牛科物种FSHβ基因外显子1和外显子2遗传特征分析

 促卵泡素（follicle stimulating hormone, FSH）对刺激动物卵泡发育和促进精子生成具有重要作用,但有关牛科物种FSH基因的群体遗传特征还不十分清楚。本文针对FSHβ基因外显子1和外显子2,采用PCR SSCP结合PCR产物直接测序技术对353头水牛(来自11个水牛群体)、30头牦牛和30头大额牛样品进行了群体变异检测,并结合NCBI数据库中已发表的普通牛、山羊和绵羊等物种同源序列进行了群体遗传和生物信息学分析。在FSHβ基因外显子1中,水牛中发现1个核苷酸替换和1个缺失,即c-49A>G和c-31delG;其中,SNP49在河流型和沼泽型水牛中均存在,等位基因c-49A为优势等位基因,而c-31delG只存在于沼泽型水牛中,且为杂合状态,基因频率为0.077。在牦牛外显子1中检测到c-37G>A和c-12T>C替换,且为连锁遗传的,而在大额牛外显子1中未检测到SNP位点。在FSHβ基因外显子2中,水牛中发现c132G>A替换,该位点在河流型和沼泽型水牛均存在,但等位基因频率在两类水牛间不一致。在牦牛外显子2中检测到c9C>T和c21C>T替换,该替换也存在于普通牛中;大额牛外显子2为单态,未见SNP位点。生物信息学分析显示,在一些牛科物种FSHβ基因外显子2中发现的SNP位点均为同义替换,揭示了其序列的高度保守性。在牛科物种中,山羊和绵羊FSHβ基因第36位密码子编码氨基酸与其他物种不同,可作为区分它们的遗传标记。     

水牛-β-LG基因3，4外显子遗传特征分析

 本文通过PCR产物直接测序法得到水牛β-LG基因第3,4外显子及其旁侧序列后,采用PCR-RFLP和PCR-SSCP方法对属于10个群体的224头水牛该基因第4外显子进行了多态性检测,又从中随机抽取属于9个群体的69头水牛采用PCR-SSCP结合测序的方法检测了其第3外显子的遗传多态性。结果显示：河流型水牛和沼泽型水牛β-LG基因的第3外显子均为74 bp;它们的第4外显子均为111 bp;在所研究群体中,两类水牛第3,4外显子序列完全相同,并未发现具有多态现象。与牛科物种同源序列比较显示：水牛β-LG基因3,4外显子在进化上比较保守,相应于普通牛的B等位基因。由于产奶量有明显差异的河流型水牛与沼泽型水牛的β-LG基因第3,4外显子序列间无差异,提示它们对水牛产奶量无直接影响。     

水牛催乳素基因第3外显子群体遗传特征分析

 催乳素基因（PRL）第3外显子(exon 3)对奶牛产奶量、乳脂产量和乳蛋白产量有显著影响,但在水牛中该基因的遗传特征及其与产奶性状是否有遗传关联目前还不清楚。本研究采用PCR SSCP并结合PCR产物直接测序技术,分析了沼泽型水牛和河流型水牛共12个群体275个个体PRL exon 3的遗传变异,结果表明：水牛PRL exon 3由108个核苷酸组成,编码36个氨基酸,在水牛群体中未检测到单核苷酸多态性位点（SNPs）,PRL exon 3与水牛产奶量之间没有直接相关性。通过序列比对发现在不同物种中PRLexon 3具有高度保守性。但在PRL第2内含子（intron 2）的2265nt和2335nt分别检测到G>A突变和C>T突变,其中2335nt位点突变仅在2头槟榔江水牛中检测到。     

水牛DGAT1基因第8外显子群体遗传特征分析

为了阐明河流型和沼泽型水牛DGAT1基因的第8外显子的群体遗传差异和特征,采用PCR-SSCP和PCR产物直接测序技术对11个水牛群体402份样品进行了群体变异检测,并结合GenBank数据库上已发表的牛科物种DGAT1基因序列进行了比较分析。结果显示,河流型和沼泽型水牛DGAT1基因第8外显子序列一致,序列全长为75 bp;与普通奶牛序列相比,河流型和沼泽型水牛DGAT1基因第8外显子都为K等位基因,揭示其与水牛的高乳脂率、低泌乳量有关。序列比对发现K等位基因在牛科物种中普遍存在。本研究结果揭示了水牛中DGAT1基因第8外显子的遗传特征,可为其奶用性状选育利用提供遗传背景资料。     

沼泽型与河流型水牛Y染色体性别决定基因（SRY）编码区序列的比较分析*

 采用PCR产物直接测序技术对56头沼泽型水牛和26头河流型水牛Y染色体性别决定基因（SRY）的完整编码区及部分侧翼区序列进行了测定和比较分析,结果显示所有沼泽型水牛的SRY基因编码序列一致,所有河流型水牛的SRY基因编码序列也一致;但沼泽型水牛和河流型水牛之间SRY基因编码区序列相比在c.202位点存在一个G＞C替换,这个碱基差异属于错义突变,导致了pG68R,即编码的第68位氨基酸在沼泽型水牛为甘氨酸G,而在河流型水牛为精氨酸R;经群体检测确定SRY基因c.202G＞C变异为沼泽型水牛和河流型水牛之间普遍存在的现象,而其他牛科物种在此位置不存在差异。本研究使用的PCR引物可以作为水牛性别鉴定的特异性引物,而发现的差异位点也可以作为区分沼泽型与河流型水牛和水牛群体雄性介导基因流检测的分子标记。     

河流型与沼泽型水牛STAT5A基因序列多态性分析

信号转导与转录激活因子家族(STATs)是一组介导靶细胞内多种肽类激素和细胞因子活性的转录因子。因此,STAT5A基因近年被确定为一个与普通奶牛泌乳性状相关的候选基因,但目前在水牛中该基因的研究报道还比较少。本研究采用PCR产物直接测序技术对60头河流型水牛和300头沼泽型水牛样品的STAT5A基因外显子7,8,9,13和16序列及内含子8序列、内含子16部分序列进行了群体变异检测,并对检测结果进行了群体遗传和比较基因组学分析。在水牛STAT5A基因中共检测到12个SNP位点,其中在外显子中检测到4个SNP位点,内含子中检测到8个SNP位点。在外显子8和外显子13中各检测到2个SNP位点,在外显子8中为c.924CT和c.975CT替换,在外显子13中为c.1485AG和c.1551CT替换。它们均为同义替换,只存在于河流型水牛中。在内含子8中检测到7个SNP位点,在内含子16中检测到1个SNP位点。在内含子中检测到的SNP位点全部存在于河流型水牛中,在沼泽型水牛中只存在其中的2个SNP位点(c.989+144GT,c.989+177AG)。本文结果揭示河流型与沼泽型水牛STAT5A基因SNP位点群体遗传组成不同,在河流型水牛中检测到的SNP位点大多在沼泽型水牛中已纯合。比较基因组学分析显示,水牛与普通牛、牦牛和绵羊的STAT5A基因序列差异较大,水牛具有不同的SNP位点分布模式,但水牛与普通牛和牦牛在氨基酸序列水平上差异较小。     

水牛DGAT1基因第17外显子多态性及其与乳成分含量的关联性分析

 二酰甘油酰基转移酶1（DGAT1）在乳脂合成过程中发挥重要作用,但水牛DGAT1基因第17外显子遗传多态性及其与产奶性状的关联性还不清楚。本文采用PCR-SSCP结合DNA测序方法对48头德宏水牛和93头产奶杂交水牛（F1: 摩拉水牛×德宏水牛）的第17外显子进行了多态性检测并结合乳成分数据进行了关联分析。在水牛DGAT1基因第17外显子发现1个SNP位点,即c.1350C＞G,其为同义替换。该SNP位点在德宏乳用和非乳用水牛中群体遗传组成相近,且不同基因型个体间的乳糖率、乳脂率及乳蛋白率无显著差异（P>0.05）。表明该SNP对水牛乳糖率、乳脂率及乳蛋白率等无显著影响。序列比对显示,水牛、普通牛、瘤牛、山羊和绵羊DGAT1基因第17外显子间仅存在1个编码氨基酸差异,揭示其具有较高的保守性。     

牛生长激素基因（bGH）编码区的遗传变异特征*

 以普通牛、瘤牛、牦牛、大额牛、沼泽型水牛和河流型水牛的代表牛种为对象,探讨不同牛种（或亚种）GH基因编码区序列的遗传变异特征。结果表明,6个群体的GH基因编码区序列全长均为654bp,共检测到16个SNP位点,外显子1无变异位点,外显子2、外显子3、外显子4和外显子5分别有3个、5个、1个和7个变异位点,表明外显子5是编码区的高变区域,而且SNP位点在不同牛种（或亚种）中的分布存在明显差异。16个核苷酸替代位点中有13个为同义突变,仅有3个非同义突变位点,分别位于第2外显子、第4外显子和第5外显子处,并造成其所编码的氨基酸发生改变。     

牛生长激素基因（bGH）编码区的遗传变异特征

以普通牛、瘤牛、牦牛、大额牛、沼泽型水牛和河流型水牛的代表牛种为对象,探讨不同牛种(或亚种)GH基因编码区序列的遗传变异特征.结果表明,6个群体的GH基因编码区序列全长均为654bp,共检测到16个SNP位点,外显子1无变异位点,外显子2、外显子3、外显子4和外显子5分别有3个、5个、1个和7个变异位点,表明外显子5是编码区的高变区域,而且SNP位点在不同牛种(或亚种)中的分布存在明显差异.16个核苷酸替代位点中有13个为同义突变,仅有3个非同义突变位点,分别位于第2外显子、第4外显子和第5外显子处,并造成其所编码的氨基酸发生改变.     

利用 ｍｔＤＮＡＤ-ｌｏｏｐ序列为遗传标记分析槟榔江水牛的群体遗传特征

槟榔江水牛是近年在云南西部发现的中国第一个本土河流型水牛群体,具有较高种用价值,但其重要遗传背景信息还不清楚。本文采用 ＰＣＲ产物直接测序法对 ８６头槟榔江水牛 ｍｔＤＮＡＤ-Ｌｏｏｐ序列进行了突变检测,并以 ＧｅｎＢａｎｋ上已发表的 ７０条河流型和 １１２条沼泽型水牛 ｍｔＤＮＡＤ Ｌｏｏｐ序列为对照,对所得数据进行群体遗传和系统发育分析。结果在槟榔江水牛中检测到 ３３种单倍型,１１２个多态位点。其中单一变异位点 １４个,简约信息位点 ９８个。槟榔江水牛 ｍｔＤＮＡＤ Ｌｏｏｐ序列 Ｔ,Ｃ,Ａ,Ｇ的平均含量分别为 ２８.４３％,２４.８２％,３１.９６％,１４.７９％,单倍型多样度为 （０.９４８±０.０１２）,核苷酸多样度为 （０.０３８１±０.００１６）,序列间平均核苷酸差异数为３３.２８８,群体内平均遗传距离为 （０.０４３±０.００５）。系统发育、中介网络图和群体遗传关系分析表明,槟榔江水牛含有两个差异显著的母系世系组分,其中一个为河流型世系,在群体中占 ６１.６３％;另一个为沼泽型世系,在群体中占３８３７％,而其沼泽型世系可进一步分为 Ａ,Ｂ,Ｃ３个支系,其中,Ｃ为在水牛中新发现的支系,其频率极低。结果揭示了槟榔江水牛群体遗传多样性丰富,但该群体存在一定的沼泽型水牛基因渗入。     

槟榔江水牛Dmrt7基因克隆及分子特征、组织表达谱分析

【目的】Dmrt7基因是Dmrt基因家族成员之一,影响公畜精子形成。迄今,有关水牛精子发生的遗传基础的研究很少,本研究旨在对槟榔江水牛Dmrt7基因完整CDS区进行克隆和组织差异表达分析。【方法】采用RT-PCR和功能生物信息学方法。【结果】槟榔江水牛Dmrt7基因完整编码区序列长1 113 bp,编码370个氨基酸;Dmrt7包含DM和DMRT-like两个保守结构域,无信号肽,无跨膜结构,为核内蛋白。同源性分析显示,水牛与其他牛科物种Dmrt7氨基酸序列相似度达95%以上。在检测的10个组织中,Dmrt7基因仅在水牛睾丸组织中表达且高表达。在第6外显子发现1个SNP位点(c.665AG),引起了p.Q222R的替换,此位点的替换对Dmrt7蛋白功能无影响。【结论】有助于了解水牛Dmrt7基因的基本功能。     

槟榔江水牛LALBA基因克隆及序列特征分析

【目的】α-乳清蛋白由LALBA基因编码,在乳糖合成中起着重要作用。近年在普通奶牛中发现该基因与泌乳性状关系密切,但在水牛中研究较少。为了揭示水牛LALBA基因的序列特征。【方法】本研究采用RT-PCR测序法对槟榔江水牛LALBA基因的编码区序列进行了克隆和生物信息学分析。【结果】槟榔江水牛LALBA基因的编码区全长429 bp,编码蛋白含142个氨基酸。其α-LA含有1个C型溶菌酶/乳蛋白家族结构域(AA20~138)和1个信号肽序列(AA19~20),无跨膜结构,是胞外分泌的亲水蛋白;其N末端疏水,C末端亲水;有4类功能活性位点。基于LALBA基因编码区序列的系统发育分析表明,槟榔江水牛与牛亚科物种聚在一起,揭示它们LALBA基因功能的相似性。在LALBA基因编码区共检测到5个SNP位点:c.63AG、c.107AG、c.147AG、c.249CT、c.291TC。这些变异位点全部处于Hardy-Weinberg不平衡状态,只有SNP107为异义替换,导致编码氨基酸由天冬氨酸变为甘氨酸。功能分析显示SNP107对槟榔江水牛α-LA功能没有影响。【结论】水牛LALBA基因的序列与其他牛科物种长度相同,其编码产物的结构、功能与其他牛科物种相似。本研究可为进一步研究LALBA基因在水牛泌乳过程中的作用机制奠定基础。     

基于线粒体控制区变异的水牛群体遗传分析

为探讨沼泽型水牛与河流型水牛之间的线粒体D-loop区差异与进化关系,对26头广西本地水牛、8头贵州贵阳水牛、11头广西水牛与河流型水牛杂交后代、9头尼里拉菲和12头摩拉水牛(共5个群体66头水牛个体)的线粒体全长D-loop序列进行了扩增测序分析.结果发现66头水牛912 bp的D-loop多重序列比较有147个多态位点,形成58个单体型,沼泽型水牛与河流型水牛单体型明显分成2簇.以牛为外群构建的单体型进化树显示,沼泽型与河流型水牛分成明显2大支,河流型水牛聚成1支,而沼泽型水牛内部又分成2个侧支.通过Median joining net-work分析亦发现3个不同的簇,与进化树分析结果一致.对该区碱基错配分布分析表明,水牛群体在历史上发生2次独立的群体扩增事件.为进一步验证试验结果,从GenBank下载了211条水牛D-loop序列与笔者研究获得的序列整合分析,在共有序列878 bp区域中,包含了158个多态位点和129个单体型,以牛为外群的进化树分析与单体型网络分析表明,沼泽型水牛分成2簇,所有的河流型水牛聚集成紧密的1簇.碱基错配分布分析结果呈现2个明显的峰,进一步推断水牛群体在历史上发生过2次较大的群体扩增事件.综合上述研究结果推断,沼泽型水牛与河流型水牛来自不同的家养化事件,沼泽型水牛起源于中国,其祖先可能存在2个基因池.     

河流型与沼泽型水牛CSN3基因密码子使用特征分析

本研究以54头河流型水牛和70头沼泽型水牛为研究对象,并以从NCBI数据库中下载的普通牛、野牦牛、野牛、绵羊、小鼠和人的序列作对照,对乳成分中重要的κ-酪蛋白(kappa casein)编码基因CSN3的密码子使用偏好性及水牛与其他物种间CSN3基因密码子使用的差异和进化关系进行了深入分析。结果表明:两种类型水牛CSN3基因密码子使用特征相似,河流型水牛CSN3基因共有26个偏好使用的密码子,而沼泽型水牛共有27个;其中,两类水牛偏好性较强的密码子均为GUU、UCA、AGU、CCA、AGG、GGU和GGA(RSCU≥2),河流型水牛对Asp的两种密码子GAU、GAC没有使用偏好性,而沼泽型水牛偏好使用GAC;河流型水牛编码Asp和Cys的同义密码子RSCU值为1,而沼泽型水牛只有编码Cys的同义密码子RSCU值为1。研究发现,所有物种CSN3基因均偏好使用以A/U结尾的密码子,但不同物种之间偏好使用密码子种类和数目均有差异。在密码子使用频率上,水牛CSN3基因与其他牛科物种的差异小于与小鼠、人的差异。密码子使用偏好聚类分析表明,河流型与沼泽型水牛亲缘关系最近,聚为一类,然后依次与其他牛、绵羊、小鼠和人等物种相聚。     

安徽东流水牛线粒体D-Loop区遗传多样性与系统进化分析

【目的】分析安徽东流水牛群体的分子遗传特性,为今后开展我国地方水牛品种研究提供科学依据。【方法】采用测序技术测定安徽东至县31头东流水牛线粒体DNA(mtDNA)D-Loop序列,结合GenBank数据库中已报道的22个群体的471条中国水牛D-Loop序列进行联合分析,利用DnaSP 5.1软件统计核苷酸多样性和单倍型多样性,利用MEGA 5.10软件构建N-J系统发生树,利用Network 4.60软件构建单倍型的media-joining网络。【结果】在22个中国水牛群体中发现163个变异位点,180个单倍型,其核苷酸多样性为0.018 23±0.002 21,单倍型多样性为0.877 40±0.013 80,其中在东流水牛D-Loop序列中发现70个变异位点,构成35种单倍型,其核苷酸多样性为0.013 31±0.002 08,单倍型多样性为0.944 00±0.023 00,群体变异性水平与中国其他水牛群体接近。N-J系统发生树和media-joining进化网络显示,中国水牛分为沼泽型和江河型,前者又分为A和B支系,B支系包括b1和b22个亚支系,东流水牛分布于A和B支系中。【结论】东流水牛群体遗传多样性丰富,且线粒体具有2个母系来源。     

涪陵水牛mtDNA D-loop区遗传多样性研究

利用测序技术和生物信息学分析技术,对涪陵水牛27个个体的线粒体DNA D-loop 915 bp全序列的遗传多样性及系统进化进行分析,检测到16种单倍型,其核苷酸多态位点48个,约占所测核苷酸总长的5.24%,其中有43个转换,5个颠换。涪陵水牛mtDNA D-loop区核苷酸多样度(π值)为0.0196±0.0020,单倍型多样度(H)为0.9060±0.0460,表明涪陵水牛mtDNA遗传多样性丰富。根据单倍型构建了涪陵水牛的NJ分子系统树,发现存在沼泽型水牛支系A和B,表明涪陵水牛具有2个母系起源。     

中国3个牛种cytb基因多态性及其系统发育研究

基于mtDNA cyt b基因全长序列,对中国黄牛、牦牛和水牛的遗传多态性和系统发育关系进行了分析。结果表明,中国黄牛、牦牛和水牛cyt b基因序列中碱基A和T的含量均比较高,A T的平均含量分别为56.6%,58.2%和56.0%。黄牛在cyt b基因全长序列具有较丰富的核苷酸多样性(Pi=0.016 84),水牛的核苷酸多样性相对贫乏(Pi=0.003 51),牦牛的核苷酸多样性介于二者之间(Pi=0.012 28)。中国黄牛与牦牛和欧洲野牛之间的亲缘关系相对较近,而与水牛间的亲缘关系则相对较远,黄牛有普通牛和瘤牛2个母系起源;中国牦牛和斑腾牛以及羯牛的亲缘关系相对较近;中国水牛和沼泽型水牛具有较近的亲缘关系,也可能有2个或者2个以上的母系起源。     

滇东南水牛mtDNA控制区遗传多样性及其系统地位分析

【目的】深入了解滇东南水牛(Bubalus bubalis)的遗传多样性及其在水牛中的系统地位。【方法】以29头滇东南水牛血样为材料,通过PCR扩增直接测序,测定了29条滇东南水牛个体的线粒体DNA D-loop(mtDNAD-loop)全序列,并引用GenBank公布的埃及、印度、地中海、巴西及中国水牛mtDNA D-loop序列,构建各单倍型间的聚类树。【结果】滇东南水牛mtDNA D-loop全序列长度为910～917bp,结合GenBank中公布的5条来自云南省马关县的滇东南水牛序列,界定滇东南水牛mtDNA D-loop有单倍型20种,单倍型多态度、核苷酸多态度和核苷酸差异数分别为0.877±0.053,0.011±0.005和9.865±21.419,错配分布分析表明,滇东南水牛保持着较为平稳的群体水平,揭示滇东南水牛现生群体的遗传多样性较为丰富。聚类结果显示,滇东南水牛所有个体都聚在沼泽型水牛支系,与印度、埃及、地中海等江河型水牛支系截然分列于2大独立的支系;滇东南水牛又分为支系A(SW-A)和支系B(SW-B),与其他中国水牛品种的表现一致。【结论】滇东南水牛群体规模平稳,且群体未曾受到印度水牛基因的渐渗,完全属于沼泽型水牛,支持滇东南水牛起源于中国或东南亚的假说。     

黄牛、牦牛和水牛MyoG基因单核苷酸多态性分析

采用PCR-SSCP结合DNA直接测序技术,分析黄牛(鲁西牛、渤海黑牛)、牦牛和水牛肌细胞生成素基因(MyoG)外显子1和5′侧翼部分序列的DNA多态性,旨在揭示中国3个主要家养牛种的群体遗传变异并为开展分子育种提供试验依据。结果表明,鲁西牛和水牛群体存在SSCP多态性。序列分析结果显示,渤海黑牛和牦牛MyoG外显子1和5′侧翼部分序列与GenBank相应序列完全一致。鲁西牛在外显子1发生g.48 G→C颠换,由此形成GG、GC和CC 3种基因型,G、C等位基因频率分别为0.743 7、0.266 4;水牛分化明显,发生6处突变,位于g.-5 A→T颠换导致形成AA和AT 2种基因型,A、T等位基因的频率分别为0.825 0、0.175 0;另外5处突变发生在外显子1序列中,其中g.210 T→C颠换是水牛特异性的限制性酶切位点。所有突变均发生在三联体密码子的第3位,且均为同义替代。编码氨基酸在4个牛群体间完全一致。推测鲁西牛MyoG基因外显子1的g.48 G→C突变可能是一个与生长发育性状存在一定相关性的潜在SNP位点。     

中国3个牛种cyt b基因多态性及其系统发育研究

基于mtDNA cyt b基因全长序列,对中国黄牛、牦牛和水牛的遗传多态性和系统发育关系进行了分析。结果表明,中国黄牛、牦牛和水牛cyt b基因序列中碱基A和T的含量均比较高,A+T的平均含量分别为56.6%,58.2%和56.0%。黄牛在cyt b基因全长序列具有较丰富的核苷酸多样性(Pi=0.016 84),水牛的核苷酸多样性相对贫乏(Pi=0.003 51),牦牛的核苷酸多样性介于二者之间(Pi=0.012 28)。中国黄牛与牦牛和欧洲野牛之间的亲缘关系相对较近,而与水牛间的亲缘关系则相对较远,黄牛有普通牛和瘤牛2个母系起源;中国牦牛和斑腾牛以及羯牛的亲缘关系相对较近;中国水牛和沼泽型水牛具有较近的亲缘关系,也可能有2个或者2个以上的母系起源。