转Bt基因抗虫红麻福红952后代的分子杂交验证

利用花粉管通道法将抗虫质粒DNA导入受体红麻品种福红952,在受体品种中获得Bt抗虫目的基因的表达.分别用PCR和Southern杂交技术,对所转化的红麻转基因4个世代的株系进行分子验证,结果表明：4个世代中都检测到B t抗虫目的基因片段,说明外源基因已经整合到红麻的基因组中并获得了稳定遗传.     

农杆菌浸蘸柱头创制高品质抗虫棉研究

选育高品质杂交棉主要利用双亲纤维品质的平均优势,要求双亲均为高品质棉。而选育高品质抗虫杂交棉要求至少有一个高品质亲本包含抗虫基因。目前,由于缺乏高品质抗虫资源限制了高品质抗虫杂交棉选育。为了获得更多高品质抗虫棉种质,以10个高品质陆地棉品种(系)作为受体,用农杆菌菌液浸蘸棉花柱头的转化方法将Bt+Sck双价抗虫基因导入高品质陆地棉基因组,获得了63个转基因株系,通过卡那霉素抗性检测、PCR和免疫试纸检测,证明目的基因已整合到受体基因组中,该检测方法结合系统选育获得了多个转基因纯合系。对最早获得的3个纯合系进行了可靠的Southern验证、抗虫性检测和纤维品质测定,其转基因株系具有较高抗虫性和优良纤维品质。这些材料的获得为下一步进行高品质抗虫杂交棉的培育奠定了坚实基础。     

抗虫基因Cry1C转化大豆的研究

[目的]将对鳞翅目害虫具有抗性的抗虫基因Cry1C转入大豆中,获得对田间鳞翅目害虫具有抗性的大豆材料.[方法]利用农杆菌介导法将抗虫基因CrylC转入大豆品种Williams82中,并通过Bar试纸条及PCR方法对所获得的转化苗进行鉴定.[结果]获得28株阳性大豆转化植株.[结论]初步认定CryIC基因已整合到大豆基因组中.     

转CryIA和CpTI双价抗虫基因大豆的获得与稳定表达

【目的】将抗虫基因转入栽培大豆中,提高大豆的抗食心虫能力。【方法】利用大豆未成熟子叶体细胞胚发生系统高效转化体系,将携带有人工合成的CryIA杀虫基因和CpTI基因的高效双价杀虫基因植物表达载体pGBI121S4ABC转化到大豆主栽品种吉林20与吉林27中。【结果】GUS活性分析、PCR、Southern blot检测证明,目的基因已整合到受体大豆基因组中。T1代转基因大豆抗虫测定表明,转基因材料虫食率比对照显著降低,抗虫能力显著提高。【结论】T3～T5连续3代接虫测定结果表明,转基因大豆株系0-195和0-150的虫食率均比对照低大约30%,其抗虫能力已基本稳定。     

高品质抗虫棉花新种质的培育

以3个野生棉种质渐渗系为基础材料,通过与转Bt基因抗虫棉品种(系)杂交,利用常规育种程序,开展高品质抗虫棉花新种质的培育.通过对9份杂种后代的高世代品系进行抗虫性状的标记基因检测、抗虫性鉴定、农艺性状鉴定和纤维品质检测,培育出4份高品质抗虫棉花新种质.高品质抗虫棉花新种质系可以作为高品质、高产、抗病虫棉花新品种选育的桥梁亲本,多目标性状聚合到同一亲本中,有利于加速育种进程.     

利用分子标记辅助选择技术培育抗虫水稻品种的研究

Bt基因是从苏云金芽孢杆菌中克隆出的针对鳞翅目害虫的抗虫基因,经过基因工程方法人工改造已经获得Cry1Ab/Ac、Cry1C等抗虫基因。以云南主栽水稻品种楚粳28为受体,以携带Bt抗虫基因的"华恢1号"、"RJ-5"和"T1C-19"分别作为供体,利用分子标记辅助选择(MAS)技术进行回交育种,选育成携带Bt抗虫基因水稻新品系。结合农艺性状表现,获得了云抗虫稻1号、云抗虫稻2号、云抗虫稻3号Bt蛋白高表达的水稻抗虫品系。这些抗虫品系为云南省抗虫水稻的遗传改良和生产应用提供了基因资源和应用基础。     

抗虫基因导入对棉花形态产量性状的影响

从棉花形态性状和产量形成特征2个方面比较系统地研究了抗虫基因导入对棉花农艺性状的影响,研究结果表明：转基因抗虫棉的单株结铃数、成铃率高于其受体品种;单株果枝数、单株果节数、铃重、衣分低于受体品种。抗虫基因导入引起的结铃性增强效应与铃重、衣分减弱效应相平衡,使得转基因抗虫棉的皮棉产量与受体品种基本持平。     

红麻查尔酮合成酶及其异构酶基因的克隆与表达分析

[目的]克隆红麻查尔酮合成酶(CHS)及其异构酶(CHI)基因并构建CH基因的植物表达载体,为进一步研究其在红麻育性及抗逆性中的作用奠定基础.[方法]提取红麻不育系(P3A)、保持系(P3B)花药RNA和DNA,以红麻花药转录组高通量测序数据为基础,利用同源克隆技术获得CHS和CHI基因,并利用载体重组技术构建CHS基因植物表达载体.[结果]红麻CHS基因cDNA全长序列为1236 bp,包含一个1170bp开放阅读框,编码389个氨基酸;其DNA序列全长为1329bp,包含2个外显子和1个内含子.CHI基因cDNA序列为724 bp,最大开放阅读框为630bp,编码209个氨基酸;其DNA序列全长为1087 bp,包含4个外显子和3个内含子.[结论]成功克隆获得红麻CHS和CHI基因的序列,构建的CHS基因植物表达载体pBI121-CHS可用于该基因功能的研究.     

转基因抗虫棉农艺性状及光合特性

以转基因抗虫棉中棉所41、SGK321、郑199和其相应的受体品种中棉所23、石远321、中棉所12为试验材料,研究抗虫基因导入对棉花生长发育的影响。结果表明,转基因抗虫棉株高低于其受体品种,单株结铃数、成铃率高于其受体品种,铃质量、衣分低于其受体品种。抗虫基因导入引起的结铃性增强效应与铃质量、衣分减弱效应相平衡,使得转基因抗虫棉的皮棉产量与其受体品种基本持平。转基因抗虫棉的光合强度和叶绿素含量在7月8日以前低于其受体品种;7月8日-7月26日高于其受体品种;7月26日以后递减速率高于其受体品种。     

Bt转基因抗螟虫粳稻新品系选育策略与进展

以克螟稻或其衍生抗虫材料为亲本,与农艺性状优良的粳稻品种杂交,经常规筛选、花药培养、分子辅助选择等手段进行选育,结果表明:采用分子辅助选择手段对育种材料进行检测,并通过加大双亲遗传距离,或采用与最新高产品种杂交,以及增加低世代(F2和F3)群体规模,均有利于打破克螟稻中转基因和其它不良基因可能存在的连锁关系,增加获得高产抗虫株系的机会,同时,发现回交、花培技术可以迅速获得B t转基因纯合的新品系。此外,采用上述方法育成了6个集高产和抗虫于一体的优良粳稻新品系,经品比试验和田间抗虫试验,选育出的转基因新品系较克螟稻极显著增产,其中1个新品系的产量与当前本地主栽品种(秀水63)相仿,田间表现高抗鳞翅目害虫。     

红麻miR394基因的克隆及CRISPR/Cas9载体构建

为探明miRNA在红麻中的功能,以红麻基因组DNA为模板,根据红麻microRNA(miRNA)高通量测序数据结果,克隆红麻miR394前体基因序列,并构建CRISPR/Cas9载体。结果表明红麻miR394前体基因序列大小为175bp,用Mfold在线软件分析,其前体序列能形成稳定的二级结构。根据红麻miR394前体基因序列,设计合适的CRISPR/Cas9靶标序列,利用改良的CRISPR/Cas9多靶点载体系统,以AtU3b和AtU6-29质粒为模板,使用Overlapping PCR法构建AtU3b-sgRNA和AtU6-29-sgRNA表达盒,使用Golden Gate Cloning方法成功把靶标AtU3b-sgRNA和AtU6-29-sgRNA表达盒构建到pYLCRISPR/Cas9载体中,并将构建好的载体命名为pCas9-miR394。分离红麻叶片原生质体,将pCas9-miR394载体转入红麻叶片原生质体中进行瞬时表达,测序结果表明:2个靶点Target site 1(T1)和Target site 2(T2)处都发生碱基突变,表明pCas9-miR394载体在红麻原生质体中具有靶向切割的活性。     

转抗虫基因林木在害虫控制中的作用与合理利用途径

在简要回顾了转抗虫基因植物研究和利用的现状后，指出转基因植物利用中可能出现的问题主要有转基因植物的遗传变异、基因逃逸、反目标效应和对生物多样性与生态系统过程的不利影响。转抗虫基因植物的抗虫效应表现为致死效应、抑制生长发育和生态抗虫效应；提出了基于森林有害生物可持续控制的转基因植物合理利用对策，即加强生态安全性研究、实施基因交互策略、生态整合控制策略、应用屏障保护效应和保护遗传多样性策略。     

转基因抗虫棉对棉铃虫抗虫性研究

用转Bt、CPTI基因的抗虫棉材料进行抗虫性试验。研究结果表明 :1 导入不同外源基因的转基因抗虫棉因其杀虫机理不同而对棉铃虫抗性存在差异 ;2 随种植世代一代、二代、三代、五代其对棉铃虫的抗虫性下降 ;3 转基因抗虫棉的蛋白毒性在棉铃虫体内具有一定的残效 ;4 棉铃虫四龄以上幼虫对转Bt基因抗虫棉产生明显的抗性。     

转基因抗虫棉根际卡那霉素抗性细菌种群动态及npt II基因漂移检测#br#

【目的】研究转基因抗虫棉根际卡那霉素抗性细菌的种群动态,检测转基因棉卡那霉素抗性细菌npt II基因漂移。【方法】采用常规培养方法分析了转基因抗虫棉GK12、GK19、33B、SGK3,常规棉泗棉3号、33、石远321等7个棉花品种根际卡那霉素抗性细菌种群在棉花整个生育期的种群动态变化。以质粒pBI121为对照,设计npt II基因特异性引物,采用PCR方法对分离的根际卡那霉素抗性细菌菌株进行npt II基因漂移检测。【结果】7个棉花品种根际卡那霉素抗性细菌数量随时间延长而减少,同一棉花品种不同采样时间卡那霉素抗性细菌数量差异显著,而同一采样时间抗虫棉和对应的受体棉间差异不显著。Simpson、Shannon-Wiener多样性指数以及Pielou均匀度指数计算结果表明,受体棉根际卡那霉素抗性细菌群落的多样性高于转基因棉。PCR检测结果表明,21株卡那霉素抗性细菌菌株中18株发现有阳性片段,但其测序结果与卡那霉素抗性基因序列比对的同源性未能达到100%,不能判断npt II是否发生了转移。【结论】根际卡那霉素抗性细菌的数量在转基因棉与对应受体棉之间差异不显著,受体棉根际卡那霉素抗性细菌群落多样性指数高于转基因棉,更均匀稳定。未发现转基因棉卡那霉素抗性标记基因npt II向根际细菌的基因漂移。     

利用棉花寡核苷酸芯片研究红麻花药表达谱的可行性分析

利用Agilent棉花寡核苷酸表达谱芯片,以2个同核异质的红麻材料P3A和P3B为试材,分析了棉花表达谱芯片应用于红麻表达谱研究的可行性。结果表明:芯片杂交扫描图像信号清晰,信噪比较高,整体背景较低,各阳性质控点信号均匀一致,空白点和阴性质控点信号低。P3A在棉花的寡核苷酸芯片上共检测到37 640个表达位点,占芯片总位点的85.93%;P3B在棉花的寡核苷酸芯片上共检测到37 629个表达位点,占芯片总位点的85.90%。34 290个探针在不育系和保持系中均具有显著的杂交信号,占总探针数43 803的78.28%。表明红麻花药cRNA与棉花表达谱芯片上寡核苷酸探针之间的远缘杂交非常有效,用棉花寡核苷酸芯片研究红麻的基因表达是可行的。     

转基因抗虫棉根际卡那霉素抗性细菌种群动态及nptⅡ基因漂移检测

【目的】研究转基因抗虫棉根际卡那霉素抗性细菌的种群动态,检测转基因棉卡那霉素抗性细菌nptII基因漂移。【方法】采用常规培养方法分析了转基因抗虫棉GK12、GK19、33B、SGK321,常规棉泗棉3号、33、石远321等7个棉花品种根际卡那霉素抗性细菌种群在棉花整个生育期的种群动态变化。以质粒pBI121为对照,设计nptII基因特异性引物,采用PCR方法对分离的根际卡那霉素抗性细菌菌株进行nptII基因漂移检测。【结果】7个棉花品种根际卡那霉素抗性细菌数量随时间延长而减少,同一棉花品种不同采样时间卡那霉素抗性细菌数量差异显著,而同一采样时间抗虫棉和对应的受体棉间差异不显著。Simpson、Shannon-Wiener多样性指数以及Pielou均匀度指数计算结果表明,受体棉根际卡那霉素抗性细菌群落的多样性高于转基因棉。PCR检测结果表明,21株卡那霉素抗性细菌菌株中18株发现有阳性片段,但其测序结果与卡那霉素抗性基因序列比对的同源性未能达到100%,不能判断nptII是否发生了转移。【结论】根际卡那霉素抗性细菌的数量在转基因棉与对应受体棉之间差异不显著,受体棉根际卡那霉素抗性细菌群落多样性指数高于转基因棉,更均匀稳定。未发现转基因棉卡那霉素抗性标记基因nptII向根际细菌的基因漂移。     

浅析抗虫基因种类及抗虫原理

概述了目前植物抗虫基因工程中应用较广的Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、外源凝集素基因、淀粉酶抑制剂基因和动物源抗虫基因及抗虫原理,分析了抗虫基因植物面临的问题,提出了延缓害虫对转基因植物抗性的解决建议。     

转双Bt基因巨霸杨外源基因表达及抗虫性检测

为提高转基因杨树中Bt基因的表达效率并扩大抗虫谱,以同时转入Cry1Ac和Cry3A基因的转双Bt基因巨霸杨(Populus deltocdes‘55/56’×P.deltocdes‘2KEN8’)株系1年生苗为材料,对外源基因的表达和抗虫性进行检测。经PCR检测,证明目的基因已被整合到巨霸杨基因组中。利用荧光定量PCR和ELISA技术检测了4个转基因株系叶片中Bt基因的转录丰度和毒蛋白表达量。结果表明:不同株系间Bt基因的转录丰度存在显著差异,Cry3A基因的转录丰度显著高于Cry1Ac基因的转录丰度;2种Bt毒蛋白表达量在各株系间存在显著差异,Cry3A毒蛋白质量分数均显著高于Cry1Ac毒蛋白质量分数。各株系对鳞翅目害虫美国白蛾(Hyphantria cunea)幼虫抗虫效果不明显,且无显著差异;对鞘翅目害虫柳蓝叶甲(Plagiodera versicolora)表现出极高抗虫效果,且均显著高于转单基因Cry3A 741杨高抗株系CC84,不同株系间存在显著差异。