小豆SSR分子标记遗传连锁图谱构建

【目的】以小豆SSR为锚定标记,将公开发表的豇豆SSR、普通菜豆SSR和EST-SSR标记定位整合到小豆遗传连锁群中,构建中国小豆遗传图谱,为小豆基因定位、图位克隆和分子标记辅助选择育种提供更多可用的分子标记。【方法】用1 473对SSR和EST-SSR引物进行PCR扩增,包括906对豇豆SSR、123对普通菜豆和196对小豆SSR引物及248对普通菜豆EST-SSR引物,筛选亲本间多态性标记,验证栽培小豆HB801×AG109及GM892×AG110的F2分离群体。【结果】整合和构建了含有145个SSR和EST-SSR标记小豆遗传连锁图谱,包括59个小豆SSR标记,新增63个豇豆SSR、9个普通菜豆SSR、14个普通菜豆EST-SSR标记和1个茎色标记。紫茎色性状被定位在第9连锁群,离CEDG022和cbess058标记的遗传距离分别为0.9 cM和0.1 cM。图谱全长823 cM,覆盖11个连锁群,每个标记间平均距离为5.64 cM。每个连锁群长度为49.1—125.6 cM,平均长度74.82 cM;每条染色体上的标记数7—26个,平均13.27个。【结论】率先把小豆近缘物种分子标记引入小豆,加密了小豆SSR分子标记遗传连锁图谱。     

梨遗传连锁图谱的构建与比较分析

【目的】利用已公开发表的梨和苹果的SSR（Simple Sequence Repeat）引物以及从梨转录组开发的SSR引物构建本研究作图群体的遗传连锁图谱,为后期梨重要性状QTL定位和分子标记辅助选择等奠定基础。【方法】以西洋梨品种‘红茄’（Red Clapp Favorite）为母本,东方梨品种‘晚秀’（Mansoo）为父本,构建F1代作图群体。将所选用的SSR引物在亲本和4个子代个体进行PCR扩增,初步筛选出扩增结果符合JoinMap 4.0软件中“CP”作图模式要求的引物,随后在F1群体中检测,选用JoinMap 4.0软件对分离数据进行连锁分析,分别构建亲本的连锁图谱。以双亲图谱在各连锁群上的同源标记作为锚定位点,对双亲图谱进行整合。【结果】利用PCR技术对不同来源的共909对SSR引物（526对梨和283对苹果公开发表的SSR引物,从梨转录组开发的100对SSR引物）进行初步筛选后,发现来自苹果的SSR引物有效扩增片段的比例和多态性均较低,而来自梨和梨转录组开发的SSR引物相对较高。筛选出207对符合作图要求的SSR引物在群体中扩增,构建亲本的连锁图谱。母本图谱中的141个标记分布在17个连锁群上,总长度757.34 cM,标记间平均5.37 cM;父本图谱中的153个标记分布在19个连锁群上,总长度1 149.43 cM,标记间平均7.51 cM。【结论】对不同来源的SSR引物构建的双亲连锁图谱进行整合,最终得到一张由186个SSR标记,覆盖基因组长度1 125.33 cM的整合图谱。     

基于SSR标记的四倍体鸭茅遗传图谱加密

【目的】利用转录组测序开发的EST-SSR标记和鸭茅基因组调研测序开发的基因组SSR（genomic-SSR）标记,对已构建的四倍体鸭茅遗传图谱加密,为定位控制鸭茅重要农艺性状的QTL位点奠定基础。【方法】基于拟测交策略,以“楷模”（高杆、多分蘖、宽叶、早熟）和“01436”（矮秆、少分蘖、细叶、晚熟）作为亲本材料进行杂交,得到一个含有214株鸭茅材料的作图群体,利用亲本和随机选取的5个单株对574对EST-SSR标记和150对Genomic-SSR进行引物筛选,PCR产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后,将扩增条带清晰、在亲本之间存在差异且子代间存在分离的多态性引物用于亲本及群体扩增。将扩增结果按标记类型统计分析,对于亲本间存在差异的条带,按条带有无（有带计1,无带记0）对DNA扩增产物按进行统计,经卡方检验,将分离比例符合1﹕1（亲本基因型为Aaaa×aaaa或aaaa×Aaaa）和3﹕1（亲本基因型为Aaaa×Aaaa）的标记,用于遗传连锁图谱构建。符合作图要求的标记采用HighMap软件进行遗传图谱构建。【结果】最终筛选出符合要求的EST-SSR引物31对和Genomic-SSR引物17对,引物多态性分别为5.4%和11.3%,总的多态性为6.6%。对鸭茅214个作图群体单株及亲本DNA进行扩增,共得到169个多态性位点,其中EST-SSR101个,Genomic-SSR68个位点。169个标记位点经卡方检验分析表明,有89个标记符合孟德尔分离规律,标记可用率为52.7%,其中呈Aaaa×aaaa或aaaa×Aaaa分离类型的标记有79个,呈Aaaa×Aaaa的有10个,其余80个为偏分离标记。将SSR标记整合以前的标记信息,重新构建了一张包含2 551个标记,覆盖7个连锁群,总长度为758.4 cM的鸭茅高密度遗传图谱。加密后的图谱包含SNP标记4 187个,SSR标记84个,各连锁群标记数在166-709个,每个连锁群的平均标记数为364个,LG1包含最多标记数有709个,LG7标记数最少166个,各连锁群长度在60.28-147.09 cM,标记平均密度为0.19-0.76 cM,总的平均图距由原来的0.37 cM缩至0.3 cM,且由于标记密度的改变,各连锁群上标记分布的位置也发生较大变动。【结论】增加了部分SSR标记后,新构建了一张包含2 551个标记,覆盖7个连锁群总长度为758.4 cM的四倍体鸭茅遗传图谱,总长度增加42.63 cM,平均图距由0.37 cM缩至为0.3 cM。     

IT-ISJ标记及其在陆地棉遗传图谱构建中的应用

【目的】开发可用于植物遗传多样性分析和遗传图谱构建的新型标记。【方法】根据植物结构基因内含子拼接位点的保守序列,设计扩增内含子的内含子-外显子拼接位点（intron targeted intron-exon splice junction,IT-ISJ）标记引物,并用于陆地棉遗传图谱构建。【结果】利用704个IT-ISJ引物组合,对陆地棉高品质品种渝棉1号和多显性基因标记系T586进行多态性筛选,获得49个多态性引物组合,占筛选引物的7.0%。49个多态性引物组合在（渝棉1号×T586）F2:7重组近交系群体270个系中检测到58个位点。以58个IT-ISJ、150个SSR和8个形态标记进行连锁分析,构建的遗传连锁图包括22个连锁群、113个位点（49个IT-ISJ、62个SSR和2个形态标记）。连锁图覆盖714.5 cM,占棉花基因组的16.1%,标记间平均长度为6.3 cM。【结论】IT-ISJ标记多态性高,可有效地用于陆地棉遗传连锁图谱的构建。     

基于新遗传连锁图谱的豇豆抗豆象QTL定位

【目的】豆象是危害豇豆最主要的仓储害虫。发掘豇豆抗豆象基因为抗性品种的选育,以及减少豆象对豇豆生产的危害奠定基础。【方法】以中豇1号（感）和Pant-lobia-1（抗）为亲本构建的包含282个株系的RIL群体为研究材料,利用人工接种法分别对282个株系接种绿豆象和四纹豆象,进行抗豆象表型鉴定,并利用两亲本对3 992个来源于绿豆、小豆和豇豆的SSR标记进行多态性筛选,然后利用筛选到的多态性标记对282个株系进行基因型分析,最后结合RIL群体各株系抗豆象表型鉴定数据和基因型分型数据,采用完备区间作图法（ICIM-ADD）进行抗豆象QTL定位分析,在此基础上构建遗传连锁图谱,并定位豇豆抗豆象基因。【结果】中豇1号和F₁籽粒的被害率均为100%,Pant-lobia-1籽粒的被害率分别为22.5%和42.5%。推测Pant-lobia-1对绿豆象和四纹豆象的抗性均为隐性遗传;筛选到182个多态性标记,利用这些多态性标记构建了一个包含11个连锁群的豇豆遗传连锁图谱,图谱总长1 065.23 cM,相邻标记间平均遗传距离为5.85 cM;经2种豆象处理,分别在连锁群1和连锁群5上检测到2个稳定的QTL位点,暂定名为vubr1-1和vubr5-1,其中vubr1-1位于标记XD11-44和HAAS_VR_2274之间,标记间的遗传距离为7.6 cM,在2种豆象处理中分别可以解释表型变异的7.16%和6.92%;vubr5-1位于标记XD1-14和CP185之间,标记间的遗传距离为2.90 cM,在2种豆象处理中分别可以解释表型变异的6.96%和6.37%。【结论】构建了一个包含11个连锁群、182个多态性标记的豇豆遗传连锁图谱,检测到2个与抗豆象相关的QTL位点。     

玉米重组自交系群体遗传图谱的构建及标记

以黄早四和Mo 17为亲本,组建了含239份重组自交系的F9代分离群体.共选取了370对SSR引物用于亲本多态性筛选,结果有126对引物能扩增出清晰的多态性条带.用这些有多态性的引物进一步作群体分析,除有23对引物扩增效果较差外,其余引物在多态性、重复性方面均表现较好.最后,用该重组自交系群体构建了玉米分子标记遗传连锁图谱,该图谱拟合了103个分布于10个连锁群的微卫星标记位点,覆盖玉米整个基因组1 455.4 cM,标记间平均图距14.1 cM.     

高丹草AFLP分子遗传连锁图谱的构建

【目的】对高丹草低氢氰酸含量及产量等重要性状进行QTL定位,构建其AFLP分子遗传连锁图谱,为分子标记辅助育种等研究奠定基础。【方法】以散穗高粱×红壳苏丹草杂种F2代305个分离单株为作图群体,利用AFLP分子标记技术先从供试AFLP引物中筛选适宜引物对,再用这些引物对对其供测群体进行PCR扩增;根据扩增原始数据,利用Join Map 3.0作图软件进行高丹草分子遗传连锁图谱构建。【结果】从113对AFLP引物组合中筛选出了25对多态性丰富、重复性好、条带清晰的适宜引物,对高丹草F2分离群体305个单株的基因组DNA扩增,得到444个AFLP分子标记位点,据此构建的高丹草遗传图谱包含10个连锁群,覆盖的基因组总长度为1 468.12cM,各连锁群的长度变幅为114.24~189.34cM,标记间平均图距为3.38cM。【结论】成功构建了一张密度较高的高丹草分子遗传连锁图谱。     

基于PCR技术的谷子分子标记遗传图谱构建

【目的】构建一张基于PCR技术的谷子分子标记遗传图谱。【方法】以谷子高146A和K103杂交自交F2分离群体为作图群体,以分布于谷子9条染色体上的81个SSR标记为主要参考标记,采用来自谷子、水稻、珍珠粟和高羊茅的SSR、STS、SNP、SV和ACGM标记共1 733个,在亲本间筛选多态性标记,并进一步在F2群体间进行验证,利用MAPMAKER VERSION 3.0软件进行连锁分析,采用MapDraw V2软件绘制遗传连锁图谱。【结果】构建了一张包含192个不同类型分子标记的谷子遗传图谱,新定位标记33个,其中32个来自谷子,另1个来自珍珠粟。遗传图谱包含9个连锁群,覆盖基因组全长2 082.5 cM,连锁群长度介于119.5-475.2 cM,平均长度231.39 cM,标记间平均距离10.85 cM,每个连锁群上的标记数介于10-37个。部分连锁群上标记存在偏分离现象,在定位的192个标记中,共有36个标记发生偏分离,占图谱总标记的18.75%,其中,在LG2、LG6和LG7上分别聚集分布了10、15和7个偏分离标记,出现了偏分离热点区域,而在LG1、LG4、LG5和LG8上仅有零星分布,LG3和LG9上则没有偏分离标记。对来自不同作物的分子标记在谷子上的可转移性分析发现,来自谷子的1 235个PCR标记中有205个标记在双亲及其F2群体间有多态性,多态率为16.60%,而来自珍珠粟、高羊茅和水稻的498个PCR标记,在该群体上仅发现1个多态性标记。【结论】利用不同物种中的分子标记构建了一张覆盖基因组长度为2 082.5 cM的谷子遗传连锁图谱,其分子标记主要来自于谷子。     

荔枝EST资源的SSR信息分析及EST-SSR标记开发

 【目的】明确荔枝EST序列中SSR的总体特点,开发荔枝EST-SSR引物,为利用EST-SSR分子标记进行荔枝种质资源遗传多样性、连锁图谱构建及亲缘关系研究奠定基础。【方法】应用SSRIT软件,按照设定标准从自行构建的一个荔枝果皮发育关键期的cDNA文库中的1 331条Unigene（惟一序列）中搜索SSR位点。利用软件Primer primer5.0设计EST-SSR引物。选用16份表型差异较大的荔枝种质资源检测引物的有效性及多态性,利用聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)进行片段分离。【结果】荔枝的1 331条EST序列中共搜索出220个SSR位点,分布于189条EST中,出现频率是16.53%。这些EST-SSR的平均长度为18.43 bp,平均分布频率1/4.42 kb。在1—6 bp的重复基元中,二核苷酸和三核苷酸重复类型占主导地位,共占总SSR的69.09%,二者出现的频率分别为37.27%和31.82%。共观察到72种重复基元,出现频率最高的是GA/TC（16.82%）;其次是AG/CT、A/T、AT/TA及GAA/TTC,频率分别为14.55%、11.82%、5.00%和3.64%。不同核苷酸数目的重复基元的重复次数差异很大。设计、合成150对EST-SSR引物,122对（81.33%）引物在荔枝中获得有效扩增,100对引物具有多态性。【结论】荔枝EST资源中含有高频率的SSR位点,且EST-SSR 标记开发效率较高。本研究为利用EST-SSR标记开展荔枝遗传研究提供了100 对EST-SSR引物,并为进一步开发荔枝EST-SSR标记提供了含SSR位点的候选序列。     

番茄 SSR 标记在茄子及其他茄科蔬菜作物上的通用性分析

【目的】利用已完成测序的番茄基因组发展大量的SSR标记,并将这些标记转移到茄子及其他茄科作物上,节省开发SSR标记的成本.【方法】本研究利用近缘物种转移法分析了番茄SSR标记在茄子及其他茄科作物上的通用性情况.【结果和结论】1 046对番茄SSR引物中有887对能在茄子基因组DNA上扩增出产物,425对引物扩增出的带型在番茄与茄子间相似程度高,标记的通用率为40.6%;EST-SSR比基因组SSR的通用性更好,前者通用率为54.5%,后者为38.9%;414个通用SSR标记被电子定位到番茄染色体上,不同染色体来源的标记通用率明显不同;93对引物在2份用于遗传图谱构建的栽培茄子亲本间表现出多态性;获得的425对通用引物在马铃薯、辣椒、枸杞上通用率分别为96.2%、78.1%、54.1%.     

草莓EST-SSR标记开发及在品种遗传多样性分析中的应用

 【目的】探讨草莓EST序列中SSR位点的分布规律,开发草莓EST-SSR引物,并分析其在草莓品种遗传多样性研究中的应用。【方法】从NCBI公共数据库下载草莓表达序列标签（expressed sequence tag,EST）55 750条,利用MISA软件查找SSR位点,并利用Primer3.0 Plus软件设计60对引物,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）研究这些SSR引物的PCR扩增特点,并对部分扩增产物进行克隆和测序,以验证其真实性。【结果】55 750条草莓EST序列含有SSR位点的序列1 334条,SSR位点1 490个。其中,二核苷酸、三核苷酸和六核苷酸重复是最主要的SSR类型,分别占36.17%、26.51%和19.87%。60对引物中有42对引物能在20个草莓品种中扩增出理想的PCR产物,其中36对引物扩增条带具有多态性。利用11对验证的EST-SSR引物分析了20个草莓品种的亲缘关系。【结论】草莓EST-SSR标记的开发对于草莓品种鉴定与遗传多样性分析具有重要应用价值。     

基于EST-SSR标记甘薯连锁图谱构建及淀粉性状的QTL定位

【目的】利用分子标记技术,构建甘薯遗传连锁图谱,并分析甘薯淀粉含量性状的QTL位点,为高淀粉含量甘薯种质资源利用及甘薯分子标记辅助育种提供理论和实践依据。【方法】以高淀粉含量品种万薯5号为母本、低淀粉含量品种商丘52-7为父本建立杂交群体,利用EST-SSR标记,采用"双假测交"策略和运用Join Map4.0软件,分别构建双亲遗传连锁图谱,并结合F1(2012、2013年)群体表型数据采用区间作图法对淀粉含量性状进行QTL检测。【结果】利用1 679对EST-SSR引物筛选出的1 045对多态性引物检测F1群体的标记基因型,获得了1 418个标记位点。分别对上述获得的父母本多态性标记进行遗传连锁分析,在LOD≥5.0情况下,分别构建父母本的连锁遗传图谱。采用642个标记的多态性位点构建母本连锁群74个,其中,215个标记位点位于连锁图谱上,占标记多态性位点总数的33.5%。每个连锁群上有2—11个标记位点,连锁群长度在0.6—129.4 cM,图谱总长为3 826.07 c M,标记间平均距离为17.80 c M。属于父本的776个标记位点构建了80个连锁群,共有252个标记位点构建在连锁图谱上,占标记总数的32.5%,每个连锁群上有2—24个标记位点,连锁群长度在2.0—156.8 c M,图谱总长为3 955.0 cM,标记间平均距离为15.7 c M。以F1杂交群体构建的遗传连锁图谱,结合2012年、2013年2个环境,利用QTL作图软件MapQTL5.0,采用区间作图法进行分析,共检测到17个与淀粉含量性状相关的QTL,贡献率在8.4%—40.5%。其中qWsc-1、qWsc-2、qWsc-3 3个QTL位于母本万薯5号连锁群上,且在2年环境中均可检测到;14个QTL位于父本商丘52-7连锁群上,qSsc-1、qSsc-2、qSsc-3、qSsc-4、qSsc-8、qSsc-10、qSsc-11、qSsc-12是在2个环境均检测到的QTL。qSsc-5、qSsc-6、qSsc-7、qSsc-9、qSsc-13、qSsc-14是只在1个环境检测到的QTL。标记GDAAS0603在双亲中和2个环境中均同时检测到,这些环境稳定QTL可用于分子标记辅助选择。【结论】分别构建了亲本EST-SSR分子标记连锁群图谱,丰富了构建甘薯图谱的标记类型,定位了17个与淀粉含量相关的QTL位点。     

梨EST-SSR标记的开发及其在梨品种遗传多样性分析中的应用评价

 【目的】分析梨EST中SSR位点分布规律,开发梨EST-SSR引物,探讨EST-SSR用于梨品种遗传差异研究的可行性。【方法】从NCBI公共数据库中下载梨表达序列标签(expressed sequence tag,EST)1 293条,利用MISA软件对其进行SSR位点查找,将符合条件的序列选出,利用Primer3.0 Plus软件设计48对引物,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)研究这些SSR引物的PCR扩增特点,并对部分扩增产物克隆与测序,以验证其真实性。【结果】1 293条梨的EST序列中含有SSR位点的序列为82条,SSR位点92个。二核苷酸、三核苷酸和六核苷酸重复是最主要的SSR类型,分别占48.91%、17.39%和17.39%。48对引物中有31对引物能扩增出理想的PCR 产物,其中27对引物扩增条带具有多态性。同时发现11对引物中,有83.87%的片段具有相应的SSR位点。聚类结果表明,梨被明显地区分成东方梨和西方梨两大群,分类效果明显。【结论】梨EST-SSR标记开发效率较高,是梨SSR标记开发的重要措施,对于梨品种的鉴定与遗传多样性分析具有重要应用价值。     

裸燕麦SSR标记连锁群图谱的构建及β-葡聚糖含量QTL的定位

【目的】构建裸燕麦分子遗传图谱,发掘燕麦β-葡聚糖基因紧密连锁的分子标记,为高β-葡聚糖含量燕麦种质资源的利用及裸燕麦分子标记辅助育种提供理论和实践依据。【方法】以高β-葡聚糖地方品种夏莜麦为父本,育成品种赤38莜麦为母本构建的包含215个F2:3家系为图谱构建群体,利用SSR分子标记进行遗传分析,构建分子遗传图谱。通过美国谷类化学会（AACC）发表的标准葡聚糖含量测定方法（AACC Method 32-23）测定各家系的β-葡聚糖含量,利用复合区间作图法进行燕麦β-葡聚糖含量性状进行遗传定位与分析。【结果】利用筛选出的231对SSR引物在F2 后代群体上进行检测,共得到261个多态性标记位点,利用JoinMap 4.0软件对上述获得多态性分子标记进行遗传连锁分析,在LOD≥5.0情况下,构建遗传图谱,得到包含26个连锁群、182个标记位点的遗传图谱,覆盖基因组1 869.7 cM,标记间平均距离为10.6 cM,每个连锁群上的标记数在2-14个之间,连锁群长度在10.6-235.1 cM。对亲本及后代群体β-葡聚糖含量的测定结果表明,β-葡聚糖含量在后代群体中表现出明显的分离,且呈现为连续变异,变异系数为18.72%,说明β-葡聚糖含量性状是受多基因控制的数量性状,群体符合QTL定位的要求。利用QTL分析软件WinQTLCart 2.5对SSR数据进行分析,采用复合区间作图法（composite interval mapping,CIM）对全基因组进行QTL扫描,以LOD值5作为阈值对β-葡聚糖含量可能存在的QTL进行定位和效应估计,检测到4个与β-葡聚糖含量相关的QTL位点,其中qBG-1位于连锁群LG20上,与最近的标记AM591的距离10.0 cM。加性效应值为0.21,可以解释的表型变异为10.9%;qBG-2和qBG-3位于连锁群LG23上,其中qBG-2与最近的标记AM1823的距离4.6 cM,qBG-3与最近的标记AM641的距离1.9 cM,加性效应值分别为-0.23和-0.22,可以解释的表型变异分别为3.2%和2.7%;qBG -4位于连锁群LG25上,与最近的标记AM302的距离6.8 cM,加性效应为0.84,可以解释的表型变异为27.6%,其中存在的2个主效QTL qBG-1和qBG -4,都来自于高β-葡聚糖含量的父本夏莜麦。【结论】构建了大粒裸燕麦SSR分子标记连锁群图谱,并定位了4个控制β-葡聚糖含量的QTL位点。