大肠杆菌对奶牛子宫内膜上皮细胞NF-κB信号通路的影响

本试验旨在探究大肠杆菌对奶牛子宫内膜上皮细胞NF-κB信号通路的影响。选取10~6CFU/mL大肠杆菌处理奶牛子宫内膜上皮细胞,检测NF-κB通路关键蛋白表达的变化。结果发现,大肠杆菌(10~6CFU/mL)刺激一定时间可显著提高p-P65蛋白和p-IκB-α蛋白表达量,促进NF-κB信号通路的激活,引起奶牛子宫内膜炎性反应或免疫应答。     

家蚕核苷二磷酸激酶基因的克隆和原核表达

核苷二磷酸激酶(NDPK)基因在进化中高度保守,却又呈现复杂多样的生物学功能。该酶除了催化腺苷三磷酸(ATP)和核苷二磷酸(NDP)之间高能磷酸基团的转移外,还具有NDP激酶活性和蛋白磷酸转移酶活性,并参与转录调控和信号转导。从家蚕蛹cDNA文库中获得家蚕核苷二磷酸激酶的cDNA序列,该cDNA序列长575bp,含465 bp的开放阅读框序列,编码154个氨基酸残基的核苷二磷酸激酶。将克隆的家蚕核苷二磷酸激酶基因插入pET-28 a构建重组质粒,转化大肠杆菌后诱导表达重组蛋白,经镍离子亲和层析柱纯化得到重组家蚕核苷二磷酸激酶。     

抗菌肽BSN-37对大肠杆菌胞内物质泄露的影响

为了解抗菌肽BSN-37对大肠杆菌的作用机制,通过β-半乳糖苷酶试验测定了抗菌肽BSN-37对大肠杆菌CVCC1568的抑菌活性,以菌落计数法测定了抗菌肽BSN-37对大肠杆菌CVCC1568的抑菌动力学,用分光光度法测定了抗菌肽BSN-37对大肠杆菌CVCC1568细胞壁通透性,以及胞内紫外吸收物质、蛋白及核酸的泄露量。结果表明,抗菌肽BSN-37能有效抑制大肠杆菌CVCC1568的生长繁殖,随抗菌肽浓度增加,抑制活性越高,抗菌肽BSN-37作用后的大肠杆菌CVCC1568细胞壁通透性增加,胞内紫外吸收物质、蛋白和核酸的泄露量随时间延长而逐渐增加。说明抗菌肽BSN-37能破坏大肠杆菌CVCC1568的细胞壁和细胞膜,从而表现较好的抑菌活性。     

GST-P58IPK融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定

以RT-PCR方法扩增目的基因P58IPK,将其克隆至原核表达质粒pGEX-6p-1.将所构建的pGEX-6p-1-P58IPK重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)并诱导表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE、Western-blot及体外活性鉴定.结果显示,大肠杆菌细胞经诱导表达出相对分子质量约为85 000的蛋白,与GST-P58IPK融合蛋白大小相符;Western-blot显示该融合蛋白能够被抗GST的抗体特异性识别,磷酸化试验表明GST-P58IPK融合蛋白能够抑制PKR的体外磷酸化.结果表明,在大肠杆菌表迭系统中表达了有活性的GST-P58IPK融合蛋白,为PKR信号通路的研究奠定了基础.     

家蚕核型多角体病毒对寄主细胞凋亡抑制蛋白BmAPI5表达的影响

API5是一种新的细胞凋亡抑制蛋白因子,能有效抑制细胞凋亡。API5在结构与功能上高度保守,并已在包括家蚕在内的多种昆虫中发现存在同源基因。本文检测了家蚕幼虫BmAPI5基因在BmNPV和大肠杆菌侵染后的转录与表达变化。结果表明,微生物侵染能快速显著诱导BmAPI5基因的转录与表达,其中以BmNPV的诱导作用较为明显。这表明BmAPI5可能参与BmNPV-宿主的互作机制。     

旋毛虫果糖-1,6-二磷酸酶基因的克隆表达及生物学特性分析

根据Gen Bank公布的旋毛虫果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)基因序列,设计1对特异性引物,以旋毛虫总RNA为模板,用RT-PCR技术扩增出1条约为1 kb的DNA片段。测序结果表明该片段包含FBP的完整ORF,长1 026 bp,编码341个氨基酸。BLAST分析发现其核酸和氨基酸序列与已知旋毛虫FBP的基因和氨基酸序列的相似性分别为99%和100%。将该ORF亚克隆到p ET-32a(+)载体中,酶切鉴定正确后转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,结果表明该融合蛋白大小为55.4 ku,重组蛋白主要以包涵体的形式表达。Western blot结果显示该重组蛋白能被旋毛虫感染小鼠血清识别。对纯化、复性的重组蛋白进行了酶活性测定,结果发现该重组酶的最适p H为7.0,最适温度为37℃。     

出血性大肠杆菌O157 Eae-Stx1/2B融合蛋白的免疫学特性

为了研究重构融合蛋白Eae-Stx1/2B免疫特性及对出血性大肠杆菌感染的免疫保护作用,进行了细胞粘附抑制试验和免疫保护试验。结果证明Eae-Stx1/2B融合蛋白免疫血清在体外能降低出血性大肠杆菌对HEp-2细胞的粘附作用,这一特性在出血性大肠杆菌疫苗设计中具有重要价值。以纯化的融合蛋白Eae-Stx1/2B为抗原对小鼠进行腹腔注射免疫和滴鼻免疫,ELISA检测结果显示,2次免疫后7 d,免疫组抗Eae-Stx1/2B融合蛋白和抗出血性大肠杆菌O157血清IgG抗体显著高于未免疫组;用出血性大肠杆菌O157强毒株EDL933攻击免疫小鼠,免疫组小鼠排菌时间显著缩短,免疫组小鼠存活率均高于未免疫组,免疫组小鼠体质量恢复增长较快。上述试验结果表明,Eae-Stx1/2B融合蛋白对出血性大肠杆菌感染有保护作用。     

磷脂酰肌醇信号通路对动物采食的调节及作用机制

磷脂酰肌醇信号通路是指胞外信号通过膜受体与其相应的第一信使分子结合后,激活膜上的Gq蛋白(一种G蛋白),激活质膜上的磷脂酶C(PLC),PLC水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸生成的三磷酸肌醇和二酰甘油2个第二信使的过程。磷脂酰肌醇信号通路对动物采食的作用则主要通过各种营养素刺激Gq蛋白偶联受体激活整个通路完成。本文综述了磷脂酰肌醇信号通路结构、对动物采食调节的影响及作用机制等,以期为相关研究提供参考。     

鸡β-防御素在大肠杆菌中的高效表达及复性

鸡β-防御素(gallinacin-3,Gal3)是鸡体内重要的防御因子,本试验研究了鸡Gal3融合蛋白在大肠杆菌中高效表达的规律,并探索了重组蛋白质的复性工艺.结果表明,加入诱导剂后1h,开始有可检出量的重组蛋白质表达,2h的表达水平已接近最大量;化学诱导剂IPTG 0.2～1.2mol/L对重组蛋白的产量没有明显影响.经Lablmage软件分析,融合蛋白的产量可达菌体总蛋白的35%以上,且主要以包涵体形式存在.将所获包涵体用8mol/L尿素溶解后,分步稀释于含有氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽的复性系统中,重组蛋白得到完全复性.12mg/L复性的重组鸡Gal3能抑制肠炎沙门氏菌的生长,24mg/L能抑制肠致病型大肠杆菌的生长.     

Toll样受体信号转导的负调控机制研究进展

Toll样受体(TLRs)为模式识别受体的一员,是介导天然免疫及病原体信号转导与细胞活化信号转导的重要跨膜信号传递受体。研究发现许多负向调节蛋白通过靶向TLRs信号通路的关键信号分子,干扰信号转导途径中连接复合体形成、泛素化降解信号通路中接头蛋白、转录调控等不同方式负向调控TLRs信号通路,及时抑制TLRs信号,维持机体的免疫平衡。论文就TLRs信号转导途径及其负调控机制进行了综述。     

cGAS-STING信号通路在先天性免疫中的作用研究进展

先天性免疫是动物抵抗外界病原微生物入侵的第一道防线.当病原微生物入侵时,机体可通过模式识别受体识别病原体相关分子模式,启动抵抗外源微生物感染的免疫反应.环磷酸鸟苷-腺苷合成酶(cGAS)是一种DNA感受器,可感知外源DNA并激活cGAS-STING信号通路.而cGAS-STING信号通路的激活可诱导产生干扰素,这是先天...     

大肠杆菌性乳房炎奶牛血浆的比较蛋白质组研究

大肠杆菌是奶牛乳房炎的主要病原微生物之一,为了分析大肠杆菌性乳房炎奶牛血浆蛋白的表达变化,探索其防御机制。通过乳汁微生物培养的方法选择仅由大肠杆菌自然感染的隐性乳房炎奶牛。采用二维凝胶电泳技术分离大肠杆菌性乳房炎奶牛和临床健康奶牛的血浆蛋白和ProteoMiner试剂盒富集的中低丰度蛋白,凝胶用考马斯亮蓝G-250染色后,用图像分析软件检测血浆表达的差异蛋白点并用液质联用质谱鉴定。结果发现,大肠杆菌性乳房炎奶牛血浆中有19个蛋白点的表达量发生改变,其中15个蛋白点鉴定为7种蛋白质。在大肠杆菌性乳房炎奶牛血浆中结合珠蛋白、α1酸性糖蛋白和血清淀粉样蛋白A等蛋白的表达量增加。并用ELISA法测定血浆结合珠蛋白的结果也发现,大肠杆菌性乳房炎奶牛血浆结合珠蛋白水平显著高于健康牛(P0.01)。表明大肠杆菌感染造成了奶牛血浆蛋白的表达发生了变化,对这些表达变化蛋白的解析有利于探索机体的防御机制,同时为疾病的诊断和治疗提供科学依据。     

mTOR信号通路及其抑制剂的研究进展

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR) 是进化上十分保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,mTOR信号通路异常与肿瘤及神经退行性疾病密切相关,成为相关疾病治疗的靶点。除雷帕霉素及同系物外,姜黄素等抑制mTOR信号通路的中药单体物质不断被发现。作者对mTOR蛋白的结构、功能和mTOR信号通路及其抑制剂进行了综述。     

功能菌株及其复合菌剂发酵配合饲料的研究

发酵饲料富含有益微生物、消化酶及功能物质，已广泛应用于畜牧行业，应用效果良好。微生物种类及功能是影响微生物发酵饲料发酵效果的关键因素之一。为研究不同功能菌株在发酵过程中的作用，以pH、酸溶蛋白含量、抗原蛋白和抑菌活性为指标，对不同菌株及其复合菌剂固态发酵鸡配合饲料进行评价。结果表明：FM-20菌株产酸性物质能力较强，能显著降低饲料pH(P<0.05);FM-18菌株发酵产酸溶蛋白最快；JM-1菌株抑制大肠杆菌能力较强。经复配后，各菌株产生一定协同发酵作用，酸溶蛋白含量达到35.98%,β-伴大豆球蛋白降解明显，对大肠杆菌和沙门氏菌抑制活性显著（P<0.05），对大肠杆菌的抑菌面积达到1.18 cm2。试验为功能菌株及其复合菌剂在发酵配合饲料中的应用提供了相应的基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白的可溶性表达、纯化及鉴定

为获得可用于猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)抗体检测的重组抗原Cap蛋白,根据GenBank中发表的PCV2 ORF2序列设计物,以PCV2 JS株基因组为模板,PCR扩增出无核定位信号(nuclear localization signal,NLS)的ORF2基因片段,插入质粒pET-30a(+)构建重组表达质粒pET-ORF2ΔNLS,IPTG可诱导该重组菌表达约27 ku大小的重组蛋白。进一步分析发现该蛋白在大肠杆菌中主要以可溶性形式存在;镍柱亲和层析法纯化该蛋白,用PCV2阳性血清进行免疫印迹试验,结果发现纯化的重组蛋白能与PCV2抗体发生特异性反应,表明该纯化的蛋白具有很好的免疫反应原性,可用于临床样本中PCV2抗体的检测。     

镰形扇头蜱巨噬细胞移动抑制因子的克隆、表达及酶活性分析

为了探究镰形扇头蜱巨噬细胞移动抑制因子(Rhipicephalus haemaphysaloides macrophage migration inhibitory factor, RhMIF)基因的功能，试验采用RT-PCR方法对RhMIF基因开放阅读框进行扩增，运用大肠杆菌表达体系对RhMIF蛋白进行体外重组表达，随后对纯化后的RhMIF重组蛋白进行互变异构酶活性分析。结果表明：RhMIF基因开放阅读框大小为351 bp,编码116个氨基酸；RhMIF重组蛋白在大肠杆菌上清液中成功表达，大小为17.4 ku; RhMIF重组蛋白具有互变异构酶活性。说明本试验通过大肠杆菌表达体系成功表达了具有酶活性的RhMIF重组蛋白。     

中草药抑制耐药性大肠杆菌的研究进展

中草药能抑制大肠杆菌耐药并消除其耐药性,但其作用机制尚未完全明确,因此开展中药抑制和消除耐药性方面的研究及其作用机制的研究,并在此基础上探求安全、高效、经济的耐药性消除剂具有重要意义。作者就大肠杆菌耐药现状、中草药抑菌机理及抑制耐药性大肠杆菌进行了综述。     

2株乳酸菌对鸡源致病性大肠杆菌的体外抑制试验

对2株乳酸菌对鸡源致病性大肠杆菌的体外抑制进行了研究,结果表明,3种处理方法均能不同程度地抑制大肠杆菌的生长,但以先接种乳酸菌后接种大肠杆菌的效果较好。该结果为分离的2株乳酸菌在动物生产中的应用奠定了理论基础。     

猪STING多克隆抗体的制备及应用研究

干扰素基因刺激因子(STING)是天然免疫信号通路环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cGAS)-STING中重要的衔接蛋白,它能够识别细胞内第二信使环磷酸鸟苷-腺苷(c GAMP),激活I型干扰素(IFN-I)的表达。为了制备猪STING(pSTING)多克隆抗体(ppSTING)并对其初步应用,本研究利用PCR方法扩增pSTING基因构建重组表达质粒pGEX-6p1-pSTING,转化大肠杆菌BL21(DE3)并经IPTG诱导后经SDS-PAGE和western blot方法鉴定GSTpSTING蛋白(rpSTING)的表达;利用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析方法纯化rpSTING并免疫新西兰大白兔制备ppSTING,经Protein G亲和层析介质纯化后分别采用SDS-PAGE鉴定纯化的ppSTING。结果显示rpSTING以可溶形式表达,分子质量约为52.5 ku。SDS-PAGE结果显示,制备的ppSTING包含重、轻链且纯度较好。将ppSTING分别应用于western blot、间接免疫荧光试验(IFA)检测外源表达及CRL-2843细胞中内源表达的pSTING;将其应用于Co-IP试验检测ppSTING与外源表达pSTING的相互作用;将其应用于激光共聚焦试验检测cGAMP刺激后的PK-15细胞中内源表达的pSTING与AP-1在该细胞中的共定位;将其应用于western blot检测ASFV感染后PAMs中的pSTING蛋白。Western blot和IFA结果显示,制备的ppSTING能特异性地识别HEK293T细胞中过表达及CRL-2843细胞中内源表达的pSTING蛋白;Co-IP结果显示,ppSTING与pSTING蛋白存在相互作用;激光共聚焦试验结果显示,ppSTING可用于检测PK-15中内源表达的pSTING蛋白且在cGAMP刺激后的PK-15细胞中的pSTING能够与AP-1定位于高尔基体。Western blot结果显示,ppSTING能够与未感染ASFV的PAMs中内源表达的pSTING蛋白反应,且在ASFV感染PAMs 24 h后pSTING蛋白的表达量增加。上述结果表明,本研究制备了ppSTING并且证实其可以用于宿主天然免疫方面的应用研究。本研究为探究pSTING蛋白的生物学功能以及cGAS-STING信号通路奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒M基因及其片段原核表达效果分析

将猪流行性腹泻病毒的M基因及编码M蛋白膜外区M基因片段（M’）分别亚克隆到原核表达载体pJLA605和pGEX-6p-1中，构建了重组质粒pJLA605-M、pGEX-6p-M-GST、pGEX-6p-M和pGEX-6p-M’，转化大肠杆菌后。探索了M蛋白在N端和C端不带有谷胱苷肽巯基转移酶（GST）、N端和C端均带有GST、只在N端带有GST以及只含有M蛋白的膜外区M’蛋白的表达情况。SDS-PAGE分析结果表明，N端和C端带有GST的pGEX-6p-M-GST和只含有膜外区M’基因的重组质粒pGEX-6p-M’获得了高效表达，经Bandscan5．0软件分析，其表达产物分别以融合蛋白GST-M和GST-M’形式存在，表达量分别为20％和45％。在对重组质粒pJLA605-M转化的大肠杆菌诱导表达过程中发现菌体生长的抑制现象，说明M蛋白对宿主菌有一定的毒性，进一步提取包涵体进行SDS-PAGE发现M蛋白以包涵体的形式得以表达。猪流行性腹泻病毒M蛋白的毒性作用可能与M蛋白具有的出芽功能有关，因而表现出对大肠杆菌的细胞壁的破坏作用。