水稻AP2/EREBP转录因子响应非生物胁迫的表达谱分析

 【目的】了解AP2/EREBP家族基因参与逆境反应分子机理,为水稻抗逆相关基因的克隆及揭示水稻抗逆分子调控机理奠定基础。【方法】采用基因芯片技术分析AP2/EREBP家族基因在水稻幼苗受PEG、低温、高盐、ABA、GA等处理下的表达谱变化,并通过实时定量PCR技术对部分具有明显表达特点基因的胁迫表达谱进行验证。【结果】点制了水稻AP2/EREBP转录因子家族的基因芯片,检测到42个胁迫差异表达的AP2/EREBP基因。实时定量PCR所得结果与基因芯片结果基本吻合,说明芯片结果可靠。两个AP2/EREBP基因对所有胁迫反应相同,其它差异表达的AP2/EREBP基因对不同胁迫反应各不相同。【结论】研究发现两个AP2/EREBP基因在水稻应对外界胁迫反应中起核心分子调控作用;不同差异表达AP2/EREBP基因在水稻响应不同胁迫反应过程中具有相同或者不同的分子应答机理。     

玉米根部特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】从玉米幼根基因组DNA中克隆β-葡萄糖苷酶基因根部特异性启动子序列ZmGLU1P,并对其功能进行分析。【方法】利用PCR技术从玉米品种P138幼根基因组DNA中克隆玉米根部特异性启动子片段ZmGLU1P,将其与GUS基因融合,构建植物表达载体pCAMBIA121-ZmGLU1P,转化到EHA105根癌农杆菌中,通过根癌农杆菌介导法转化烟草NC89,对转化烟草植株进行PCR和Southern杂交检测。采集PCR和Southern杂交检测为阳性的转基因烟草的根、茎、叶,进行GUS活性的组织染色检测。【结果】克隆获得了ZmGLU1P片段,其长度为1 846 bp,与已报道的序列同源性达99%以上。转基因烟草植株的PCR和Southern杂交结果显示,成功地获得了转基因阳性植株;GUS活性检测表明,根中GUS活性最强,而在茎和叶等组织中GUS活性甚微,表明ZmGLU1P片段具有根部特异性启动子功能。【结论】玉米β-葡萄糖苷酶基因上游1 846 bp的片段ZmGLU1P具有根部特异性启动子功能,为根部特异性启动子。     

草甘膦为筛选标记的水稻高效遗传转化体系的建立

【目的】建立以日本晴愈伤组织为受体、草甘膦抗性基因CP4为选择标记基因的高效水稻遗传转化体系。【方法】以粳稻日本晴的成熟胚为试验材料,通过农杆菌介导法,将含有草甘膦抗性基因CP4的P1300载体转化日本晴的愈伤组织,分别用质量浓度为10、20和40 mg/L的草甘膦进行3轮抗性筛选,诱导分化和再生成苗;利用1 000 mg/L草甘膦对移栽成活的阳性苗进行抗性鉴定。【结果】获得145株转基因幼苗,PCR检测阳性株为128株,阳性率达88.27%;经过3轮抗性筛选后,转基因幼苗的阳性率提高;移栽成活的99株阳性苗中,65株表现为抗性,抗性率为65.66%。【结论】成功建立了以草甘膦为筛选标记的水稻转基因体系,该体系为水稻育种提供了材料,并对以抗草甘膦基因作为筛选标记的水稻转基因和一些基因功能验证提供了技术支持。     

拟南芥bZIP23基因过量表达载体的构建及过表达植株的筛选

[目的]以拟南芥为材料克隆bZIP23基因,构建bZIP23基因的过量表达载体和筛选过表达植株,为验证其功能奠定基础.[方法]提取拟南芥总RNA和RT-PCR克隆bZIP23基因,用限制性内切酶切割和T4 DNA连接酶连接,使bZIP23基因连接到35S强启动子的pART27载体上;将连接产物转化到Trans1-T1感受态细胞中,筛选阳性单克隆进行菌落PCR鉴定并测序验证,获得重组质粒.将该重组质粒电激转化至根瘤农杆菌GV3101菌株,浸花法转化拟南芥野生型植株.[结果]通过单菌落PCR鉴定和DNA测序结果显示,bZIP23基因与35S过量表达载体已连接,获得了重组载体;抗性筛选与遗传鉴定获得相应的转基因过量表达阳性植株.[结论]构建的过量表达载体及筛选得到的过量表达植株为验证bZIP23基因功能奠定了基础.     

广西野生稻耐冷性鉴定与遗传纯合研究

【目的】筛选耐冷性强的野生稻种质,研究野生稻耐冷性遗传的稳定性,为水稻耐冷性育种和研究提供抗源。【方法】利用人工气候箱对收集的广西野生稻资源进行苗期耐冷性鉴定,在桂北高寒山区自然低温条件下进行宿根期耐冷性评价;选择耐冷性较强的材料通过连续套袋自交或花药培养进行耐冷性遗传纯合研究。【结果】筛选出苗期1级耐冷材料广西普通野生稻20份,广西药用野生稻1份,普通野生稻花培株系92份;宿根期3级耐冷材料广西普通野生稻43份,药用野生稻2份,普通野生稻花培株系5份;耐冷性较强的直立或半直立型种质8份;广西普通野生稻苗期和宿根期耐冷性呈极显著正相关(r=0.26),广西药用野生稻苗期和宿根期耐冷性相关性不显著(r=-0.11);广西普通野生稻在苗期耐冷性与宿根期耐冷性上,平均耐冷等级均表现为匍匐型耐冷性最强,倾斜型次之,半直立型与直立型间无差异且最弱;来自桂北的野生稻苗期耐冷性最强;来自桂南的野生稻宿根期耐冷性表现最强。【结论】鉴定筛选出的材料可用于耐冷育种及抗逆机理研究。筛选出的材料可用于水稻耐冷性研究和育种,同时可以通过套袋自交与花药培养加快获得耐冷性更强的纯合株系。     

燕麦Actin基因片段的克隆及序列分析

【目的】克隆与分析燕麦肌动蛋白基因片段.【方法】根据其他植物Actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以燕麦叶片总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出Actin基因片段并克隆到PUCm-T载体,进而转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞.阳性克隆经PCR鉴定后进行测序.【结果】扩增片段长678bp,共编码225个氨基酸;所得序列与GenBank中注册的Actin基因序列的同源性均在85%以上,与其他肌动蛋白的氨基酸序列的同源性达93%以上.【结论】系统进化分析表明,扩增到的燕麦肌动蛋白基因与羊草、长穗偃麦草和黑麦草等植物的肌动蛋白基因亲缘关系最为密切.     

不结球白菜抗病基因同源序列的克隆及分析

【目的】利用同源序列法分离不结球白菜抗病基因同源序列。【方法】根据植物抗病基因TIR-NBS-LRR保守区设计简并引物，对不结球白菜基因组DNA及cDNA进行PCR扩增。【结果】获得了10个具有通读氨基酸序列的片段。同源性比较发现，该10个片段均属于TIR-NBS-LRR类抗病基因同源序列（RGA），与已知R基因相应区段的氨基酸序列一致性为50%～66%。与已知抗病基因聚类分析结果显示，该10个RGA序列可以分为5大类。利用RGA950作为探针进行Southern杂交，结果表明，其在基因组中存在多拷贝。【结论】本研究成功获得了不结球白菜RGA序列，为进一步克隆不结球白菜的R基因奠定了基础。     

基于花粉介导法转化的玉米自交系抗病植株的获得

【研究目的】将几丁质酶基因导入玉米自交系,获得抗玉米丝黑穗病的转基因植株。【方法】采用花粉介导法进行转化,获得的种子及后代植株检测方法包括：潮霉素抗性筛选、PCR扩增、Southern blot杂交分析以及田间抗病鉴定。【结果】通过转化获得种子43粒,对种子进行潮霉素抗性筛选得到9株抗潮霉素植株;经PCR检测,Southern blot杂交分析得到5株转基因植株。田间抗病鉴定结果显示,转基因植株或株系的丝黑穗病抗性提高1～2级。【结论】花粉介导法转化玉米自交系是获得抗病育种材料的一条快捷、有效的途径。     

β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因ihp-RNAi表达载体的构建

【目的】构建β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因具有功能性间隔序列的发夹结构（Intron-hairpin RNAi,ihp-RNA）的RNA干扰(ihp-RNAi)表达载体并转化大豆,为通过RNA干扰技术改良大豆的营养品质奠定基础。【方法】以大豆总RNA反转录获得的cDNA为模板,通过PCR扩增克隆了β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因的核心保守序列(400 bp),并将该片段的反义和正义片段插入到重组植物表达载体p3301P的种子特异性启动子7αp下游,将功能性间隔序列intron-SSR插入反义片段与正义片段之间,构建α′-亚基基因ihp-RNAi安全型表达载体p3301-PFNZ-α′-BADH,并进行PCR及双酶切鉴定。利用农杆菌介导法将带有p3301-PFNZ-α′-BADH 的菌株转化“吉农27”大豆植株,对转基因植株进行PCR、Southern杂交检测,并对转基因植株α′-亚基基因的表达量进行RT-PCR。【结果】成功构建了β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因ihp-RNAi表达载体p3301-PFNZ-α′-BADH,利用农杆菌介导法转化大豆得到7株阳性转化植株;Southern杂交结果显示,外源基因以1～2个拷贝整合于大豆基因组中;RT-PCR检测表明,β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因的表达被明显抑制。【结论】成功构建了β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因ihp-RNAi表达载体,获得了α′-亚基基因被明显抑制的转基因大豆植株,为应用基因工程技术进行大豆品质改良奠定了基础。     

应用半乳糖表型差异高效筛选α-1,3半乳糖苷转移酶基因缺失的猪成纤维细胞

【目的】筛选α-1,3半乳糖苷转移酶(α1,3galactosyl transferase,GGTA1)基因缺失的猪成纤维细胞。【方法】用同源重组载体pBS-GGTA1-SKO和pBS-GGTA1-DKO电转染GGTA1单等位基因敲除(GGTA1+/-)的五指山小型猪胎儿成纤维细胞,利用磁激活细胞分选(MACS)、MACS联合流式细胞术(FACS)、TcdA联合FACS等3种方法进行细胞筛选;对MACS筛选获得的单细胞克隆进行PCR和FACS鉴定,对MACS联合FACS、TcdA联合FACS获得的细胞集落进行PCR鉴定。【结果】经MACS筛选获得了11个细胞克隆,经鉴定2个是GGTA1-/-细胞克隆,阳性率为18.2%;MACS联合FACS筛选获得了3个细胞克隆,经鉴定无GGTA1-/-细胞克隆,阳性率为0;TcdA联合FACS筛选获得了3个细胞克隆,经鉴定均为GGTA1-/-细胞克隆,阳性率为100%。【结论】MACS法筛选和TcdA联合FACS法筛选这2种方法均可以高效筛选出GGTA1双等位基因缺失的猪成纤维细胞,可用于进一步制备供异种器官移植的基因修饰小型猪。     

过量表达转录因子OsbZIP60对水稻抗热和抗旱能力的研究

 【目的】利用转基因技术研究转录因子OsbZIP60的生物学功能,为培育抗逆水稻、减轻高温干旱对水稻的伤害奠定基础。【方法】构建水稻OsbZIP60的过表达载体pHB-OsbZIP60,通过根癌农杆菌介导的遗传转化法将其导入水稻品种日本晴,通过观察转基因植株和野生型植株在胁迫条件下的表型差异,分析其生物学功能。采用半定量PCR和荧光定量PCR检测OsbZIP60的表达模式以及其在转基因植株中的表达水平。【结果】在转基因植株中,OsbZIP60表达量明显高于野生型日本晴植株。OsbZIP60的表达受热信号诱导,在热激条件下,转基因植株的OsbZIP60表达量进一步升高。OsbZIP60在水稻各组织中均有表达,且在成熟植株叶片中表达量最高。转基因植株与野生型相比具有更强的抗胁迫能力,并且离体部分失水率更低。【结论】水稻转录因子OsbZIP60在水稻热胁迫和干旱胁迫应答中具有重要的作用,过量表达转录因子OsbZIP60能够增强水稻的抗热和抗旱能力。     

干旱胁迫下大豆幼苗根系基因的表达谱分析

【目的】了解干旱胁迫下大豆幼苗根系的抗旱机制。【方法】利用基因芯片技术,分析在不同干旱胁迫时间下强抗旱品种晋豆23幼苗根部基因的表达情况。【结果】获得了61171个大豆根系基因的差异表达动态图谱。在不同干旱胁迫时间下根部基因的表达发生变化,3个时间点下,下调表达的基因数量均多于上调表达的基因数量。同时对杂交数据进行多种聚类分析。利用实时荧光定量PCR验证4个基因在干旱胁迫条件下的差异表达,其结果和芯片杂交分析的结果基本一致。【结论】初步建立了大豆幼苗根系干旱胁迫应答基因的动态表达谱,并通过其动态表达了解植物与逆境的互作机制,比较全面地获得了干旱胁迫应答基因,从而更完整地揭示了大豆干旱胁迫应答基因的表达情况。     

水稻木葡聚糖内糖基转移酶基因OsXTH11过表达的作用分析

【目的】利用转基因技术对水稻XTH（OsXTH11）进行分析,了解其在水稻生长发育调节和逆境应答中的作用。【方法】构建OsXTH11过表达载体,利用农杆菌介导法将其导入水稻品种日本晴,通过对转基因植株进行表型分析和分子检测验证OsXTH11功能。【结果】Real-time PCR分析结果表明,转基因植株中OsXTH11表达水平明显提高。对T1转基因幼苗的表型分析显示,在正常生长条件下,转基因幼苗生长速度快于野生型;对赤霉素（GA）和生长素（IAA）的响应程度强于野生型;在黑暗和深水条件下,茎伸长速度均显著快于野生型;对100 mmol•L-1 NaCl的耐受能力也优于野生型植株。【结论】过量表达水稻木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶基因OsXTH11的转基因植株表型显示,OsXTH11在水稻生长发育和抗盐胁迫中发挥作用。     

花期干旱胁迫对籼稻近等基因系水分和光合生理的影响

【Objective】An indica near-isogenic rice lines were treated with drought stress at flowering stage to study water and photosynthetic physiology changes of flag leaf. By analyzing the relationships among agronomic phenotype characters, water and photosynthetic physiology changes and fertility of rice, the authors try to accumulate data for drought tolerance evaluation of rice.【Method】The rice materials were suffered with drought stress begin from heading of main shoot for 15 days, water and photosynthetic physiology parameters were measured after treatment.【Result】The results showed that the indica near-isogenic rice represented various drought tolerance, and there was no correlation between drought tolerance and agronomic phenotype characters, neither with physiological activities of rice under well watered condition. However, under drought stress at flowering stage, the correlation coefficient between drought resistance indexes and changes of water content of flag leaf, water potential of flag leaf, stomatal conductance of flag leaf were 0.614**, 0.514** and 0.541**, respectively. This indicates that rice drought tolerance has a correlation with changes of water content, water potential and stomatal conductance. In addition, except the correlation coefficient between drought resistance indexes and changes of Fv/Fm of flag leaf (0.470*), there was no correlation between rice drought tolerance and photosynthetic physiology.【Conclusion】In summery, the changes of water physiology parameters could be used as indicators for screening rice with drought tolerance.     

银中杨DREB基因的克隆及表达

【目的】克隆银中杨抗逆转录因子DREB基因,为其功能的深入研究奠定基础。【方法】根据DREB AP2/EREBP保守区设计1对简并引物,采用PCR方法对银中杨（Populus albaxp）转录因子DREB基因中间片段进行克隆;再利用反向PCR方法对该基因的旁侧序列进行克隆,最终将两侧序列与中间片段拼接得到基因全长;同时,根据基因序-列设计1对特异引物,利用荧光定量PCR分析银中杨DREB基因在不同逆境胁迫中的表达情况。【结果】成功地从银中杨中克隆到1个DREB基因,命名为PaDREB（注册号：EF582843）。该基因序列长935 bp,ORF为819 bp,编码272个氨基酸;同源性比较与系统发育分析证实,银中杨DREB属于DREB转录因子家族,并与月季DREB2C具有较高的同源性;荧光定量PCR检测结果显示,盐、低温、干旱及ABA均能诱导DREB基因的表达。【结论】首次从银中杨中分离并克隆了DREB基因,并证实其参与了银中杨对盐、低温、干旱及ABA的应答。     

利用水稻C0t-1 DNA和基因组DNA对栽培稻、药用野生稻和疣粒野生稻基因组的比较分析

【目的】研究中高度重复序列在稻属不同物种基因组进化中的作用。【方法】用栽培稻C0t-1 DNA和基因组DNA(gDNA)作为探针，分别对栽培稻、药用野生稻和疣粒野生稻进行荧光原位杂交(FISH)和比较基因组杂交(CGH)。【结果】C0t-1 DNA覆盖栽培稻、药用野生稻和疣粒野生稻基因组比例(%)和大小(Mb)分别为47.10±0.16，38.61±0.13，44.38±0.13和212.33±1.21，269.42±0.89以及532.56±1.68。栽培稻gDNA在药用野生稻和疣粒野生稻基因组中的覆盖率约为91.0%和93.6%，含量分别约为634 Mb和1123 Mb，各有365 Mb和591 Mb不属于源自栽培稻基因组的中高度重复序列，未被栽培稻gDNA所覆盖的部分，分别为64 Mb和78 Mb左右。此外，以C0t-1 DNA的组成为依据，对这3个种核型进行了同源性聚类。【结论】稻属中度和高度重复序列和功能基因一样，在不同种中也存在着高度同源性和保守性，并在进化过程中得以保存下来。药用野生稻和疣粒野生稻基因组增大的重要原因之一，可能是基因组中度和高度重复序列加倍的结果，药用野生稻这种序列扩增相对疣粒野生稻要缓和得多。另外，这两个野生种在长期进化过程中，由于存在加倍、重排和基因选择性丢失等现象，形成了具有自己种的特异性的基因组成分。     

籼型和粳型水稻响应孕穗期干旱胁迫的生理特性差异

【目的】系统比较分析籼稻和粳稻响应孕穗期干旱胁迫的生理特性差异,以期为后续解析籼、粳型水稻抗旱能力差异的生理机制打下前期基础。【方法】以具有不同耐旱能力的籼稻珍汕97B（ZS97B）和粳稻日本晴（NP）为材料,以正常浇水保持土壤湿润为对照,孕穗期停止浇水,干旱胁迫10 d后分别检测不同处理的水稻气孔密度、气孔开放度、光合指标、蒸腾指标、水分生理相关指标、抗氧化酶活性及丙二醛含量等;干旱处理13 d后复水,统计复水10 d后水稻存活率,比较分析孕穗期ZS97B和NP对干旱胁迫的适应性。【结果】孕穗期停止浇水10 d后,ZS97B的存活率为90.3%,极显著高于NP（77.8%）（P<0.01,下同）;干旱胁迫对2种水稻的气孔密度和气孔运动均无显著影响（P>0.05）,但ZS97B的气孔密度在处理前后显著（P<0.05,下同）或极显著高于NP;尽管ZS97B的叶卷曲度更大,但其净光合速率并没有受到更严重影响,ZS97B的净光合速率下降31.2%,而NP下降62.9%;此外,干旱胁迫下NP的叶片失水速率上升,其叶片功能损伤更严重;ZS97B在干旱胁迫后叶片POD活性极显著上升至32.46 U/（g·min）,对干旱胁迫的响应更快,而NP的MDA含量也在干旱胁迫后显著上升至1.55 μmol/g,表明叶片细胞膜损伤程度更严重。【结论】与粳稻品种NP相比,籼稻品种ZS97B更高的气孔密度缓解了孕穗期干旱胁迫下其光合速率的降低;同时,ZS97B通过增加叶卷曲度而降低叶片蒸腾速率;此外,ZS97B抗氧化酶系统的迅速响应也能有效清除活性氧,减少细胞膜损伤,对孕穗期干旱胁迫的适应性更强。     

新疆冬小麦品种资源萌发期耐旱性鉴定与筛选

【目的】研究新疆冬小麦品种资源萌发期耐旱性鉴定与筛选,为选育抗旱性强的冬小麦品种提供种质依据。【方法】以新疆地方134个冬小麦品种和54个育成品种为材料,利用PEG-6000模拟干旱鉴定材料的萌发期耐旱性。【结果】地方品种的芽长、根长、芽鲜重、根鲜重和根冠比受旱胁迫影响程度大于育成品种,除个别指标间无相关性外,多数指标间均存在较大的相关性,确定4个独立的主成分作为耐旱性鉴定综合指标,材料分为5个耐旱性级别,134个地方品种中有7个高耐品种,54个育成品种中有3个高耐品种、18个耐旱品种,3个高耐品种均为伊犁地区选育的品种;18个耐旱品种中包括北疆地区的主栽品种新冬18号和南疆喀什地区的主栽品种新冬20号。【结论】筛选出10份强抗旱的新疆冬小麦品种。     

水稻干旱胁迫诱导DNA甲基化时空变化特征分析

 【目的】研究水稻抗旱导入系DK106和旱敏感轮回亲本IR64苗期和分蘖期干旱胁迫前后DNA甲基化的变化情况,并比较分析叶片和根部DNA甲基化变化特征,探讨DNA甲基化在水稻干旱胁迫反应中的作用。【方法】用甲基化敏感扩增多态性技术（methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP）和高效液相层析（high performance liquid chromatography,HPLC）方法分析DNA甲基化变化情况;从聚丙烯酰胺凝胶回收甲基化多态性片段并克隆测序及序列比对。【结果】MSAP分析结果显示,水稻基因组中约有20%的CCGG位点发生了胞嘧啶甲基化;水分胁迫导致DNA甲基化平均水平明显增加,其中根部增加幅度尤为明显;DNA甲基化水平及状态变化在品种间存在差异,同时具有时期及组织特异性。对干旱胁迫特异诱导DNA甲基化片段序列分析结果表明,基因编码区和非编码区发生DNA甲基化的频率基本相同。【结论】干旱胁迫反应过程中DNA甲基化表现出一定时空特异性和品种特异性,且与品种抗旱性差异相关。     

转入OsLTP对甘蓝型油菜耐盐水平的影响

【目的】验证OsLTP对油菜耐盐胁迫的影响。【方法】构建高效表达载体pCAM2300-35S-LTP-Ocs,使用农杆菌介导的油菜下胚轴转化方法,将来自巴西旱稻的OsLTP导入到甘蓝型油菜扬油6号中。通过PCR和Southern杂交验证转基因植株,并测定不同浓度NaCl胁迫下转OsLTP植株的生物量和生理指标,鉴定其耐盐性。【结果】分子鉴定表明运用上述方法成功地将外源OsLTP导入甘蓝型油菜中。在100 mmol•L-1 NaCl和200 mmol•L-1 NaCl处理下,转基因后代植株的生物量、叶绿素积累量、PSⅡ活性和叶片抗氧化酶活性均比非转基因植株高,而叶片MDA含量低于对照。【结论】导入的OsLTP通过保持叶片中PSⅡ的活性,维持叶绿素的积累,提高抗氧化酶活性等途径来提高转基因甘蓝型油菜的耐盐水平。