水牛α-清蛋白基因3′端调控区的PCR克隆及序列分析

对水牛α-乳清蛋白基因的3′端调控区进行了PCR扩增及重组质粒的酶切鉴定,比较了水牛和牦牛该基因的核苷酸序列同源性.序列分析结果表明:水牛α-乳清蛋白基因3′端序列与牦牛该基因在641 bp的序列中存在34 bp的差异,同源性为94.69%.     

水牛α-清蛋白基因3’端调控区的PCR克隆及序列分析

对水牛α-乳清蛋白基因的3’端调控区进行了PCR扩增及重组质粒的酶切鉴定,比较了水牛和牦牛该基因的核苷酸序列同源性。序列分析结果表明：水牛α-乳清蛋白基因3’端序列与牦牛该基因在641bp的序列中存在34bp的差异,同源性为94．69％。     

槟榔江水牛LALBA基因克隆及序列特征分析

【目的】α-乳清蛋白由LALBA基因编码,在乳糖合成中起着重要作用。近年在普通奶牛中发现该基因与泌乳性状关系密切,但在水牛中研究较少。为了揭示水牛LALBA基因的序列特征。【方法】本研究采用RT-PCR测序法对槟榔江水牛LALBA基因的编码区序列进行了克隆和生物信息学分析。【结果】槟榔江水牛LALBA基因的编码区全长429 bp,编码蛋白含142个氨基酸。其α-LA含有1个C型溶菌酶/乳蛋白家族结构域(AA20~138)和1个信号肽序列(AA19~20),无跨膜结构,是胞外分泌的亲水蛋白;其N末端疏水,C末端亲水;有4类功能活性位点。基于LALBA基因编码区序列的系统发育分析表明,槟榔江水牛与牛亚科物种聚在一起,揭示它们LALBA基因功能的相似性。在LALBA基因编码区共检测到5个SNP位点:c.63AG、c.107AG、c.147AG、c.249CT、c.291TC。这些变异位点全部处于Hardy-Weinberg不平衡状态,只有SNP107为异义替换,导致编码氨基酸由天冬氨酸变为甘氨酸。功能分析显示SNP107对槟榔江水牛α-LA功能没有影响。【结论】水牛LALBA基因的序列与其他牛科物种长度相同,其编码产物的结构、功能与其他牛科物种相似。本研究可为进一步研究LALBA基因在水牛泌乳过程中的作用机制奠定基础。     

牦牛乳球蛋白基因5'调控区的分离、克隆及序列分析

根据文献设计1对PCR引物,寡聚核苷酸序列上游引物为5′-gCg,AAT,TCA,TCC,CAC,gTg,CCT,gC-3′,下游引物5′gAg,AAT,TCC,Tgg,ggA,ggg,ACC,TT-3′.经68℃退火及30轮循环的PCR程序后扩增出长度为1447 bp的DNA片段,将该片段从琼脂糖凝胶中回收,克隆到pMD18-T Vector后进行序列测定.序列分析结果表明,牦牛乳球蛋白基因5′调控区与文献报道的奶牛该基因同源性为97.65%,突出的碱基差异为牦牛乳球蛋白基因5′调控区发生了1个位点连续3个碱基的缺失突变和另一位点1个碱基的插入突变.该研究也为开展以牦牛乳球蛋白基因5′调控区为启动子的乳腺生物反应器研究准备了条件.     

马麝朊蛋白(PrP)基因的克隆和序列分析

从马麝的全血中提取基因组总DNA,用所设计引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白(PrPC)基因,并克隆到pMD18-T载体。序列分析表明所克隆的马麝PrP基因片段大约为771bp,包含了朊蛋白基因的完整编码区序列,即包含在单一外显子内的完整开放阅读框,与国外报道的同科动物PrP基因序列基本相同。马麝PrP基因含5个短而富含G-C的元件,可编码5个八肽(九肽)重复Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln或Pro-Gln/His-Gly-Ala/Gly-Gly–Gly-Trp-Gly-Gln,其氨基酸序列含有24个氨基酸的N-端信号肽和23个氨基酸的C-端信号肽。与白尾鹿(Odocoileusvirginianus)和麋鹿(Cervuselaphus)的PrP基因相比,其核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性分别为97.4%、97.9%和98.1%、97.7%。共发生15个碱基替换,其中10个为同义码替换,5个为异义突变,即G57A、S100N、N173S、T177N和M208I。     

牦牛乳球蛋白基因5′调控区的分离、克隆及序列分析

根据文献设计1对PCR引物,寡聚核苷酸序列上游引物为:5-′gCg,AAT,TCA,TCC,CAC,gTg,CCT,gC-3′,下游引物:5-′gAg,AAT,TCC,Tgg,ggA,ggg,ACC,TT-3′。经68℃退火及30轮循环的PCR程序后扩增出长度为1 447 bp的DNA片段,将该片段从琼脂糖凝胶中回收,克隆到pMD18-T Vector后进行序列测定。序列分析结果表明,牦牛乳球蛋白基因5′调控区与文献报道的奶牛该基因同源性为97.65%,突出的碱基差异为牦牛乳球蛋白基因5′调控区发生了1个位点连续3个碱基的缺失突变和另一位点1个碱基的插入突变。该研究也为开展以牦牛乳球蛋白基因5′调控区为启动子的乳腺生物反应器研究准备了条件。     

山羊抑制素α前体基因5'侧翼区及外显子的克隆与序列分析

[目的]弄清INHα前体基因与山羊繁殖季节性的关系,并研究INHα前体基因进化的保守性。[方法]对常年发情的山羊品种海门山羊和季节性发情的山羊品种安徽白山羊共20只母羊的抑制素0【前体基因（INHα）5’侧翼区和外显子进行了克隆和序列比较分析。[结果]与安徽白山羊相比,海门山羊INHα前体基因存在3个SNP,不存在氨基酸改变,核苷酸同源性为99．7％,氨基酸同源性为100％。在山羊、牛、猪、人、鸡、马、大鼠、狗之间INHα前体基因的核苷酸序列同源性为12．7％-96．5％。[结论]INHα前体基因在物种内趋于高度保守,任何核苷酸和氨基酸的改变都可能直接影响整个基因编码和基因调控能力的改变。     

水牛朊蛋白成熟片段基因的克隆与原核表达

【目的】克隆、分析水牛朊蛋白（prion protein，PrP）成熟片段基因，并获取纯化的表达产物。【方法】将应用PCR技术扩增的水牛成熟PrP的核酸序列克隆到表达载体pET-32a，并分析其序列；把阳性克隆质粒pET-32a-BPrP转化表达菌BL21(DE3)，鉴定纯化的表达产物。【结果】水牛朊蛋白成熟片段核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其他牛科动物的成熟PrP核酸、氨基酸序列间的相似性分别在97.1%和97.2%以上，并且发现水牛成熟PrP有5个重复序列，编码的氨基酸序列其中有2个九肽和3个八肽重复序列。具有较高的表达水平的PrP融合蛋白被纯化后，用Western印迹实验证明该蛋白具有PrP抗原活性。【结论】首次报道了克隆、分析水牛朊蛋白成熟片段基因，发现水牛成熟PrP有5个重复序列，并获得了具PrP抗原活性的水牛成熟PrP融合蛋白。     

Mutation Surveyor在插入/缺失杂合子突变分析中的应用

结合实例简述了Mutation Surveyor软件在碱基替换和插入/缺失突变,尤其是插入/缺失杂合子突变研究中的应用。以浙江省余杭湖羊场和屠宰场144头湖羊为试验材料,采用PCR\|SSCP和测序的方法检测干扰素刺激基因（ISG15）基因5′侧翼区序列,并利用Mutation Surveyor软件分析其遗传多态性。PCR\|SSCP检测结果显示ISG15基因5′侧翼区PCR\|SSCP带型非常复杂,无法直接判定个体的基因型。利用Mutation Surveyor软件分析发现湖羊ISG15基因5′侧翼区存在152 C/T,158 dupC和239 C/T 3种突变。其中152 C/T C等位基因频率为083,为低度多态的分子标记;158 dupC等位基因频率为05125, 239 C/T C等位基因频率为0.7675,均为中度多态的分子标记。除239 C/T外,152 C/T和158 dupC均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。试验结果显示Mutation Surveyor软件在分析插入/缺失杂合子突变的测序结果时有较大优势,可用于碱基替换和插入/缺失SNPs的通量筛选和分析。     

中国荷斯坦奶牛BLF基因5′侧翼区PCR-SSCP多态性及其与乳房炎的相关性分析

采用PCR-SSCP技术,对中国荷斯坦奶牛乳铁蛋白基因(Bovine lactoferrin,BLF)5′侧翼区的多态性进行了分析,并用最小二乘法拟合线性模型分析各种基因型与奶牛乳房炎的相关性。结果发现,中国荷斯坦奶牛BLF基因5′侧翼区存在AA、BB和AB 3种基因型,其基因型频率分别为0.8805,0.0299和0.0896;AA基因型在-148位缺失G;与AA基因型相比,BB基因型在-149位发生C→T变异,-135位发生G→A变异;BLF基因5′侧翼区的χ2值为7.992 4(P<0.01),说明BLF基因5′侧翼区的突变处于Hardy-Weinberg非平衡状态,样本群体中AA基因型的SCSLAW最大,BB基因型的SCSLAW最小,两者差异极显著(P<0.01)。表明BLF基因5′侧翼区BB基因型可能与乳房炎的抗性有关,AA基因型可能与乳房炎的易感性有关。     

水牛ABCG2基因第9外显子群体遗传特征分析

 三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2 (ABCG2)对普通奶牛泌乳性状有直接影响。水牛中该基因的遗传特征与产奶性状间是否有遗传关联目前还不十分清楚。本文采用PCR SSCP和PCR产物直接测序相结合的技术,对4个河流型水牛群体和9个沼泽型水牛群体共计466个个体的ABCG2基因第9外显子进行了变异检测。结果表明,水牛ABCG2基因第9外显子由251个核苷酸组成,所有的河流型和沼泽型水牛序列相同,未发现SNP位点,但在第9内含子内检测到1个T>C替换(g. SNP44769 T>C)。与GenBank数据库中已发表的牛科物种同源序列比对后发现,数据库中一条河流型水牛序列该外显子第66位核苷酸处有1个G>A替换(c. SNP1018 G>A),导致所编码的氨基酸发生p. V340I的改变;与普通牛、山羊和绵羊该基因第9外显子序列的核苷酸差异位点个数分别为5,8和11个,表明水牛与其他牛科物种间具有较大的遗传差异。本文结果提示ABCG2基因第9外显子在水牛中已纯化固定,且与水牛产奶量性状间无直接关联性。     

柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)BJ株SO7基因的克隆和序列分析

对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)BJ 株 SO7基因进行了克隆和测序分析。以纯化的 E.tenella BJ 株7h 孢子化卵囊的总 RNA 为模板,应用 RNA 反转录酶(M-MLV)合成 cDNA,再用 Taq DNA 聚合酶进行PCR 扩增出 BJ 株 SO7基因.用常规基因克隆方法把 BJ 株 SO7基因插入 pGEM-T 克隆载体,选取正方向插入子的一个阳性克隆进行酶切分析及插入片段的全序列测序分析。结果表明:该序列全长862个核苷酸,有一个开放性读框(65～713nt),可编码216个氨基酸(22.4kD)。SO7-BJ 与国外株 SO7比较,同源性为99%,突变的8个核苷酸中,4个为有义突变.开放性读框中有仅2个核苷酸突变,其中1个为有义突变,使推测氨基酸 Cly 变为 Cys。     

柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）BJ株SO7基因的克隆和序列分析

对柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）BJ株SO7基因进行了克隆和测序分析。以纯化的E.tenella BJ 株7h孢子化卵囊的总RNA为模板,应用RNA反转录酶（M-MLV）合成Cdna,再用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增出BJ株SO7基因。用常规基因克隆方法把BJ株SO7基因插入Pgem-T克隆载体,选取正方向插入子的一个阳性克隆进行酶切分析及插入片段的全序列测序分析。结果表明：该序列全长862个核苷酸,有一个开放性读框（65～713nt）,可编码216个氨基酸（22.4ku）。SO7-BJ与国外株SO7比较,同源性为99%,突变的8个核苷酸中,4个为有义突变。开放性读框中仅有2个核苷酸突变,其中1个为有义突变,使推测氨基酸Cly变为Cys。     

山羊α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的构建 及核供体细胞的转染

为了构建α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体及提供山羊乳腺生物反应器α-乳清蛋白核移植供体细胞,提取乳腺组织中的总RNA,采用RT-PCR技术获得α-乳清蛋白基因cDNA,测序酶切后连接乳腺特异性表达载体pBCⅠ-Neo,并对重组载体进行酶切测序鉴定;取重组正确的载体酶切线性化后利用脂质体介导转染至山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选培养转染了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞。结果显示:经过RT-PCR特异性扩增克隆出α-乳清蛋白基因;克隆的基因碱基组成序列经测序与预期完全一致,α-乳清蛋白基因片段正向插入乳腺特异性表达载体;重组载体在山羊胎儿成纤维细胞中稳定转染,转入α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞生长迅速,仍保持原有的细胞生长形态。成功构建了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体,获得稳定转染的山羊胎儿成纤维细胞可用于核移植。     

藏獒犬α-干扰素全基因的克隆与序列分析

根据GenBank发表的犬α-干扰素(IFN-α)基因核酸序列(AB102731),设计并合成1对引物,利用PCR技术从藏獒犬肝脏基因组DNA中扩增犬α-干扰素全基因,并进行克隆和测序.结果表明,获得了犬IFN-α全基因序列,其大小为564 bp,包含1个完整阅读框,编码187个氨基酸残基.序列比较分析发现,克隆的藏獒犬IFN-α基因序列与GenBank中5条犬IFN-α基因序列核苷酸同源性在96.8%～99.3%之间,氨基酸同源性在94.7%～98.9%之间,并无插入和缺失变异,但是存在氨基酸点变异.藏獒犬与人和其他8种动物的IFN-α基因序列分析和系统进化分析表明,IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高.犬IFN-α基因的成功克隆为进一步研究藏獒犬IFN-α基因表达、生物学活性和应用奠定基础.     

SD-大白鼠催乳素受体基因的克隆与表达

应用RACE—PCR技术,克隆了全长2743bp的SD-大白鼠催乳素受体基因（gPRLR）cDNA。序列分析表明,cDNA含421bp 5′UTR、1357bp编码区和218bp3′U,UTR。比对奶牛催乳素受体基因并将前217bp看作第1外显子,则gem基因可划分为13个外显子。推导的蛋白序列含763个氨基酸,与奶牛、鸽及猪PRLR的同源性较高,其N末端含23个氨基酸的信号肽,成熟蛋白含789个氨基酸。gPRLRmRNA在成年鼠睾丸、输精管、卵巢、输卵管、肾、大肠、小肠、脾组织中均有表达。     

油茶14-3-3蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

以构建的油茶近成熟种子cDNA文库和EST文库为基础,采用分子克隆技术,分离克隆1个14-3-3蛋白的全长cDNA序列,由1 156个核苷酸组成,5'非编码区57 bp,3'非编码区301 bp,开放阅读框长777 bp,编码259个氨基酸.该基因编码蛋白的分子质量为29.466 ku,等电点4.78,无信号肽序列,是非分泌蛋白,命名为Co-14-3-3a.推测的二级结构有9个α-螺旋,1个反平行的β-折叠,位于αC和αD之间.     

三个猪品种Myf5基因的克隆及序列分析

为明确猪Myf5基因的蛋白结构及功能位点,从香猪、大白猪和大白×长白杂交猪背最长肌提取总RNA,采用RT-PCR技术克隆Myf5基因,其cDNA长893 bp,包括完整的开放阅读框768 bp,编码255个氨基酸。将所测序列与GenBank上已知猪种序列进行相似性比较,结果表明:香猪Myf5基因中有3个碱基变异,其中2个突变不改变编码的氨基酸为无义突变,1个突变使其编码的氨基酸由甲硫氨酸(M)变为亮氨酸(L)。大白猪没有碱基变化;大白×长白杂交猪Myf5基因中的1个突变,使其编码氨基酸由甘氨酸(E)变为谷氨酸(G)。将香猪与其他物种进行核苷酸和氨基酸编码区序列的相似性分析及生物信息学分析。相似性分析表明,香猪Myf5基因氨基酸编码区序列与绵羊、牛、马、兔、黑猩猩、非洲象和小鼠的相似性较高,均在88%以上,推测Myf5基因在哺乳动物具有一定的保守性;Myf5蛋白二级结构以无规则卷曲为主,其次为α螺旋,偶有β转角。预测Myf5蛋白不含信号肽序列,有29个磷酸化位点。     

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为了解贵州猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的变异情况,对分离PEDV的M基因进行了克隆测序和生物信息学分析.结果表明:分离的PEDV株(用N-GZ表示)与贵州省动物疫病研究室曾报道的PEDV株(用GZ表示)位于同一进化分支,与疫苗株CV777处于不同进化分支.N-GZ株与GZ株M基因的核苷酸序列相似性为98.5％,表明其亲缘关系较近,与CV777疫苗株的亲缘关系稍远.多重比较发现,N-GZ株与CV777株M蛋白的抗原表位区存在3个氨基酸的差异,与GZ株相比存在2个氨基酸的突变.M基因是PEDV的保守基因,但N-GZ株M基因在抗原表位区存在一定程度突变.     

牦牛α1-珠蛋白基因的克隆和序列分析

根据α-珠蛋白基因起始密码子上游及终止密码子下游的保守序列设计引物，以牦牛基因组DNA为模板克隆并测定了α-珠蛋白基因序列。结果表明，所测的氨基酸序列与牦牛α-珠蛋白链的氨基酸序列完全相同，即为牦牛α1-珠蛋白基因，长706bp，编码141个氨基酸。通过与其他物种的同源性比较，发现牦牛α1-珠蛋白基因的核苷酸序列与黄牛和水牛的同源性分别为99．71％和98．58％，与山羊、绵羊、人和马的同源性只有96．0：3％、95．57％、68．55％和51．13％；氨基酸序列与黄牛和水牛的同源性分别为99．29％和96．45％，与山羊、绵羊、人和马的同源性只有92．90％、91．49％、87．23％和87．23％，说明牛亚科α-珠蛋白基因在进化上高度保守。同时发现第254位的碱基A为牦牛α1-珠蛋白基因所特有。牦牛的两个α1-珠蛋白基因长度相等，都为706bp，且间距为2．47kb，距离比山羊的远。