兔豆状囊尾蚴囊液蛋白的纯化与抗原性鉴定

为了找出抗原性强、免疫原性好的兔豆状囊尾蚴抗原蛋白,本研究对兔豆状囊尾蚴的头节、体节和囊膜等结构性抗原与囊液中代谢性抗原进行了比较,发现囊液代谢性抗原的免疫效果优于结构性抗原。通过SDS-PAGE和微孔超滤分离法对囊液蛋白进行纯化,再用纯化的蛋白免疫小鼠,制备高免血清,并对免疫鼠的免疫器官进行病理学和免疫组织化学检查。结果证明用从囊液中纯化的63 000蛋白免疫效果最好。用纯化的63 000蛋白免疫小鼠可获得高效价抗血清,小鼠免疫器官活化,巨噬细胞、滤泡树突细胞、淋巴细胞和浆细胞等各种免疫细胞增多,用免疫组织化学染色,免疫器官中的CD4、CD8T细胞和CD20B细胞呈强阳性反应。总之,从囊液中分离纯化的63 000蛋白抗原性强、免疫原性,可用于对豆状囊尾蚴病的免疫学诊断。     

O型口蹄疫病毒固相阻断ELISA抗体检测方法研究

以VP1蛋白为包被抗原,采用方阵滴定法确定抗原最佳包被浓度,最终确定固相阻断ELISA最适反应条件以及判定阈值,建立O型口蹄疫病毒衣壳蛋白抗体的固相阻断ELISA检测方法,并对该检测方法进行考核。试验结果表明,最佳抗原包被浓度为0.062 5μg/m L;兔抗血清最佳工作浓度为16 000倍稀释,酶标二抗为8 000倍稀释;抑制率大于20%为阳性,抑制率小于20%为阴性;该方法与常见病原体无交叉反应,特异性和敏感性好,可以检测O型口蹄疫病毒VP1抗体,评价口蹄疫疫苗的免疫效果。     

基于PEDV中国变异株S蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

以纯化的重组猪流行腹泻病毒(PEDV)中国变异株S蛋白为包被抗原,建立了检测PEDV流行株抗体的间接ELISA方法。所建方法最佳反应条件为:抗原最适包被量为1μg/孔,包被时间为37℃1h后4℃过夜;血清工作浓度为1∶100,作用时间为1.5h;二抗选用HRP标记的兔抗猪IgG稀释度为1∶4 000,作用时间为1.5h;显色液TMB作用时间为15min;判定标准为,样品S/P值大于等于0.058判定为阳性,小于0.045判定为阴性。所建ELISA方法具有良好的特异性和重复性。对50份疑似猪流行性腹泻血清样品进行检测,该方法与PEDV病原检测结果有较高的符合率。结果表明本研究所建立ELISA方法可用于PEDV流行株抗体检测和疫病监测。     

基于FAdV-4中国流行株Fiber2蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立

利用在大肠杆菌中表达的FAdV-4中国流行株Fiber2蛋白作为包被抗原,建立了检测抗禽腺病毒血清4型(FAdV-4)中国流行株抗体的间接ELISA方法。所建立方法的最佳条件为:抗原最适包被量为0.25μg/孔,包被时间为37℃1h,然后4℃过夜;被检血清的最佳稀释度为1∶800,作用时间为2h;二抗选用HRP标记的兔抗鸡IgY,稀释度为1∶4 000,作用时间为1.5h;显色液TMB作用条件为室温5 min。所建立ELISA的判定标准为:样品的S/P值大于或等于0.055 3判为阳性,小于0.041 8判为阴性。用建立的ELISA方法对抗鸡新城疫病毒、禽流感病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、减蛋综合征病毒阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明该方法有较好的特异性,组内和组间重复的最大变异系数为5.6%和5.7%,所建立的ELISA方法重复性良好。用所建立的ELISA方法对50份来自于疑似患肝炎-心包积液综合征病鸡的血清样品进行检测,阳性检出率为98%,与FAdV-4病原学检测结果符合率为100%。结果表明:本试验所建立的ELISA方法可用于抗FAdV-4中国流行株抗体的检测,为肝炎-心包积液综合征病监测和流行病学调查提供了方法。     

羊流产衣原体间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用

以羊流产衣原体特异性外膜蛋白POMP90a为诊断标识,将其纯化后作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法。试验的最佳反应条件为:最佳抗原浓度度为2μg/mL,血清抗体稀释度为1∶20,封闭液和稀释液用含0.5%BSA的PBST,酶标二抗稀释度为1∶5 000。由于传统的IHA试剂盒只能检测衣原体目,对于其种属不能区别,该方法比IHA适合确诊流产衣原体。因此,该研究建立的羊流产衣原体间接ELISA抗体检测方法具有良好的稳定性和可重复性,并具有较高的特异性和敏感性。     

禽流感病毒M2e特异性多肽ELISA检测方法的建立

本研究人工合成禽流感病毒H5N1亚型M2蛋白的膜外区(M2e),并偶联至半抗原载体血蓝蛋白(KLH),免疫SPF鸡,共免疫3次,每次间隔两周。所获得的阴阳性血清用于ELISA方法的建立,通过方阵滴定确定了人工合成的23肽包被96孔ELISA板的最佳浓度为5μg/mL;1%BSA为封闭液,37℃封闭3 h;被检测血清的最佳稀释度为1∶400,一抗反应时间为37℃,45 min;二抗反应时间为37℃30 min;选用TMB为底物,显色15 min,用2 mol/L H2SO4为终止液为检测血清中抗M2e抗体滴度奠定基础。根据建立的ELISA方法,检测3次免疫2周后的SPF鸡血清中抗M2e抗体,血清开始1∶100倍稀释之后做倍比稀释,测得平均滴度分别为1∶13 500和1∶20 500。     

猪嗜血支原体酶标单抗阻断ELISA检测方法的建立

为确定猪嗜血支原体(M.suis)在临床的感染情况和进行流行病学调查提供检测方法,本研究以纯化的猪嗜血支原体重组MSG1蛋白和辣根过氧化酶标记的MSG1蛋白单抗建立了检测猪嗜血支原体的阻断ELISA方法.经筛选确定,抗原最佳包被浓度为0.5μg·mL-1,待检血清最佳稀释度为1∶1,作用时间为37℃1.5h,酶标单抗最佳稀释度为1∶10 000,作用时间为37℃1h.通过对100份M.suis阴性血清阻断ELISA检测结果进行统计学分析,确定本方法的判定标准为当阻断率PI≥23.71％时判为阳性,PI≤36.35％时判为阴性,23.71％＜PI＜ 36.36％时判为可疑.敏感性、特异性和重复性试验证明该检测方法敏感性高、特异性强、可重复性好,可用于M.suis流行病学调查和疾病诊断.     

鼻气管鸟杆菌间接ELISA检测方法的建立及应用

提取A型鼻气管鸟杆菌(ORT)外膜蛋白,经纯化后包被反应板,通过方阵滴定确定最佳抗原包被浓度、血清稀释倍数、兔抗鸡酶标二抗稀释倍数,建立了检测ORT抗体的间接ELISA方法.经方阵滴定确定最佳抗原包被质量浓度为11.85 mg/L,血清样品稀释倍数为1∶20,兔抗鸡IgG辣根过氧化物酶结合物最佳稀释倍数为1∶1 000,抗原抗体最佳结合时间为1 h,血清与二抗最适反应时间为45 min.试验结果确定的判定标准为:样品D490 nm≥0.639判定为阳性,D490 nm≤0.350判定为阴性,介于两者之间的为可疑.试验证明该方法具有良好的稳定性、重复性和特异性,将205份疑似ORT的鸡血清用本方法进行检测,其阳性检出率为11.7%(24/205).     

A型塞内卡病毒VP2蛋白阻断ELISA检测方法的建立

为了建立一种检测A型塞内卡病毒(SVA)VP2蛋白抗体的阻断ELISA方法,试验用SVA VP2蛋白作为抗原包被酶标板,采用棋盘法确定最佳蛋白包被浓度和单克隆抗体最佳稀释倍数。同时对阻断ELISA的其他条件(封闭液、血清稀释度、底物反应条件)进行优化,对方法的特异性和重复性进行考察。结果表明:VP2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL;最佳封闭液为2%BSA,每孔200μL,37℃封闭1 h;待检血清最佳稀释度为1∶1,在37℃条件下作用1 h;单克隆抗体最佳稀释度为1∶40 000,在37℃条件下作用1 h;底物最佳反应条件为室温避光10 min。特异性试验结果显示,SVA阳性血清与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综征病毒、猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应。批间、批内重复性试验结果的变异系数均小于10%。对200份猪血清样本进行荧光抗体中和试验和阻断ELISA方法检测,符合率为96.0%。说明该ELISA方法具有良好的特异性和重复性,可用于塞内卡病毒血清抗体检测和流行病学调查。     

绵羊肺炎支原体抗体ELISA检测方法的建立

为了建立特异性好和敏感性高的绵羊肺支原体抗体ELISA检测方法,以绵羊肺炎支原体Y98标准菌株的全菌蛋白作为抗原,进行了反应体系和反应条件的优化筛选。结果显示:最佳蛋白抗原包被浓度为1.52μg/mL,最适封闭液及其稀释浓度为1%BSA,血清样品的稀释度为1/50,兔抗山羊IgG的最适稀释浓度为1/4 000,一抗和二抗的最佳作用时间为37℃60 min,底物显色的最佳时间为10 min;通过与绵羊肺炎支原体抗体间接血凝试验(IHA)检测结果相比,60份羊血清样品中Y98 ELISA检出阳性为33份,阴性为20份,二者的检测符合率可达到88.33%,相对特异性达90.90%。提示:建立的绵羊肺炎支原体血清抗体检测方法具有较高的检测敏感性和特异性,为绵羊肺炎支原体的抗体检测及其感染的流行病学调查提供了一种快速简便的检测工具。     

豆状囊尾蚴人工感染家兔效果研究

兔豆状囊尾蚴病是由豆状带绦虫(Taenia pisiformis)的幼虫豆状囊尾蚴(Cysticercus pisiformis)寄生于兔的肝、大网膜、肠系膜和腹腔内引起的一种绦虫蚴病。兔感染豆状囊尾蚴后由于虫体的代谢产物及囊壁破裂后囊液会引起兔中毒,降低机体免疫力,进而诱发其他疾病。目前大量研究发现氧化应激发生于许多疾病中,且对疾病具有恶化作用。     

豆状囊尾蚴与细颈囊尾蚴和宿主（兔）的同工酶,蛋白质比较研究

用聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离出豆状囊尾蚴囊液乳酸脱氢酶同工酶4～5条酶带,酯酶同工酶1条酶带,蛋白质6～9条区带;豆状囊尾蚴囊壁和头节乳酸脱氢酶同工酶3～4条酶带,酯酶同工酶无,蛋白质17条区带;细颈囊尾蚴囊液乳酸脱氢酶同工酶1～4条酶带,酯酶同工酶1～3条酶带,蛋白质7～10条区带;宿主——兔腹水乳酸脱氢酶同工酶5条酶带,酯酶同工酶3～5条酶带,蛋白质13～16条区带。并作了豆状囊尾蚴与细颈囊尾蚴囊液同工酶、蛋白质和豆状囊尾蚴与宿主的同工酶、蛋白质相互关系的详细分析,结果表明豆状囊尾蚴与细颈囊尾蚴的同工酶和蛋白质具有差异和两者可能存在交叉免疫;豆状囊尾蚴的酶蛋白和蛋白质来源独立于宿主,但在一定程度上受宿主的影响。     

华支睾吸虫间接ELISA检测方法的建立及初步应用

RT-PCR扩增华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)的Enolase基因后,进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物;以纯化后的蛋白为包被抗原建立ELISA方法,并对工作条件进行优化。结果表明,ELISA最佳工作条件为:抗原最佳包被质量浓度为5mg/L,37℃1h再4℃过夜;5%脱脂奶粉,37℃封闭1h;待检血清1∶100稀释37℃孵育1h;酶标二抗1∶5 000稀释,37℃孵育45min;TMB显色作用时间10min;确定的阴阳性血清临界值为0.253。所建立的ELISA方法特异性较好,可检测犬华支睾吸虫病阳性血清,与犬卫氏并殖吸虫病阳性血清、犬蛔虫病阳性血清、犬弓形虫病阳性血清、犬新孢子虫病阳性血清均不发生反应。该方法敏感性为1∶3 200。批间批内重复性试验变异系数均小于10%。在临床应用中,对浙江地区353多份犬血清的检测表明,样品阳性率为1.13%。本研究建立的间接ELISA方法可以用于临床病例的血清学快速检测,为华支睾吸虫的血清流行病学调查提供了有效手段。     

禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白间接ELISA检测方法的建立

对AEV陕西分离株VP1基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting检测表达产物;以纯化的蛋白为包被抗原建立ELISA方法,并对反应条件进行优化.结果表明,VP1蛋白在大肠杆菌中成功表达,产物约为50 000的融合蛋白,具有良好的反应原性;优化的ELISA最佳工作条件为:重组抗原包被质量浓度3.8 mg/L,37℃2h后4℃过夜,1％ BSA 37℃封闭2h,待检血清1∶50稀释37℃孵育0.5h,酶标抗体1:4 000稀释,37℃作用30min,底物37℃显色5 min,临界值为0.360;建立的ELISA方法特异性强、重复性好、敏感性高;临床检测180份样品,与美国IDEXX公司AEV抗体检测试剂盒检测结果符合率为91.9％.该方法可用于临床样品的大批量检测.     

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅱ蛋白的表达、纯化及其间接ELISA检测方法的建立与应用

将含有猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅱ基因的质粒pET-ApxⅡ转化到大肠杆菌BL21(DE3)。挑选出表达量最高的克隆子，于37℃经IPTG诱导表达。对表达条件进行优化，并对包涵体进行了提纯和复性。用复性后的蛋白作抗原，建立了检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗体的间接ELISA，试验的最佳反应条件为：最佳抗原稀释度为1：160，抗原包被液用Tris-HCl(pH8．0)，封闭液用含0．4％BSA的PBST，血清稀释度为1：40，二抗稀释度为1：6000，稀释液用含0．4％BSA的PBST，血清反应时间为30min，二抗反应时间为45min，底物反应时间为20min。与间接血凝(IHA)检测结果比较，建立的ELISA诊断方法具有良好的稳定性和可重复性，并具有较高的特异性和敏感性。用建立的间接ELISA对2503份临床送检血清进行了血清流行病学调查，结果表明，胸膜肺炎放线杆菌抗体的阳性率为63％。     

抗原皮试反应诊断兔豆状囊尾蚴病及吡喹酮治疗试验

<正> 兔豆状囊尾蚴在我县感染率达70％以上,使养兔生产受到一定损失,但目前尚缺简易的诊断和治疗方法。为此进行了本项试验。 一、材料与方法 (一)材料 1、选择外表健康,宰杀检查证明无其他疾病的兔的体内寄生豆状囊尾蚴包囊10—20个,收存于消毒过的容器内备用。 2、抗原的制备。用消毒过的镊子,夹取兔豆状囊尾蚴包囊放在75％酒精中消毒,凉干后,用8号针头刺破包囊,即流出豆状囊尾蚴囊泡,用镊子夹住头节,刺破囊泡流出囊泡液,装在消毒的比色杯里。用1毫升玻璃注射器吸取囊泡液备用。     

细粒棘球蚴抗原B8/2蛋白单抗的制备及夹心ELISA检测方法的建立

为建立一种早期诊断动物细粒棘球蚴病的方法,诱导表达含PET-EgAgB8/2载体的原核表达菌,以表达纯化蛋白为抗原,制备单克隆抗体,并以制备的抗体建立检测细粒棘球蚴病夹心ELISA方法。结果显示,原核表达菌在37℃诱导培养,菌体上清中大量表达,经验证为目的蛋白,用纯化蛋白免疫小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选得到9株具有良好特异性、稳定分泌单克隆抗体的细胞株,经两两配对,选择75C86/15作为包被抗体,27E57/32为酶标二抗,当包被抗体浓度为1.42μg/mL, 4℃包被过夜、用含50 g/L脱脂奶粉的PBST封闭、抗原作1∶100稀释、酶标二抗1∶1 000稀释、反应底物作用15 min时效果最佳,检测方法的特异性为98.8%,敏感性为95.3%。成功制备细粒棘球蚴抗原B8/2蛋白单克隆抗体并建立了ELISA检测方法。     

双抗夹心ELISA检测兔出血症病毒抗原方法的建立及初步评估

为建立一种快速、特异性强的用于检测兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)抗原的双抗夹心ELISA方法,本研究通过抗体配对实验,确定以抗兔出血症病毒结构蛋白VP60单克隆抗体9H9为捕获抗体,辣根过氧化物酶标记的9H9为检测抗体建立双抗夹心ELISA方法。通过优化,确定最佳条件为:0.5μg/m L稀释后的9H9作为捕获抗体,底物显色液37℃包被2 h 4℃过夜,1%明胶溶液37℃封闭2 h,用含10%胎牛血清的PBST按5μg/m L稀释后的辣根过氧化物酶标记的9H9作为检测抗体,37℃作用15 min。建立的ELISA方法与杯状病毒科其他病毒无交叉反应,应用本方法和RT-PCR方法对85份兔肝脏样品进行检测,证明双抗夹心ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,有望作为临床快速检测的一种简便方法。     

豆状带绦虫六钩蚴Tp-dUTPase基因的表达及血清学诊断效果

采用PCR方法从豆状带绦虫六钩蚴中扩增得到Tp-dUTPase基因编码区,构建了pET32a-Tp-dUTPase原核表达载体,以重组蛋白dUTPase作为包被抗原建立的兔豆状囊尾蚴病Dot-ELISA诊断方法对226份兔血清进行了检测。结果显示,Tp-dUTPase基因编码区长447bp,编码148个氨基酸,表达的重组蛋白相对分子质量为36 200,该重组蛋白能与家兔豆状囊尾蚴病阳性血清特异性结合。以重组蛋白Tp-dUTPase作为包被抗原建立的Dot-ELISA诊断方法显示有较高的特异性（85.7%~92.9%）和敏感性（86.4%~88.0%）,与其他种类兔寄生虫病阳性血清有较低的交叉反应。结果表明,纯化的Tp-dUTPase重组蛋白可作为兔豆状囊尾蚴病的诊断抗原。     

猪囊尾蚴的实验室诊断

<正>1酶联免疫吸附试验抗原采用猪囊尾蚴的囊液,经亲和层析纯化、浓缩、分装后,于-20℃保存,使用前,用0.1M pH值9.6醋酸盐缓冲液稀释,使蛋白含量为30毫克/分升.酶结合物用兔抗猪IgG免疫血清,经硫酸铵盐析沉淀,再经DEAE-纤维素纯化提取免疫抗猪IgG抗体,用辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG,经酶活力测定,应用时最适稀释浓度为1∶1000。操作方法为,以40孔聚苯乙烯微量反应为固相