平在45d分泌量达到最高,为对照组的138%(P<0.05),其余时间无明显变化;SS水平较对照组无显著差异。④相关分析表明:注射基因质粒后,试验组GH与GRF的相关系数为0.81(P<0.01),与SS的相关系数为-0.65(P>0.05);GH、GRF与IGF-I存在着正相关,SS与IGF-I存在负相关性,除GH与IGF-I的相关系数为0.67,达到显著正相关水平(P<0.05),其余指标与IGF-I均未有显著相关。     

注射pGRF基因质粒对由脂多糖或三联疫苗诱导的免疫应激仔猪生长和免疫指标的影响

为研究猪生长激素释放因子(pGRF)基因质粒对由脂多糖或三联苗诱导的免疫应激仔猪生长性能和免疫指标的影响,选用36头(28±2)d断奶的杜长大(Duroc×Landrace×Yorkshire,DLY)三元杂交仔猪,按体重相近、阎公猪和母猪各1/2的原则,分为对照组(不注射pGRF基因质粒、大肠杆菌LPS或三联苗)、注射pGRF组、注射脂多糖(LPS)组、注射pGRF+LPS组、注射三联疫苗组(猪瘟兔化弱毒,猪丹毒杆菌G4T10弱毒,猪源多杀性巴氏杆菌E0630弱毒)和注射pGRF+三联疫苗6个处理,每个处理6个重复,每个重复1头猪.试验开始时,pGRF组、pGRF+LPS组、pGRF+三联疫苗组的仔猪大腿肌肉分别注射1.0 mg pGRF基因质粒;试验的第11天给LPS组、pGRF+LPS组仔猪注射100 ug/kg LPS生理盐水溶液,三联疫苗组以及pGRF+三联疫苗组注射2头份三联苗生理盐水溶液,对照组和pGRF组注射生理盐水;第18天时按照第11天的操作重复进行.结果表明,在2次注射LPS或三联苗后,即10～17 d和17～24 d阶段,pGRF+LPS组仔猪的ADG显著(10～17 d,P<0.05)或极显著(17～24 d,P<0.01)高于LPS组,F/G均显著低于LPS组(P<0.05);pGRF+疫苗组仔猪ADG均显著高于疫苗组(P<0.05),F/G显著低于疫苗组(P<0.05).在第11天和第18天,pGRF+LPS组仔猪的血清细胞因子(IL-1、IL-6)水平均极显著低于LPS组(P<0.01),类胰岛素生长因子(IGF-I)和IgG浓度均极显著高于LPS组(P<0.01);pGRF+疫苗组仔猪的血清IL-1和IL-6浓度显著低于疫苗组(P<0.05),lgG浓度极显著(11 d,P<0.01)或显著(18 d,P<0.05)高于疫苗组,IGF-I浓度显著(11 d,P<0.05)或极显著(18 d,P<0.01)高于疫苗组.证明pGRF基因质粒能缓解由LPS或三联疫苗免疫应激引起的仔猪生长抑制;能够抑制由脂多糖或三联苗诱导的血清IL-1和IL-6浓度的上升和血清IGF-I浓度的降低,同时能提高免疫应激仔猪的血清IgG浓度.     

生长激素释放因子(GRF)在动物肌肉组织的表达

向大鼠后肢小腿前部注射生长激素释放因子 ( GRF)的表达质粒 pc DNA3 -GRF4 0 μg,于注射后 2 d开始 ,每隔 5d杀 2只取样 ,提取 RNA和 DNA,用 PCR和 RT-PCR检测质粒及其表达。结果表明 ,在 3 0 d时仍为阳性结果。注射部位肌肉组织免疫组化检测结果表明 ,在部分大鼠 ( 1 4/ 2 4 )的肌肉组织中检测到了 GRF分子。给家兔注射 pc DNA3 -GRF质粒 1 0 0μg(第 组注射质粒 ,第 组注射含 1 0 %甘油的质粒 ) ,于注射后 1 d开始采血分离血清 ,用 RIA法测定血清生长激素 ( GH)的水平。结果表明 ,第 组在 5d时 ,GH水平上升2 7.1 %( P <0 .0 5)。本研究结果表明 ,外源 GRF在肌肉组织可获得表达 ,并能提高动物体内的 GH水平     

生长抑素基因疫苗pVAX1-TRX-SS对妊娠母猪及其后代的影响

妊娠后期母猪使用电转化法肌肉注射pVAX1-TRX-SS质粒,观察其对母猪生产性能及其后代的影响。选择30头胎次相近、生理状况相似的母猪,随机分为3组,在妊娠75d时分别用活体基因导入仪注射2mg pVAX1空载体、2mg pVAX1-TRX-SS和4mg pVAX1-TRX-SS。结果表明,2 mg质粒组试验母猪后代初生重比对照组提高9.70%,4mg组比对照组高14.18%,差异都达到极显著水平(P0.01);4mg质粒组的试验母猪后代断奶重分别比对照组和2mg质粒组提高8.16%和4.13%,差异极显著(P0.01);检测血清中生长抑素抗体(SS-Ab)发现,4mg质粒组试验母猪在免疫后40d血清中SS-Ab的P/N极显著高于2 mg质粒组(P0.01),同时显著高于对照组(P0.05),阳性率达60%;对试验母猪及其后代血清激素及相关蛋白检测表明,4mg质粒组试验母猪血清催乳素(PRL)浓度比对照组高120.23%(P0.05),两试验组母猪血清中胰岛素样生长因子1(IGF-1)有比对照组升高趋势,其中4mg组比对照组高18.54%,但差异不显著(P0.05),试验母猪后代血清中的IGF-1未见显著差异(P0.05);4mg质粒组试验母猪血清IGF结合蛋白(IGFBP-3)显著高于对照组和2mg质粒组(P0.05);血清生化指标的测定结果表明,试验组母猪间及其后代间的各项指标都没有显著差异(P0.05),故该质粒对试验母猪及其后代是安全的。本试验表明pVAX1-TRX-SS质粒能引发试验母猪产生免疫反应,提高母猪的生产性能及其后代的断奶重,且对母猪及其后代安全。     

给猪注射pGRF基因质粒安全性的研究

将56头35日龄断奶DLY仔猪,随机分为4个处理,每个处理2个重复,每个重复7头猪。4个处理分别为对照组、3 mg组(第1天注射3 mg pGRF)、6 mg组(第1、45天分别注射3 mg pGRF)、9 mg组(第1天注射3 mgGRF、第45天注射6 mg pGRF)。到150 d时结束饲养试验,每个处理选择8头猪进行放血屠宰。屠宰前采试猪的全血10 mL制备血浆,分别测定血浆GH、SS和GRF的含量;屠宰后取心、肝、脾、肺和肾各一块用于制作组织切片;另取心、肝、脾、肺、肾、注射质粒部位肌肉和非注射部位肌肉各一块用于检测质粒的残留。结果表明:屠宰前各处理血浆激素的浓度没有显著差异(P>0.05),注射3 mg和6 mg使猪肝脏的器官系数显著下降(P<0.05),对其他器官和功能没有产生不良影响;注射9 mg使肝脏和肾脏产生广泛的颗粒变性。质粒的残留仅在9 mg组注射部位肌肉中能检测到。综合各项试验结果6 mg以下注射剂量的pGRF基因质粒在养猪生产上的使用是安全的。     

GHRP温控缓释系统的建立及对动物生长的影响

在体凝胶(In situgel)在药学、生物技术领域各个方面的应用,包括药物输送、细胞膜包覆和组织修复等.本试验采用了温敏缓释栽药系统,制备了GHRP-6温敏缓释系统,研究其对动物生长的影响.结果显示,Vc系獭兔肌注GHRP-6温敏缓释凝胶7、14、21、28 d后,2、4 g/L组累积增重效果分别比生理盐水组高25.83%～63.37%;肌注GHRP-6温敏缓释凝胶血清IGF-I浓度:注射7 d后,2,4 g/L组分别比生理盐水组高16.31%(P<0.05),27.98%(P<0.01);注射14 d后,2、4 g/L组分别比生理盐水组高37.43%(P<0.01)、47.17%(P<0.01);注射28 d后,2、4 g/L组分别比生理盐水组高31.71%(P<0.01)、40.14%(P<0.01).试验证明,GHRP-6温敏缓释凝胶能显著增高血清中IGF-I浓度,促进Vc系獭兔生长,血清中IGF-I浓度与Vc系獭兔累积增重呈正相关.